Un flusso di lavoro metaproteomica Aquatic microbica: dalle celle ai Trittico Peptidi per l'analisi basata su spettrometria di massa tandem
15 settembre 2015
Questo protocollo è per l'estrazione e la concentrazione di proteine e DNA da biomassa microbica raccolta dall'acqua di mare, seguita dalla generazione di peptidi triptici adatti per l'analisi proteomica basata sulla spettrometria di massa tandem.
Lo scopo di questa procedura è l'estrazione di proteine e DNA dalla biomassa microbica presente nell'acqua di mare, seguita dalla generazione di peptidi triptici per l'analisi proteomica basata su spettrometria di massa in tandem. Questo viene ottenuto innanzitutto lisando le cellule precedentemente accumulate su un filtro a cartuccia. Il secondo passaggio consiste nel concentrare il lisato cellulare utilizzando unità filtranti ad ultra centrifugazione.
Successivamente, il lisato viene separato in due frazioni, una per la precipitazione delle proteine e una per la precipitazione del DNA. L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire la digestione intragel con tripsina delle proteine ed estrarre i peptidi adatti all'analisi mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa in tandem. Infine, un'analisi bioinformatica successiva può essere utilizzata per identificare le proteine espresse nel campione, mentre il DNA isolato può essere utilizzato per analisi metagenomiche e/o del gene 16 S-R-R-N-A.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che sia le proteine che il DNA possono essere isolati contemporaneamente dallo stesso campione. Per iniziare, espellere la soluzione di stabilizzazione dell'RNA dall'unità filtrante a cartuccia in una provetta microcentrifuga da due millilitri, utilizzando una siringa da 60 millilitri collegata all'estremità con attacco a baionetta del filtro centrifugo, e centrifugare la provetta microcentrifuga da due millilitri per 10 minuti a 17.000 × g per formare un pellet di eventuali detriti cellulari al termine della centrifugazione. Trasferire il sopranatante in un'unità filtrante ultracentrifuga da 10 K per catturare eventuali proteine provenienti da cellule che si sono lisate dal campione.
Non scartare il pellet. Eseguire la centrifugazione dell'unità filtrante ultracentrifuga a 3.270 ×g per 30 minuti o fino a quando il volume si sarà ridotto a circa 600 microlitri. Nel frattempo, sciogliere la punta di una pipetta P10 e bloccare il lato del filtro a cartuccia senza bloccaggio a vite con l'estremità aperta della punta.
Questo garantirà che nessun tampone di estrazione né biomassa fuoriescano durante i passaggi successivi. Sospendere il pellet in un millilitro di soluzione di estrazione SDS e pipettarlo nell'unità originale del filtro a cartuccia. Il modo più semplice per pipettare nell'unità del filtro a cartuccia è impilare una punta P200 su una punta P1000 e utilizzare questa doppia punta per la pipettazione. Aggiungere un ulteriore millilitro di soluzione di estrazione SDS all'unità del filtro a cartuccia in modo che il volume totale sia di circa due millilitri.
Parafilm. Chiudere l'estremità con blocco adesivo dell'unità filtro a cartuccia e inserire l'unità filtro a cartuccia in un tubo da 50 millilitri. Successivamente, posizionare tre salviette da laboratorio accartocciate sul fondo di un tubo conico da 50 millilitri.
Chiudere il coperchio e inserire il tubo nel fornetto di ibridazione per un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente con rotazione. Dopo 10 minuti, posizionare il filtro su un galleggiante di poliuretano e fissarlo in sede utilizzando una siringa da cinque millilitri applicata all'estremità con blocco a baionetta; caricare e incubare in un bagno termico a 95 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, lasciare raffreddare l'unità di filtrazione a cartuccia e farla ruotare a temperatura ambiente per un'ora. Una volta raffreddata, espellere la soluzione di estrazione SDS (lisato cellulare) dal filtro mediante una siringa da 60 millilitri nello stesso dispositivo di filtrazione ultracentrifugo.
Come in precedenza, aggiungere un millilitro di soluzione fresca di estrazione SDS all'unità del filtro a cartuccia e mescolare manualmente per 30 secondi. Quindi espellere il contenuto del filtro nell'unità di filtrazione ultracentrifuga utilizzando la siringa da 60 millilitri per risciacquare ed assicurarsi che tutte le proteine siano state rimosse e raccolte. Eseguire la centrifugazione sull'unità di filtrazione ultracentrifuga per 45 minuti a 3.270 ×g, oppure fino a quando il volume nell'unità del filtro risulti inferiore a 600 microlitri.
Scartare il flusso iniziale e aggiungere alla provetta del filtro ultracentrifugo una quantità fresca di soluzione estrattiva SDS. Centrifugare nuovamente la provetta per altri 45 minuti a 3.270 ×g, quindi ripetere questo passaggio altre due volte. Assicurarsi che il volume finale all'interno della provetta del filtro ultracentrifugo sia al massimo di 600 microlitri al termine dell'ultima centrifugazione.
