Name: Un flusso di lavoro metaproteomica Aquatic microbica: dalle celle ai Trittico Peptidi per lanalisi basata su spettrometria di massa tandem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Scopri un flusso di lavoro metaproteomico per estrarre proteine e DNA da campioni di acqua marina, generare peptidi triptici e analizzarli mediante spettrometria di massa tandem. Questo metodo consente studi completi sulla comunità microbica marina.

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Gli autori desiderano ringraziare Marcos Di Falco per la sua esperienza e consulenza nella preparazione dei campioni per la nano-LC MS/MS, così come il Dr. Zoran Minic dell'Università di Regina per l'analisi LC MS/MS. Questo lavoro è stato sostenuto dai finanziamenti NSERC (DG402214-2011) e CRC (950-221184). D.C. è stata supportata dal Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems e da FQRNT.

1. Preparare Reagenti <ol><li> Preparare la soluzione SDS-estrazione: 0.1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% glicerolo, EDTA 10 mM e 1% SDS. Filtro-sterilizzare utilizzando un filtro e conservare 0,22 micron a 4 ° C. </li><li> Preparare i reagenti azionari necessari per il gel di poliacrilammide. <ol><li> Preparare 1.5 M Tris-HCl pH 8.8. Filtro-sterilizzare con un filtro di 0,22 micron e conservare a temperatura ambiente. </li><li> 0.5 M Tris-HCl pH 6.8. Filtro-sterilizzare con un filtro di 0,22 micron e conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 10% SDS. Filtro sterilizzare usando un filtro di 0,22 micron e conservare a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparare soluzioni necessarie per in-gel tripsina digerire ed estrazione del peptide. <ol><li> Preparare 100 mM di bicarbonato di ammonio. Filtro-sterilizzare utilizzando un filtro e conservare 0,22 micron a 4 ° C. </li><li> Preparare 1 scorte M DTT. Sospeso in 100 mM di bicarbonato di ammonio e conservare a -80 ° C. </li><li> Preparare 550 mm scorte iodoacetamide. Sospeso in100 MM bicarbonato di ammonio e conservare a -80 ° C. </li><li> Preparare 100 ng / ml scorte tripsina. Aliquota 60 ml in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -80 ° C. </li><li> Preparare la soluzione di estrazione: 1% acido formico, 2% acetonitrile. </li><li> Preparare la soluzione risospensione: 5% di acetonitrile e 0,1% di acido formico. </li></ol></li></ol> 2. Eseguire cellulare Lysis in Unità Filtro a cartuccia con celle conservati in RNA Stabilizzazione Solution <ol><li> Espellere la soluzione di stabilizzazione RNA dall&#39;unità filtro a cartuccia (1,5 ml) e in una provetta 2 ml con una siringa da 60 ml attaccata all&#39;estremità luer-lock del filtro. </li><li> Centrifugare la provetta 2 ml per 10 minuti a 17.000 xg per far sedimentare i detriti cellulari. Questo viene fatto in modo che il filtro a passaggio 2.3 non ostruisce. </li><li> Trasferire il surnatante in un gruppo filtrante ultracentrifugo 10 K acquisire qualsiasi proteine ​​provenienti da cellule che sono lisate dal congelamento / thaw del campione. Non gettare il pellet. Sarà utilizzato nel passo 2.5. Eseguire centrifugazione dell&#39;unità filtro ultracentrifugo a 3.270 xg per 30 minuti o fino a quando il volume è ridotto a circa 600 ml. </li><li> Sciogliere la punta di una punta di p10 e bloccare il lato non luer-lock dell&#39;unità filtro cartuccia con l&#39;estremità aperta della punta. Questo farà sì che nessun tampone di estrazione e biomassa scappa durante le fasi di 2,5-2,7. </li><li> Sospendere il pellet in 1 ml di soluzione di SDS-estrazione e pipettare nella dell&#39;unità filtro cartuccia originale. Il modo più semplice per pipetta all&#39;interno dell&#39;unità filtro a cartuccia è di impilare una punta p200 su una punta p1000 e utilizzare questa doppia punta per il pipettaggio. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione di estrazione SDS all&#39;unità filtro a cartuccia in modo che il volume totale è di circa 2 ml e incubare per 10 min a temperatura ambiente durante la rotazione in un fornetto. Inserire 3 laboratorio accartocciato asciuga in fondo a un tubo 50 ml. Parafilm entrambe le estremità dell&#39;unità filtro a cartuccia chiusae mettere l&#39;unità filtrante a cartuccia nel tubo 50 ml. Chiudere il coperchio e mettere il tubo nel forno di ibridazione. </li><li> Dopo 10 min posto il filtro Sterivex su un galleggiante schiuma e fissarlo in posizione con una siringa da 5 ml all&#39;estremità luer-lock. Float e incubare in un 95 ° C bagnomaria per 15 min. </li><li> Sia l&#39;unità filtrante a cartuccia fresco e ruotare a temperatura ambiente per 1 ora (come al punto 2.6). </li><li> Espellere l&#39;SDS lisato soluzione di estrazione / cellule dal filtro con una siringa da 60 ml nella stessa unità filtro ultracentrifugo come prima (passo 2.3). Aggiungere 1 ml di soluzione di estrazione fresca SDS all&#39;unità filtro a cartuccia e miscelare per 30 sec a mano, quindi espellere nell&#39;unità filtro ultracentrifugo utilizzando la siringa 60 ml. Questo per risciacquare l&#39;unità filtro cartuccia per assicurare tutte le proteine ​​sono state rimosse. </li><li> Eseguire centrifugazione sull&#39;unità filtrante ultracentrifugo per 45 min a 3270 xg o finché il volume nell&#39;unità filtro è inferiore a 600 microlitri. </li><li> Gettare flusso continuo e rabboccare l&#39;unità filtro ultracentrifugo con soluzione di SDS-estrattivo. </li><li> Centrifugare il filtro per altri 45 min a 3270 x g. </li><li> Ripetere i punti 2.11 e 2.12 altre due volte. Assicurarsi che il volume finale del gruppo filtro ultracentrifugo è al massimo 600 microlitri al termine della centrifuga finale. </li><li> A questo punto, dividere il concentrato in due. Una frazione sarà usato per la precipitazione del DNA e l&#39;altra per la precipitazione delle proteine. Nota: La quantità frazionamento dipende dalla quantità di biomassa che viene filtrato e gli usi previsti dei prodotti. Nel nostro caso, abbiamo diviso il concentrato con il 10% verso la precipitazione del DNA e il 90% verso la precipitazione delle proteine. </li></ol> 3. Proteine ​​Precipitazioni <ol><li> Aggiungere 4 volumi di metanolo: acetone (50:50) per un volume di concentrato e vortex per 10 sec. Incubare per una notte a -20 ° C. </li><li> Spin down a 17.000 xg per 30 min. Decantare il surnatantee lasciare che il pellet (può essere invisibile) a secco in un speedvac per 1 ora (o fino a secco). Nota: Non più di asciugare il pellet in quanto ciò potrebbe rendere difficile per sospendere di nuovo. </li><li> Sospendere il pellet in 25 ml di soluzione di SDS-estrazione. Lasciate riposare per un&#39;ora poi risospendere pipettando su e giù. </li><li> Quantificare proteina utilizzando un kit di analisi delle proteine ​​e le istruzioni del produttore. </li></ol> 4. DNA Precipitazioni <ol><li> Aggiungere la soluzione SDS-estrazione alla frazione concentrato da utilizzare per la precipitazione del DNA finché il segno 500 microlitri. Questo passo è semplicemente quello di aumentare il volume della soluzione, rendendo più facile lavorare con. </li><li> Aggiungere 0,583 volumi di un reagente precipitazione delle proteine ​​(come la proteina MPC reagente precipitazione) e vortex per 10 sec. Si dovrebbe vedere una forma precipitato bianco. Nota: Abbiamo usato anche fenolo: DNA metodi di estrazione del cloroformio, ma è più difficile a causa dei volumi bassi. Abbiamo ottenuto una migliore resa del DNA utilizzando ilMPC proteine ​​Precipitazioni reagente. </li><li> Centrifugare a 17.000 xg e 4 ° C per 10 min. </li><li> Trasferire il surnatante in un&#39;altra provetta da 1,5 ml microcentrifuga e aggiungere 0,95 volumi di isopropanolo. Invertire 30-40 volte. </li><li> Centrifugare per 10 minuti a 4 ° C alla velocità massima. </li><li> Decantare con cautela e scartare il surnatante. </li><li> Risciacquare due volte con 750 ml di etanolo al 70%. </li><li> Rimuovere il più etanolo possibile pipettando, quindi lasciare asciugare all&#39;aria. Nota: Non più di asciugare il DNA in quanto ciò potrebbe rendere difficile per sospendere di nuovo. </li><li> Risospendere in 25 pl di tampone TE bassa, pH 8 (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA). </li><li> Quantificare il DNA utilizzando un kit test dsDNA e le istruzioni del produttore. Eseguire gel di agarosio (1%) elettroforesi su 3 ml di DNA per verificare la qualità. </li></ol> 5. SDS-PAGE gel di proteine <ol><li> Preparare tampone campione (950 microlitri tampone campione Laemmli e 50 microlitri β-mercaptoetanolo). &lt;/ li&gt; <li> Aggiungere il volume corrispondente per 15 mg di proteine, o un massimo di 20 microlitri di volume uguale di tampone campione e bollire per 4 min. I campioni possono essere conservati a -80 ° C fino a SDS-PAGE può essere eseguita. </li><li> Preparare 10% acrilamide gel risolvere con un gel di acrilammide impilamento 5%. </li><li> Caricare il gel con campioni e 4 ml di una scala di proteine. Attivare il gel a costante 120 V fino a 250 kDa marcatore scala ha appena raggiunto il gel risolvere. </li><li> Colorare il gel con un Coomassie macchia base secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 6. In-gel tripsina Digest e Peptide Estrazione Nota: Tutti i passi da qui fino a 6.10 vengono eseguiti in una cappa di sicurezza biologica per minimizzare la contaminazione. <ol><li> Tagliare il gel in eccesso sotto la soglia dei 10 kDa scala per ogni corsia. Ogni corsia verrà analizzata sulla MS / MS separatamente. Tagliare ogni corsia in 1 mm x 1 mm quadrati per aumentare la superficie e mettere tutti squares dalla corsia in un tubo a bassa legame micro-centrifuga. Ripetere questa operazione per tutte le corsie. (1% di acido acetico può essere utilizzata per impedire il gel si secchi e diventando difficile da tagliare). Nota: Minimizzare la contaminazione è critico in questa fase, quindi affettare gel viene eseguita in una cappa di sicurezza biologica in SDS-PAGE gel stampo di vetro utilizzato per fare il gel. </li><li> De-macchia <ol><li> Pipettare 50 ml di 100 mM di bicarbonato di ammonio in ogni provetta bassa vincolante, vicino tappo e incubare a 37 ° C per 10 min. </li><li> Pipettare 50 ml di acetonitrile, vicino tappo e incubare a 37 ° C per 5 min. </li><li> Aspirare e scartare 150 ml. </li><li> Ripetere i punti 6.2.1 e 6.2.2. </li><li> Aspirare e scartare 95 microlitri. </li></ol></li><li> Disidratazione <ol><li> Dispensare 50 microlitri acetonitrile, vicino tappo ed attendere 5 min. Aspirare e scartare 45 microlitri e aspettare 10 min. </li></ol></li><li> Riduzione <ol><li> Pipettare 50 microlitri DTT (10 mM, diluito in 100 mM ammbicarbonato onium), vicino tappo e attendere 30 minuti a 37 ° C. </li></ol></li><li> Alchilazione <ol><li> Dispensare 50 microlitri iodoacetamide (55 mm, diluito in 100 mM di bicarbonato di ammonio), vicino tappo e attendere 20 minuti a 37 ° C. </li><li> Dispensare 100 ml di acetonitrile, vicino berretto e incubare per 5 minuti a 37 ° C. Aspirare e scartare 195 ml. </li></ol></li><li> lavaggio <ol><li> Dispensare bicarbonato di ammonio 50 microlitri, vicino berretto e incubare per 10 minuti a 37 ° C. </li><li> Pipettare 50 ml di acetonitrile, vicino tappo e incubare a 37 ° C per 5 min. Aspirare e scartare 120 ml. </li></ol></li><li> Disidratazione <ol><li> Dispensare 50 microlitri acetonitrile, vicino tappo ed attendere 5 min. Aspirare e scartare 45 microlitri. </li><li> Dispensare 50 ml di acetonitrile, attendere 5 min. </li><li> Aspirare e scartare il 75 microlitri e attendere 5 minuti. </li></ol></li><li> Digestione <ol><li> Dispensare 25-30 ml di 6 ng / mL tripsina (uino tutti i frammenti di gel sono coperti). Chiudere il tappo e attendere 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Incubare per una notte (minimo 4,5 ore) a 37 ° C. </li><li> Lasciate riposare a temperatura ambiente per 30 minuti. </li></ol></li><li> Estrazione e Peptide Transfer <ol><li> Dispensare 30 ml di soluzione di estrazione e coprire con il coperchio per 30 minuti in ghiaccio. </li><li> Aspirare 30 ml e dispensare il volume aspirato in un nuovo tubo a bassa legante marcato. </li><li> Dispensare 12 ml di soluzione di estrazione e 12 ml di acetonitrile nella provetta originale (con il gel). Chiudere il tappo e incubare per 30 minuti in ghiaccio. </li><li> Aspirare 15 ml e deposito nel nuovo tubo. </li><li> Ripetere i passaggi (6.9.3 e 6.9.4). </li></ol></li><li> Mettere nuovi tubi in un SpeedVac fino a secco. </li><li> Risospendere in 50 ml di soluzione di risospensione. Vortex sul medio per 10 minuti per risospendere. </li><li> Soluzione peptide pipetta in entrambi nano / fiale LC o piastre a 96 pozzetti adatti per nano / LCLavoro MS / MS. </li></ol>

