Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

L'obiettivo generale di questa procedura è abbreviare l'approccio classico Yamanaka IPS generando direttamente cellule progenitrici neurali indotte da una biopsia cutanea del paziente per applicazioni terapeutiche. Ciò viene realizzato innanzitutto eseguendo una biopsia a punzone sul paziente per ottenere cellule fibroblastiche primarie coltivabili in vitro. Il secondo passaggio consiste nell'espandere e successivamente infettare i fibroblasti coltivati con virus che codificano fattori di riprogrammazione per indurre una trasdifferenziazione.

Successivamente, le colonie di cellule progenitrici neurali indotte putative convertite, o INPC, devono essere selezionate attentamente mediante validazione visiva e successivamente isolate mediante picking manuale circa 20 giorni dopo l'infezione. L'ultimo passaggio consiste nel clonare monoclonalmente le IPC e nell'espanderle in un mezzo di induzione neurale; infine, viene effettuata una differenziazione in vitro mirata e viene utilizzata la microscopia a immunofluorescenza per dimostrare che le IPC direttamente convertite dal paziente sono in grado di differenziarsi in cellule neuronali e gliali, rendendole così una fonte praticamente illimitata per applicazioni biomediche. I vantaggi di questa tecnica di conversione diretta rispetto ai metodi esistenti, come la derivazione alla Yamanaka di cellule staminali pluripotenti indotte e la loro successiva differenziazione, sono due.

La conversione diretta in cellule staminali neurali indotte, che chiamiamo cellule INS, non è solo notevolmente più rapida, ma anche più sicura. Pertanto, la procedura di transdifferenziazione renderà molto più accessibile la produzione di cellule specifiche per il paziente a fini terapeutici, con un rischio notevolmente ridotto di formazione tumorale rispetto alle cellule iPS. In questo modo, siamo ora in grado di superare due importanti ostacoli nel campo della medicina rigenerativa attuale.

Questa è la sicurezza e l'efficacia clinica. Per iniziare la biopsia a punzone, disinfettare la pelle del paziente e anestetizzare la zona da cui verrà prelevata la biopsia con 0,5-1 millilitro di mepivacaina cloridrato per via intradermica. Prelevare il campione di pelle utilizzando un punzone per biopsia sterile da tre millimetri.

Sciacquare la biopsia con soluzione salina tamponata al fosfato di dobe o DPBS contenente un microlitro per millilitro di gentamicina. Rimuovere il tessuto adiposo dalla biopsia utilizzando un bisturi e pinze. Quindi sciacquare nuovamente la biopsia due volte con il tampone prima di aspirarla completamente.

Coprire la biopsia con dis paste two e incubare da 16 a 18 ore a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aspirare completamente il dis paste two, quindi lavare la biopsia due volte con DPBS. Rimuovere l'epidermide con pinzette, poi lavare nuovamente la biopsia due volte con DPBS.

Successivamente, aggiungere due millilitri di collagenasi di tipo due e trasferire in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere collagenasi fino a un volume totale di cinque millilitri. Incubare per 45 minuti a 37 gradi Celsius.

Centrifugare il campione per cinque minuti a 180 ×g e scartare il soprannatante successivamente. Risospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo DMEM contenente siero fetale di vitello e gentamicina, quindi centrifugare nuovamente per cinque minuti a 180 ×g. Scartare il soprannatante e risospendere il pellet in 1,5 millilitri dello stesso mezzo. Successivamente, trasferire il campione in un’asta T 25 per colture cellulari aderenti e incubare a 37 gradi Celsius in atmosfera al 5% CO₂, sostituendo il mezzo ogni tre giorni dopo circa due settimane.

Una volta che le cellule sono confluenti intorno alle parti cutanee, suddividere le cellule utilizzando tripsina EDTA come descritto nel protocollo testuale. Espandere ulteriormente le cellule cambiando il mezzo ogni tre giorni e suddividendole quando raggiungono la confluenza. Dopo aver escluso la contaminazione da micoplasma mediante saggi standard, preparare le cellule per l'esperimento di conversione diretta lavandole una volta con DPBS, quindi aspirare il DPBS e aggiungere 2,5 millilitri di tripsina EDTA. Dopo aver incubato le cellule per cinque minuti a 37 gradi Celsius, 5% CO2, battere delicatamente il fiasco per staccare le cellule.

Risospendere le cellule in 2,5 millilitri di mezzo per fibroblasti e trasferirle in un tubo da 15 millilitri. Centrifugare il tubo a 180 ×g per cinque minuti ed aspirare il soprannatante. Risospendere le cellule in un millilitro di mezzo per fibroblasti e pipettare su e giù per ottenere una sospensione di cellule singole.

Contare il numero di cellule utilizzando una camera di conta prima della semina. 30.000 cellule per pozzetto. In una piastra a 24 pozzetti, incubare le cellule tutta la notte a 37 gradi Celsius, 5%CO2. Tutte le operazioni che prevedono la manipolazione del virus devono essere eseguite in una cappa a sicurezza biologica con idonei dispositivi di protezione individuale, inclusa una mascherina chirurgica per prevenire l'esposizione delle mucose.

Per eseguire l'infezione, sostituire innanzitutto il mezzo cellulare esistente con 100 microlitri di mezzo per fibroblasti. Quindi, risospendere gli aliquote scongelati di virus T four, KLF four, SOX two e cmix sendi in un millilitro di mezzo per fibroblasti. Aggiungere ciascun virus alle cellule con un MOI di 3 e mescolare delicatamente; incubare le cellule tutta la notte a 37 gradi Celsius, 5%CO2. Dopo 24 ore, aspirare il mezzo e aggiungere 500 microlitri di mezzo di induzione neurale. Coltivare le cellule a 39 gradi Celsius, 5%CO2 da questo momento in poi, sostituendo il mezzo ogni due giorni. Al sesto giorno dall'infezione, preparare piastre a sei pozzetti rivestite con laminina.