A questo punto, misurare il volume del concentrato e dividerlo in due parti. Una frazione verrà utilizzata per la precipitazione del DNA e l'altra per la precipitazione delle proteine. Per la precipitazione delle proteine, aggiungere quattro volumi di metanolo e acetone in rapporto 50 a 50 a un volume di concentrato e vortexare per 10 secondi, quindi incubare tutta la notte a meno 20 gradi Celsius.
Il giorno successivo, centrifugare la miscela a 17.000 ×g per 30 minuti; dopo aver travasato il soprannatante, lasciare asciugare il pellet in un evaporatore sotto vuoto per un'ora. Non asciugare eccessivamente il pellet, poiché ciò potrebbe rendere difficile la risospensione.
Sospendere il pellet in 25 microlitri di soluzione estrattiva SDS. Lasciare in posa per un'ora, quindi risospendere aspirando e dispensando con una pipetta. Eseguire l'elettroforesi SDS-PAGE sulle proteine come descritto nel protocollo testuale, lavorando all'interno di una cappa a sicurezza biologica per minimizzare la contaminazione; tagliare la parte eccedente del gel al di sotto del segno del marcatore di 10 chilodalton per ogni corsia.
Ogni traccia verrà analizzata mediante spettrometro di massa in tandem. Tagliare separatamente ogni traccia in quadratini di un millimetro per un millimetro per aumentare la superficie disponibile e inserire tutti i quadratini della traccia in una provetta microcentrifuga a basso legame. Ripetere per tutte le tracce; può essere utilizzato acido acetico all'1% per evitare che il gel si secchi e diventi difficile da tagliare.
Procedere con la digestione in gel con tripsina ed estrazione dei peptidi come descritto nel protocollo testuale oppure con la precipitazione del DNA aggiungendo soluzione di estrazione SDS fino a raggiungere il volume di 500 microlitri nella frazione concentrata da utilizzare per la precipitazione del DNA. Questo passaggio ha semplicemente lo scopo di aumentare il volume della soluzione, rendendola più facile da manipolare. Successivamente, aggiungere 0,583 volumi di un reagente di precipitazione delle proteine, come ad esempio il reagente MPC per la precipitazione delle proteine, ed eseguire un vortex.
Per 10 secondi, centrifugare a 17.000 ×g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti una forma bianca di precipitato. Dopo la centrifugazione, trasferire il soprannatante in un altro tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere 0,95 volumi di isopropanolo, invertendo la provetta da 30 a 40 volte prima di centrifugare per 10 minuti a quattro gradi Celsius alla velocità massima; quindi, decantare con attenzione e scartare il soprannatante. Successivamente, lavare il pellet due volte con 750 microlitri di etanolo al 70%.
Rimuovere il più etanolo possibile mediante pipettaggio, quindi lasciare asciugare il pellet all'aria. Non eccessivamente disidratare il DNA, poiché ciò potrebbe renderne difficile la risospensione una volta secco. Risospendere il pellet in 25 microlitri di tampone low TE a pH 8.
Quantificare il DNA utilizzando un kit per saggio di DNA a doppio filamento e seguendo le istruzioni del produttore. Eseguire inoltre elettroforesi su gel di agarosio su tre microlitri di DNA per verificarne la qualità. I peptidi sono stati sottoposti ad analisi mediante spettrometria tandem a partire dai peptidi. Sono stati generati oltre 23.000 spettri per campione, a partire dai quali sono stati identificati peptidi e proteine.
La composizione tassonomica e funzionale delle meta-proteomi è stata analizzata utilizzando una combinazione di blast P e l'analizzatore di metagenoma. Il pacchetto software ha assegnato le proteine principalmente ad alfa-proteobatteri, che erano le più rappresentate nel set di dati. La stragrande maggioranza di queste è stata assegnata al clade SAR R 11.
Il clade Roter delle Alphaproteobatterie è stato inoltre ampiamente rappresentato e identificato, più frequentemente nelle acque di superficie. Le proteine assegnate alle malattie batteriche erano distribuite in modo uniforme tra la superficie e il massimo di clorofilla, mentre le proteine dei batteri flagellati sono state identificate in misura maggiore al massimo di clorofilla.
Le proteine delle gamma proteobatterie erano distribuite uniformemente in tutta la colonna d'acqua, mentre le proteine delle beta proteobatterie si trovavano principalmente in superficie. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni se effettuata correttamente.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'estrazione e la concentrazione di proteine e DNA dalla biomassa microbica raccolta dall'acqua di mare. Include la generazione di peptidi triptici adatti all'analisi proteomica basata sulla spettrometria di massa in tandem.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ecologia microbica
- Proteomica
- Metagenomica
Sfondo
- La biomassa microbica proveniente dall'acqua di mare è una fonte preziosa per lo studio degli ecosistemi marini.
- L'analisi proteomica aiuta a comprendere l'espressione proteica nelle comunità microbiche.
- L'estrazione del DNA consente studi metagenomici e l'identificazione di specie microbiche.
- La spettrometria di massa in tandem è uno strumento potente per analizzare miscele proteiche complesse.