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<li>Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -J., Weber, N., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+environmental+sequences+using+MEGAN4%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4.</a> Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).</li>
<li>Ea Ottesen,, Marin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metatranscriptomic+analysis+of+autonomously+collected+and+preserved+marine+bacterioplankton%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton.</a> The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Conservazione del campione è fondamentale per gli studi metaproteomic e lavoro precedente ha dimostrato che una soluzione di stabilizzazione RNA è un buffer di archiviazione utile per conservare le cellule prima dell&#39;estrazione delle proteine ​​28. Idealmente, i campioni dovrebbero essere conservati in situ di negare cambiamenti nell&#39;espressione delle proteine ​​durante la movimentazione 33,34. Infatti, in situ sono state sviluppate tecnologie di campionamento e di fissagg...

I microrganismi sono onnipresenti e svolgono ruoli essenziali nel cicli biogeochimici della Terra 1. Attualmente, ci sono numerosi approcci molecolari disponibili per caratterizzare la struttura comunità microbica e funzione. Più comune è l&#39;analisi del gene 16S rRNA sequenze PCR-amplificato dal DNA ambientale 2-4. Uno svantaggio di analisi del gene 16S rRNA è che fornisce solo informazioni sull&#39;identità filogenetica e struttura della comunità, con poche informazioni sulla funzione metabolica. Al contrario, approcci come metagenomica, metatranscriptomics e metaproteomica forniscono informazioni sulla struttura delle comunità e il metabolismo. Metagenomica o l&#39;analisi del contenuto gene di un assemblaggio di organismi, fornisce informazioni sulla struttura e potenzialità funzionali della comunità 5 - 8. Anche se potente, questo potenziale funzionale potrebbe non corrispondere al metabolicaattività degli organismi. Genotipo di un organismo è rappresentata dai suoi geni, ognuno dei quali può essere trascritto RNA e in seguito tradotti alla proteina, causando un fenotipo. Così, per aiutare nella comprensione della attività funzionale microbica in un ambiente, l&#39;analisi post-genomica deve essere eseguita 9. Metatranscriptomics, o l&#39;analisi dei trascritti di RNA è utile perché rivela quali geni sono trascritti in un determinato ambiente. Tuttavia, i livelli di mRNA non sempre corrispondono ai livelli di proteina corrispondente a causa di regolazione traduzionale, RNA emivita, e il fatto che più copie della proteina possono essere generati per ogni mRNA 10. Per questi motivi metaproteomica è ormai riconosciuta come un importante strumento per microbiologia ambientale. Metaproteomic comune analizza utilizzare un approccio di proteomica fucile da caccia dove la serie completa nei pressi di proteine ​​in un campione complesso sono purificati e analizzati allo stesso tempo, di solito attraverso itdigestione enzimatico in peptidi e analisi su uno spettrometro di massa. Spettrometria di massa tandem successivo (MS / MS) &quot;peptide fingerprinting&quot; è utilizzato per determinare la sequenza di peptidi e proteine ​​di origine potenziale da database di proteine ​​ricerca (per una rassegna vedi 11). Lavoro proteomica ha fatto molta strada negli ultimi 25 anni grazie all&#39;aumento di genomica disponibilità dei dati e l&#39;aumento della sensibilità e la precisione di spettrometri di massa che consentano l&#39;identificazione di proteine ​​ad alto rendimento e la quantificazione 11,12. Poiché le proteine ​​sono il prodotto finale di espressione genica, i dati metaproteomic può aiutare a determinare quali organismi sono attivi in ​​un determinato ambiente e quali proteine ​​stanno esprimendo. Questo è vantaggioso quando si cerca di determinare come un particolare insieme di variabili ambientali influenzerà il fenotipo di un organismo o di una comunità. All&#39;inizio, gli studi metaproteomic basate su MS MS / nell&#39;oceano sono stati usati per identificare le proteine ​​specifiche in miratalignaggi microbici, con il primo studio incentrato sulla luce guidato protonica pompa proteorodopsina in SAR11 batteri marini 13. Più di recente, le analisi comparative metaproteomic hanno chiarito pattern di espressione proteica differenziali tra le comunità complesse. Gli esempi includono l&#39;identificazione di variazioni temporali nel metabolismo del litorale nord-occidentale dell&#39;Oceano Atlantico 14 o la Penisola Antartica 5. Altri studi hanno descritto variazioni dei pattern