Aggiungere un millilitro di laminina a un microgrammo per millilitro in DPBS su piastre a sei pozzetti e mantenere le piastre a quattro gradi Celsius per 24 ore al settimo giorno dopo l'infezione; dividere le cellule utilizzando D-P-B-S-E-D-T-A come descritto nel protocollo testuale. Aggiungere 500 microlitri di D-M-E-M-F 12 e trasferire la sospensione in un tubo da 15 millilitri. Quindi centrifugare il campione a 180 ×g per cinque minuti.

Aspirare il soprannatante e risospendere il pellet in 1,5 millilitri di mezzo di induzione neuronale; piastrare le cellule su piastre da sei pozzetti rivestite con laminina e aggiungere l'inibitore della chinasi RO fino a una concentrazione finale di 10 micromolare. Coltivare le cellule a 39 gradi Celsius, 5%CO2, sostituendo il mezzo ogni due giorni a partire dal giorno 14. Dopo l'infezione, coltivare le cellule a 37 gradi Celsius, 5%CO2; le colonie di epitelio neuro si rendono evidenti intorno al giorno 17 dopo l'infezione, come visualizzato mediante microscopia a contrasto di fase.

Devono essere abbastanza grandi da poter essere selezionati intorno al giorno 20 dopo l'infezione, un giorno prima della selezione, in una piastra a 48 pozzetti rivestita con laminina come descritto nel protocollo testuale. Un giorno dopo, aspirare la laminina dalle piastre e aggiungere 200 microlitri di mezzo di induzione neuronale nei pozzetti. Lavare una volta le piastre a sei pozzetti contenenti le colonie da selezionare con DPBS prima di aggiungere due millilitri di mezzo di induzione neuronale.

Per ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti, prelevare meccanicamente le cellule raschiando attorno alle colonie con un ago sottile per eliminare le cellule circostanti, quindi raccogliere le colonie utilizzando punte di pipetta montate su una pipetta da 200 microlitri impostata a 50 microlitri. Trasferire ciascuna colonia in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti rivestita con laminina e generare una sospensione di singole cellule mediante pipettaggio ripetuto su e giù per 10 volte.

Aggiungere l'inibitore della chinasi R a una concentrazione finale di 10 micromolare alle cellule. Coltivare le cellule in una piastra a 48 pozzetti a 37 gradi Celsius, 5% CO₂, per due giorni. Cambiare il mezzo ogni due giorni fino a quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80-90%.

Vedere il protocollo testuale per l'espansione e la crioconservazione delle IPC per la differenziazione delle IPC verso una coltura di linea neurale. Le cellule su piastre rivestite con laminina. Come in precedenza, sostituire il mezzo con mezzo di differenziamento neurale quando le cellule raggiungono una confluenza di circa il 70% e continuare a cambiare il mezzo ogni due giorni per tre settimane.

Non dividere le cellule durante la differenziazione dopo tre settimane; le cellule devono esprimere il marcatore neuronale TUJ1 per ottenere neuroni più maturi e sottotipi neuronali. Continuare la differenziazione fino a tre mesi per la differenziazione delle IPC, in particolare verso una linea gliale. Cambiare il mezzo con mezzo di induzione gliale, contenente 20 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita epidermico per indurre la differenziazione in cellule precursori gliali.

Rimuovere metà del mezzo e sostituirlo con mezzo fresco ogni due giorni per circa due settimane. Durante questo periodo, le cellule devono essere suddivise in un rapporto da uno a tre in presenza di un inibitore della chinasi R a 10 micromolari quando, dopo due settimane, si raggiunge una confluenza del 100%. Differenziare ulteriormente le cellule in astrociti cambiando il mezzo con un mezzo per astrociti disponibile in commercio quando le cellule sono quasi confluenti e continuando a sostituire il mezzo ogni secondo giorno; circa sette giorni dopo, le cellule iniziano ad esprimere marcatori degli astrociti.

Se le cellule raggiungono una confluenza del 100% durante il protocollo di differenziamento, suddividerle in un rapporto uno a due. In presenza di un inibitore della chinasi RO a 10 micromolar, l'infezione dei fibroblasti con i virus T4KLF4, SOX2 e cMyc Sendi e la coltura in condizioni di mezzo neuroinduttivo hanno determinato un cambiamento della morfologia dei fibroblasti e la successiva comparsa di colonie. Diciassette giorni dopo l'infezione, le linee cellulari monoclonali generate possono essere espanse e risultano positive per marcatori delle cellule staminali neurali come SOX2, SOX1, nestina e PAX6, così come per il marcatore di proliferazione Ki-67, mentre non esprimono il marcatore associato alla pluripotenza T4.

Inoltre, aggiungendo fattori di crescita neuronali al mezzo di coltura cellulare, le cellule progenitrici neurali possono essere differenziate in neuroni mediante l'applicazione di una differenziazione astrocitaria. Le linee cellulari di progenitori neurali indotte possono essere differenziate anche in linee gliali, come dimostrato dall'analisi dei tipici cambiamenti morfologici e dalla colorazione contro GFAP. Mediante questa conversione diretta, generiamo cellule progenitrici neurali indotte multipotenti a partire da fibroblasti di pazienti in tre-quattro settimane.

Queste cellule potrebbero essere utilizzate per numerose applicazioni biomediche. Le implicazioni di questa tecnica riguardano la terapia, la diagnosi e la modellizzazione di disturbi neurodegenerativi come la malattia di Alzheimer e il morbo di Parkinson, oltre ad altre condizioni neurologiche.