Scopo dello studio
- Estrarre proteine e DNA da campioni microbici di acqua di mare.
- Preparare peptidi tripsici per l'analisi mediante spettrometria di massa.
- Facilitare l'analisi bioinformatica per l'identificazione delle proteine.
Metodi Utilizzati
- Lisi delle cellule accumulate su un filtro a cartuccia.
- Concentrazione del lisato cellulare mediante unità filtranti ad ultracentrifuga.
- Separazione del lisato in frazioni per la precipitazione di proteine e DNA.
- Digestione con tripsina in gel per l'estrazione di peptidi.
Risultati principali
- Estrazione con successo di proteine e DNA dalla biomassa microbica.
- Generazione di peptidi tripsici adatti all'analisi mediante LC-MS/MS.
- Identificazione delle proteine espresse attraverso analisi bioinformatica.
- Isolamento del DNA per analisi metagenomica e del gene dell'rRNA 16S.
Conclusioni
- Il protocollo consente un'analisi completa delle comunità microbiche nell'acqua di mare.
- Fornisce un quadro di riferimento per futuri studi sull'ecologia microbica marina.
- L'integrazione di dati proteomici e genomici migliora la comprensione delle funzioni microbiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo flusso di lavoro consente l'estrazione simultanea di proteine e DNA da comunità microbiche complesse, supportando approcci omici integrati per la riduzione del rischio sui bersagli nella fase iniziale della scoperta. Generando peptidi tripsici adatti alla spettrometria di massa in tandem, fornisce dati proteomici quantitativi che possono contribuire alla comprensione meccanicistica del metabolismo microbico e delle interazioni ospite-microbo rilevanti per la validazione di bersagli terapeutici. Il metodo supporta una previsione affidabile nella selezione dei bersagli, collegando i profili proteici espressi ai dati di genomica funzionale ottenuti dallo stesso campione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei percorsi metabolici espressi nelle comunità microbiche, supportando l'identificazione mirata di bersagli e la validazione funzionale.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro standardizzato per l'isolamento di materiale proteomico e genomico dalla stessa biomassa, riducendo la variabilità del campione e migliorando la concordanza dei dati.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera miscele peptidiche adatte all'analisi mediante LC-MS/MS, consentendo l'identificazione e la quantificazione di proteine con elevata affidabilità per la scoperta di biomarcatori.
- Valore operativo: Produce estratti peptidici riproducibili compatibili con piattaforme di spettrometria di massa successive, favorendo la standardizzazione dei saggi tra diversi laboratori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Favorisce la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica collegando le firme metaproteomiche al contesto metagenomico, supportando la riduzione del rischio meccanicistica di interventi mirati al microbioma.
- Valore operativo: Consente l'analisi parallela delle funzioni microbiche rilevanti per l'ospite e del potenziale genetico, orientando strategie traslazionali per biomarcatori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta precoce, supportando la verifica di ipotesi in sistemi microbici e consentendo l'integrazione dei dati per l'identificazione di candidati promettenti in ambiti terapeutici che modulano il microbioma.
- Biologia della scoperta: Supporta la validazione funzionale del target identificando le proteine espresse e le loro origini tassonomiche, chiarendo i percorsi metabolici rilevanti per l'interazione con l'ospite.
- Screening: Genera estratti peptidici standardizzati adatti a un profiling riproducibile basato sulla spettrometria di massa, consentendo analisi comparative tra diverse condizioni o trattamenti.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative di peptidi e proteine che supportano il confronto statistico e l'integrazione dei dati con set di dati metagenomici.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati proteomici al contesto genomico dello stesso campione, supportando l'allineamento dei biomarcatori e la chiarificazione del meccanismo d'azione.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per il campionamento multi-omico da ambienti complessi, riducendo le elaborazioni ridondanti dei campioni e migliorando la coerenza tra progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi fornendo evidenze dirette delle proteine espresse e del loro contesto funzionale.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità grazie a passaggi standardizzati di lisi, concentrazione e frazionamento compatibili con processi ad alto rendimento.
- Valore strategico: Supporta decisioni informate di prosecuzione/cessazione riducendo l'ambiguità biologica nella selezione degli obiettivi mediante la concordanza multi-omica.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio di bersagli associati al microbioma integrando dati proteomici funzionali con il potenziale genomico.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di campioni microbici, nella precipitazione delle proteine e nelle tecniche di digestione in gel.
- Presuppone l'accesso a unità filtranti per ultracentrifuga, strumentazione per spettrometria di massa e pipeline bioinformatiche per l'analisi metaproteomica.
- Necessita di protocolli standardizzati per la conservazione e la lisi dei campioni al fine di garantire la riproducibilità tra diversi siti e tipi di campione.
- Richiede considerazioni adattative per diverse fonti di biomassa microbica e condizioni di conservazione.
- È limitato dall'efficienza del recupero proteico da matrici ambientali complesse e dall'eventuale interferenza di contaminanti nei campioni di acqua di mare.