di espressione proteica attraverso scale spaziali, ad esempio, lungo un transetto geografica da un oceano bassa nutrienti gyre ad un sistema upwelling costiero altamente produttivo 15. Per ulteriori recensioni di metaproteomica si consiglia Schneider et al. (2010) 9 e Williams et al. (2014) 16. Proteomica mirate sono stati anche impiegati negli ultimi anni per quantificare l&#39;espressione di specifiche vie metaboliche nell&#39;ambiente 17,18. There sono tre fasi principali nell&#39;analisi metaproteomic. La prima fase è la preparazione del campione, che comprende la raccolta del campione, la lisi cellulare e la concentrazione di proteine. Raccolta dei campioni in microbiologia marina spesso comporta la filtrazione di acqua marina attraverso un pre-filtro per rimuovere le cellule eucariotiche grandi, particelle e batteri particelle-associata, seguita da filtrazione per la cattura di cellule microbiche vivere liberi, comunemente con l&#39;uso di una cartuccia di 0,22 micron unità filtro 19,20. Questi filtri sono incased in un cilindro di plastica e una lisi cellulare e protocollo di estrazione proteina che può essere effettuata all&#39;interno del gruppo filtro sarebbe uno strumento prezioso. Una volta ottenuta la biomassa, le cellule devono essere lisate per consentire l&#39;estrazione delle proteine. Diversi metodi possono essere impiegati, compresi guanidina-HCl 21 lisi e sodio dodecil solfato (SDS) metodi basati lisi. Anche se i detersivi come SDS sono molto efficienti a distruggere le membrane e solubilizzando molti tipi di proteine, Concentrations partire da 0,1% a valle può interferire con la digestione delle proteine ​​e MS analisi 22. Di grande preoccupazione è gli effetti negativi della SDS su tripsina efficienza digestione, potere risolutivo della retromarcia cromatografia liquida fase e soppressione ionica o l&#39;accumulo all&#39;interno della sorgente di ioni 23. La seconda fase è frazionamento e analisi, in cui le proteine ​​vengono sottoposti a digestione enzimatica seguita da analisi LC MS / MS, conseguente am / z modello frammentazione che può essere utilizzata per determinare la sequenza amminoacidica primaria del peptide triptico iniziale. Vari metodi di digestione può essere eseguita a seconda delle tipologie di detergenti utilizzati, nonché il workflow spettrometria di massa a valle. Nel nostro protocollo, 1-D elettroforesi PAGE seguita dalla rimozione di SDS dal gel viene utilizzato per eliminare eventuali contaminazioni detergente. L&#39;analisi delle proteine ​​che sono difficili da solubilizzare, come le proteine ​​di membrana, richiede l&#39;uso di alta concenzioni di SDS o altri detergenti. Questo porta a problemi di compatibilità con elettroforesi SDS-gel. Se l&#39;obiettivo di uno studio richiede la solubilizzazione di questi difficile da solubilizzare le proteine, il sistema tubo-gel può essere usato 22,24. Il metodo del tubo-gel incorpora proteine ​​all&#39;interno della matrice gel senza l&#39;uso di elettroforesi. Successivamente detergenti utilizzati per la solubilizzazione vengono rimossi prima di digestione delle proteine. La terza fase è l&#39;analisi bioinformatica. In questa fase i dati peptidici MS / MS vengono ricercati con un database di sequenze nucleotidiche tradotti per determinare quali sono presenti nel campione peptidi e proteine. L&#39;identificazione di peptidi dipende database viene ricercato contro. Dati metaproteomic marini sono comunemente cercati nei database costituiti da genomi di riferimento, dati metagenomiche come il set di dati Global Ocean Sampling 25, così come cellulari amplificati genomi singoli da li incoltoneages 26,27. L&#39;identificazione delle proteine ​​può essere aumentato anche l&#39;inclusione di sequenze metagenomiche dallo stesso campione come dati metaproteomic stato derivato 5. Qui forniamo un protocollo per la generazione di peptidi adatti per l&#39;analisi MS MS / da biomassa microbica raccolti per filtrazione e memorizzati in una soluzione di stabilizzazione RNA. Il protocollo qui descritto permette di DNA e proteine ​​per essere isolati dallo stesso campione in modo che tutte le fasi che portano alla proteina e precipitazioni DNA sono identici. Dal punto di vista pratico, meno filtrazione è necessaria poiché solo filtro è necessario per proteine ​​e estrazione del DNA. Vorremmo anche riconoscere che questo protocollo è stato creato attraverso la combinazione, l&#39;adattamento e la modifica di due protocolli precedentemente pubblicati. I passi lisi cellulare sono adattati da Saito et al. (2011) 28 e la tripsina in-gel digerire componente è adattato da Shevchenko et al. (2007) 29.

<table><tbody><tr><td>Sterivex -GP 0.22 &mu; m unità filtrante</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td>Campionamento</td></tr><tr><td>RNAlater Soluzione di stabilizzazione</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td>Campionamento</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td>Estrazione di proteine <td>Bio Basic</td><td>77-86-1 o TB0196-500G</td> / <td>Gel SDS PAGE</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>Estrazione di proteine</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio Basic</td><td>15-21-3</td><td>Estrazione di proteine / Gel SDS PAGE</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Basic</td><td>6381-92-6</td><td>Estrazione di proteine</td></tr><tr>Estrazione di proteine<td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td>Estrazione</td></tr> <tr><td>di proteineFiltro Amicon 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC801024</td><td>Estrazione di proteine</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-4L</td><td>Precipitazione di proteine</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-64-1</td><td>Precipitazione di</td></tr><tr><td>proteine MPC Reagente di precipitazione di proteine</td><td>Epicentro</td><td>mmP03750</td><td>Precipitazione del DNA</td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td>Precipitazione del DNA</td></tr><tr><td>Kit di analisi Qubit dsDNA BR</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>Kit</td></tr> di <tr><td>analisi delle proteine Qubit</td> per quantificazione del DNA <td>Life Technologies</td><td>Q33211</td><td>Quantificazione delle proteine</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Bio Basic</td><td>57-50-1</td><td>Gel SDS PAGE</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio Rad</td><td>161-0800</td><td>Gel SDS PAGE</td></tr><tr><td>APS</td><td>Bio Rad</td><td>161-0700</td><td>Gel SDS PAGE</td></tr><tr><td>30% Acrilammide</td><td>Bio Rad</td><td>161-0158</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Bio Rad</td><td>161-0718</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>B-mercaptoetanolo</td><td>Bio Basic</td><td>60-24-2</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Laemmli Campione tampone</td><td>Bio Rad</td><td>161-0737</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Caleidoscopio Ladder</td><td>Bio Rad</td><td>161-0375EDU</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>VWR</td><td>CABDH6044-4</td><td>In-gel Tripsina digest</td></tr><tr><td>NH4HCO3</td><td>Bio Basic</td><td>1066-33-7</td><td>In-gel Tripsina digest</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>In-gel Tripsina digest</td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507-500ML</td><td>In-gel Trypsin digest</td></tr><tr><td>HPLC grado H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-4L</td><td>In-gel Tripsina digestato</td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Bio Basic</td><td>144-48-9</td><td>In-gel Tripsina digestato Tripsina</td></tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>In-gel Tripsina digest</td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>In-gel Trypsin digest</td></tr><tr><td>2 ml ROBO fiala 9 mm</td><td>Candian Life Science</td><td>VT009/C395SB</td><td>Digestato di tripsina in gel</td></tr><tr><td>Inserto in PP BM, senza molla</td><td>Candian Life Science</td><td>4025P-631</td><td>Digestato di tripsina in gel</td></tr></tbody></table>

un flusso di lavoro metaproteomica aquatic microbica: dalle celle ai trittico peptidi per l&#39;analisi basata su spettrometria di massa tandem

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Le tecnologie meta-omiche come la metagenomica, la metatrascrittomica e la metaproteomica possono aiutare nella comprensione della struttura e del metabolismo della comunità microbica. Sebbene potente, la metagenomica da sola può solo chiarire il potenziale funzionale. D'altra parte, la metaproteomica consente di descrivere il metabolismo espresso in situ e la funzione di una comunità. Qui descriviamo un protocollo per la lisi cellulare, l'isolamento di proteine e DNA, nonché la digestione e l'estrazione di peptidi da cellule microbiche marine raccolte su un'unità filtrante a cartuccia (come l'unità filtrante Sterivex) e conservate in una soluzione di stabilizzazione dell'RNA (come RNAlater). Negli studi di proteomica basati sulla spettrometria di massa, l'identificazione di peptidi e proteine viene eseguita confrontando gli spettri di massa tandem dei peptidi con un database di sequenze nucleotidiche tradotte. L'inclusione del metagenoma di un campione nel database di ricerca aumenta il numero di peptidi e proteine che possono essere identificati dagli spettri di massa. Quindi, in questo protocollo il DNA viene isolato dallo stesso filtro, che può essere utilizzato successivamente per l'analisi metagenomica.

A dimostrazione, abbiamo eseguito il protocollo su due campioni di acqua di mare prelevati dalla superficie e la clorofilla massima del mare costiera nel nord del Canada. Mentre in mare, 6-7 L di acqua di mare è stato passato attraverso un 3 micron GF / D prefiltro, quindi le cellule microbiche sono state raccolte su un filtro di 0,22 micron unità cartuccia seguendo il protocollo di Walsh et al. 20. Le cellule sono state immediatamente memorizzati in una soluzione di stabilizzatore RNA fino al proced...

Questo protocollo è per l'estrazione e la concentrazione di proteine e DNA da biomassa microbica raccolta dall'acqua di mare, seguita dalla generazione di peptidi triptici adatti per l'analisi proteomica basata sulla spettrometria di massa tandem.

Un flusso di lavoro metaproteomica Aquatic microbica: dalle celle ai Trittico Peptidi per l&#39;analisi basata su spettrometria di massa tandem

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

Lo scopo di questa procedura è l'estrazione di proteine e DNA dalla biomassa microbica presente nell'acqua di mare, seguita dalla generazione di peptidi triptici per l'analisi proteomica basata su spettrometria di massa in tandem. Questo viene ottenuto innanzitutto lisando le cellule precedentemente accumulate su un filtro a cartuccia. Il secondo passaggio consiste nel concentrare il lisato cellulare utilizzando unità filtranti ad ultra centrifugazione.Successivamente, il lisato viene separato in due frazioni, una per la precipitazione delle proteine e una per la precipitazione del DNA. L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire la digestione intragel con tripsina delle proteine ed estrarre i peptidi adatti all'analisi mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa in tandem. Infine, un'analisi bioinformatica successiva può essere utilizzata per identificare le proteine espresse nel campione, mentre il DNA isolato può essere utilizzato per analisi metagenomiche e/o del gene 16 S-R-R-N-A.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che sia le proteine che il DNA possono essere isolati contemporaneamente dallo stesso campione. Per iniziare, espellere la soluzione di stabilizzazione dell'RNA dall'unità filtrante a cartuccia in una provetta microcentrifuga da due millilitri, utilizzando una siringa da 60 millilitri collegata all'estremità con attacco a baionetta del filtro centrifugo, e centrifugare la provetta microcentrifuga da due millilitri per 10 minuti a 17.000 × g per formare un pellet di eventuali detriti cellulari al termine della centrifugazione. Trasferire il sopranatante in un'unità filtrante ultracentrifuga da 10 K per catturare eventuali proteine provenienti da cellule che si sono lisate dal campione.Non scartare il pellet. Eseguire la centrifugazione dell'unità filtrante ultracentrifuga a 3.270 ×g per 30 minuti o fino a quando il volume si sarà ridotto a circa 600 microlitri. Nel frattempo, sciogliere la punta di una pipetta P10 e bloccare il lato del filtro a cartuccia senza bloccaggio a vite con l'estremità aperta della punta.Questo garantirà che nessun tampone di estrazione né biomassa fuoriescano durante i passaggi successivi. Sospendere il pellet in un millilitro di soluzione di estrazione SDS e pipettarlo nell'unità originale del filtro a cartuccia. Il modo più semplice per pipettare nell'unità del filtro a cartuccia è impilare una punta P200 su una punta P1000 e utilizzare questa doppia punta per la pipettazione. Aggiungere un ulteriore millilitro di soluzione di estrazione SDS all'unità del filtro a cartuccia in modo che il volume totale sia di circa due millilitri.Parafilm. Chiudere l'estremità con blocco adesivo dell'unità filtro a cartuccia e inserire l'unità filtro a cartuccia in un tubo da 50 millilitri. Successivamente, posizionare tre salviette da laboratorio accartocciate sul fondo di un tubo conico da 50 millilitri.Chiudere il coperchio e inserire il tubo nel fornetto di ibridazione per un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente con rotazione. Dopo 10 minuti, posizionare il filtro su un galleggiante di poliuretano e fissarlo in sede utilizzando una siringa da cinque millilitri applicata all'estremità con blocco a baionetta; caricare e incubare in un bagno termico a 95 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, lasciare raffreddare l'unità di filtrazione a cartuccia e farla ruotare a temperatura ambiente per un'ora. Una volta raffreddata, espellere la soluzione di estrazione SDS (lisato cellulare) dal filtro mediante una siringa da 60 millilitri nello stesso dispositivo di filtrazione ultracentrifugo.Come in precedenza, aggiungere un millilitro di soluzione fresca di estrazione SDS all'unità del filtro a cartuccia e mescolare manualmente per 30 secondi. Quindi espellere il contenuto del filtro nell'unità di filtrazione ultracentrifuga utilizzando la siringa da 60 millilitri per risciacquare ed assicurarsi che tutte le proteine siano state rimosse e raccolte. Eseguire la centrifugazione sull'unità di filtrazione ultracentrifuga per 45 minuti a 3.270 ×g, oppure fino a quando il volume nell'unità del filtro risulti inferiore a 600 microlitri.Scartare il flusso iniziale e aggiungere alla provetta del filtro ultracentrifugo una quantità fresca di soluzione estrattiva SDS. Centrifugare nuovamente la provetta per altri 45 minuti a 3.270 ×g, quindi ripetere questo passaggio altre due volte. Assicurarsi che il volume finale all'interno della provetta del filtro ultracentrifugo sia al massimo di 600 microlitri al termine dell'ultima centrifugazione.A questo punto, misurare il volume del concentrato e dividerlo in due parti. Una frazione verrà utilizzata per la precipitazione del DNA e l'altra per la precipitazione delle proteine. Per la precipitazione delle proteine, aggiungere quattro volumi di metanolo e acetone in rapporto 50 a 50 a un volume di concentrato e vortexare per 10 secondi, quindi incubare tutta la notte a meno 20 gradi Celsius.Il giorno successivo, centrifugare la miscela a 17.000 ×g per 30 minuti; dopo aver travasato il soprannatante, lasciare asciugare il pellet in un evaporatore sotto vuoto per un'ora. Non asciugare eccessivamente il pellet, poiché ciò potrebbe rendere difficile la risospensione.Sospendere il pellet in 25 microlitri di soluzione estrattiva SDS. Lasciare in posa per un'ora, quindi risospendere aspirando e dispensando con una pipetta. Eseguire l'elettroforesi SDS-PAGE sulle proteine come descritto nel protocollo testuale, lavorando all'interno di una cappa a sicurezza biologica per minimizzare la contaminazione; tagliare la parte eccedente del gel al di sotto del segno del marcatore di 10 chilodalton per ogni corsia.Ogni traccia verrà analizzata mediante spettrometro di massa in tandem. Tagliare separatamente ogni traccia in quadratini di un millimetro per un millimetro per aumentare la superficie disponibile e inserire tutti i quadratini della traccia in una provetta microcentrifuga a basso legame. Ripetere per tutte le tracce; può essere utilizzato acido acetico all'1% per evitare che il gel si secchi e diventi difficile da tagliare.Procedere con la digestione in gel con tripsina ed estrazione dei peptidi come descritto nel protocollo testuale oppure con la precipitazione del DNA aggiungendo soluzione di estrazione SDS fino a raggiungere il volume di 500 microlitri nella frazione concentrata da utilizzare per la precipitazione del DNA. Questo passaggio ha semplicemente lo scopo di aumentare il volume della soluzione, rendendola più facile da manipolare. Successivamente, aggiungere 0,583 volumi di un reagente di precipitazione delle proteine, come ad esempio il reagente MPC per la precipitazione delle proteine, ed eseguire un vortex.Per 10 secondi, centrifugare a 17.000 ×g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti una forma bianca di precipitato. Dopo la centrifugazione, trasferire il soprannatante in un altro tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere 0,95 volumi di isopropanolo, invertendo la provetta da 30 a 40 volte prima di centrifugare per 10 minuti a quattro gradi Celsius alla velocità massima; quindi, decantare con attenzione e scartare il soprannatante. Successivamente, lavare il pellet due volte con 750 microlitri di etanolo al 70%.Rimuovere il più etanolo possibile mediante pipettaggio, quindi lasciare asciugare il pellet all'aria. Non eccessivamente disidratare il DNA, poiché ciò potrebbe renderne difficile la risospensione una volta secco. Risospendere il pellet in 25 microlitri di tampone low TE a pH 8.Quantificare il DNA utilizzando un kit per saggio di DNA a doppio filamento e seguendo le istruzioni del produttore. Eseguire inoltre elettroforesi su gel di agarosio su tre microlitri di DNA per verificarne la qualità. I peptidi sono stati sottoposti ad analisi mediante spettrometria tandem a partire dai peptidi. Sono stati generati oltre 23.000 spettri per campione, a partire dai quali sono stati identificati peptidi e proteine.La composizione tassonomica e funzionale delle meta-proteomi è stata analizzata utilizzando una combinazione di blast P e l'analizzatore di metagenoma. Il pacchetto software ha assegnato le proteine principalmente ad alfa-proteobatteri, che erano le più rappresentate nel set di dati. La stragrande maggioranza di queste è stata assegnata al clade SAR R 11.Il clade Roter delle Alphaproteobatterie è stato inoltre ampiamente rappresentato e identificato, più frequentemente nelle acque di superficie. Le proteine assegnate alle malattie batteriche erano distribuite in modo uniforme tra la superficie e il massimo di clorofilla, mentre le proteine dei batteri flagellati sono state identificate in misura maggiore al massimo di clorofilla.Le proteine delle gamma proteobatterie erano distribuite uniformemente in tutta la colonna d'acqua, mentre le proteine delle beta proteobatterie si trovavano principalmente in superficie. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni se effettuata correttamente.

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Composti cattura sono trifunzionale piccole molecole per ridurre la complessità del proteoma funzionale reversibile da piccola molecola-proteina seguiti da foto-reticolazione e purificazione. Qui si usa un composto di cattura...

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Qui si descrive un metodo efficace per il frazionamento di membrane plasmatiche vegetali solubili nelle membrane resistenti e detergenti detergenti a base di miscela di non marcato e in vivo completamente 15 N etichettati colture cellulari Arabidopsis thaliana. La procedura viene applicata per studi di proteomica comparativi per capire i processi di segnalazione.

Metabolic Etichettatura e con membrana frazionamento per proteomica comparativa Analisi del<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culture sospensione cellulare

Viene presentato un protocollo rapido per la digestione proteolitica con un microreattore triptico a flusso continuo costruito internamente accoppiato a uno spettrometro di massa a ionizzazione elettrospray (ESI). Vengono descritti la fabbricazione del microreattore, la configurazione sperimentale e il processo di acquisizione dei dati.

Veloce enzimatica Trattamento di proteine ​​per MS rilevamento con un microreattore flusso-through

Presentiamo qui protocolli per purificazione per affinità di complessi proteici e la loro separazione dal blu PAGE nativa, seguiti da proteine ​​correlazione profilatura mediante un'etichetta disponibile spettrometria di massa quantitativa. Questo metodo è utile per risolvere interattomi in distinti complessi proteici.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Vi presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le proteine con etichettatura isobarico, vasto frazionamento, strumenti di bioinformatica e procedura di controllo di qualità in combinazione con cromatografia liquida interfacciato ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.

Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

Questo protocollo descrive un singolo throughput per complementari tecniche analitiche e omiche che culmina in una caratterizzazione completamente accoppiato di sostanza organica naturale e proteomica microbica in ecosistemi differenti. Questo approccio permette confronti robusti per identificare vie metaboliche e trasformazioni importanti per descrivere la produzione di gas serra e predire le risposte al cambiamento ambientale.

Singolo-velocità effettiva complementari ad alta risoluzione tecniche analitiche per la caratterizzazione di miscele complesse di sostanza organica naturale

Il protocollo descritto fornisce un'analisi proteomica quantitativa ottimizzata di campioni di tessuto utilizzando due approcci: la quantificazione basata su etichette e la quantificazione senza etichette. Gli approcci basati su etichette hanno il vantaggio di una quantificazione più accurata delle proteine, mentre un approccio senza etichette è più economico e utilizzato per analizzare centinaia di campioni di una coorte.

Flusso di lavoro completo di proteomica shotgun basata su spettrometria di massa di campioni di tessuto

Qui descriviamo una caratterizzazione proteomica basata sulla spettrometria di massa di linee cellulari con destini tissutali noti nell'embrione vertebrato di Xenopus laevis .

Proteomica della spettrometria di massa guidata da livrea cellulare nell'embrione in via di sviluppo (rana)

La metaproteomica clinica offre approfondimenti sul microbioma umano e sui suoi contributi alla malattia. Abbiamo sfruttato la potenza computazionale della piattaforma Galaxy per sviluppare un flusso di lavoro bioinformatico modulare che facilita l'analisi metaproteomica complessa basata sulla spettrometria di massa e la caratterizzazione di diversi tipi di campioni clinici rilevanti per gli studi sulla malattia.

Un flusso di lavoro di metaproteomica clinica implementato all'interno della piattaforma Galaxy Bioinformatics per analizzare le interazioni ospite-microbioma alla base della malattia umana

Qui, stabiliamo un metodo proteomico basato sulla spettrometria di massa utilizzando regioni isolate di interesse in sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina. Questo protocollo viene utilizzato per analizzare il proteoma proveniente da specifiche aree tissutali in sezioni di tessuto archiviate fissate in formalina e incluse in paraffina.

Un approccio semplificato per la proteomica basata sulla spettrometria di massa utilizzando regioni tissutali selezionate

Scopri un flusso di lavoro metaproteomico per estrarre proteine e DNA da campioni di acqua marina, generare peptidi triptici e analizzarli mediante spettrometria di massa tandem. Questo metodo consente studi completi sulla comunità microbica marina.

Un flusso di lavoro metaproteomica Aquatic microbica: dalle celle ai Trittico Peptidi per lanalisi basata su spettrometria di massa tandem (Video) | JoVE Journal

Un flusso di lavoro metaproteomica Aquatic microbica: dalle celle ai Trittico Peptidi per l'analisi basata su spettrometria di massa tandem

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