Name: Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Scopri la conversione diretta di fibroblasti umani in progenitori neurali indotti per applicazioni terapeutiche. Questo metodo accelera la generazione di cellule neuronali e gliali specifiche per paziente.

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Vorremmo ringraziare tutti i membri della cellula formativa e medicina rigeneratrice Group dell&#39;Università di Würzburg per utili suggerimenti e Martina Gebhardt, nonché Heike Arthen per un eccellente supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), il Ministero dell&#39;Istruzione e della Ricerca tedesco BMBF (01 GN 0813), i bavaresi Research Network pluripotenti indotte cellule staminali &quot;forIPS&quot; e la &quot;Stiftung Sibylle Assmus &quot;. La figura 1 è stata prodotta utilizzando Servier medica Arte, disponibile da www.servier.com.

I fibroblasti umani utilizzati in questo studio sono stati ottenuti da una biopsia cutanea dopo essersi informato consenso e la clearance etico dal comitato etico dell&#39;Università di Würzburg, Germania (rapporto etico no: 96/11 del 10.06.2011). 1. Punch Biopsia <ol><li> Disinfettare la pelle del paziente. Anestetizzare parte della pelle di cui biopsia sarà presa da (preferibilmente una zona esposta al sole meno) con 0,5 a 1 ml di mepivacaina cloridrato intracutaneously e preparare biopsia della pelle utilizzando una sterile 3 millimetri biopsia, lavare biopsia con DPBS + 1 ml / 1 ml Gentamicina e rimuovere grasso. Sciacquare biopsia due volte con DPBS + gentamicina, aspirare DPBS completamente e copertura biopsia con dispasi II (2.4 U / ml) ed incubare 16 - 18 ore a 4 ° C. </li><li> Aspirare dispasi completamente, lavare due volte con DPBS e rimuovere l&#39;epidermide con una pinzetta. Lavare biopsia due volte con DPBS, aggiungere 2 ml tipo Collagenasi 2 (500 U / ml CDU), trasferimento in 15 ml di tubo e aggiungere Collagenase il volume totale fino a 5 ml. Incubare per 45 minuti a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Centrifugare 5 min a 180 xg ed eliminare il surnatante dopo. Risospendere pellet in 10 ml di DMEM-FCS-gentamicina-media (10% FCS, 1 ml / ml gentamicina) e centrifugare ancora per 5 min a 180 x g. Gettare il surnatante e risospendere pellet in 1,5 ml DMEM-FCS-gentamicina-media. Trasferimento t25 aderente pallone di coltura tissutale e incubare a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Modificare i media ogni 3 giorni. </li><li> Dopo circa due settimane, quando le cellule sono confluenti intorno alle parti della pelle, dividere le celle utilizzando tripsina / EDTA (0,05%): Lavare le cellule una volta con DPBS, incubare 5 minuti a 37 ° C, 5% di CO 2 dopo l&#39;aggiunta di 2 ml tripsina / EDTA (0,05%), aggiungere 2 ml di DMEM-FCS-Gentamicina-media, trasferimento in tubo da 15 ml e centrifugare a 180 xg per 5 minuti; scartare il surnatante e risospendere pellet in quantità appropriata di DMEM-FCS-gentamicina-media. </li><li> Espandere ulteriormente le cellule cambiando il mezzo ogni 3 rd giorno e la divisione come descritto in precedenza quando le cellule sono confluenti; aggiunta di gentamicina può essere interrotto dopo il passaggio 2. </li><li> Prima di utilizzare le cellule per esperimenti di conversione diretta, assicuratevi di escludere la contaminazione da micoplasma da analisi standard. </li><li> Quando le cellule sono state ampliate, si può iniziare direttamente la conversione o congelare cellule verso il basso con il 10% e il 90% DMSO FCS. Le cellule devono essere conservati in -80 ° C per 2 giorni e poi trasferite ad azoto liquido per la conservazione a lungo termine. </li><li> Per la preparazione della conversione, lavare le cellule una volta con DPBS, aspirare DPBS e aggiungere 2,5 ml tripsina / EDTA (0,05%). Conservare per 5 min a 37 ° C, 5% CO 2. Toccare pallone delicatamente per staccare le cellule, risospendere in 2,5 ml di mezzi di fibroblasti (DMEM incl. L-Glu + 10% FCS + 1% + 1% NEAA piruvato di sodio) e trasferimento in 15 ml di tubo. Centrifugare a 180 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 ml di mezzi di fibroblasti e pipetta su e giù per generare sospensione singola cella. &lt;/ Li&gt; <li> Contare il numero di cellule utilizzando una camera di conteggio Fuchs-Rosenthal- o Neubauer celle e 3 x 10 4 cellule per pozzetto di una piastra a pozzetti 24 plate. Incubare O / N a 37 ° C, 5% di CO 2. </li></ol> 2. L&#39;infezione di fibroblasti umani con Sendai Virus e Transdifferenziazione NOTA: Per garantire la sicurezza, le seguenti operazioni che manipolano virus devono essere eseguiti in una cappa di sicurezza biologica e una cappa a flusso laminare, e con gli adeguati dispositivi di sicurezza personale, in particolare una mascherina chirurgica, per evitare l&#39;esposizione della mucosa. <ol><li> Passare le cellule a 100 microlitri mezzi di fibroblasti (Passo 1.9). Scongelare aliquote di Oct4-, Klf4-, Sox2- e virus c-myc-Sendai e risospendere ogni virus in 1 ml di mezzi di fibroblasti. Aggiungere ogni virus con una MOI di 3 cellule (titolo virale varia da lotto a lotto, ma un&#39;aliquota di ciascuna virus può generalmente essere utilizzato per l&#39;infezione di 10 pozzetti di una piastra a pozzetti 24) e mescolare delicatamente. Incubare O / N a 37 ° C, 5% CO 2 </sub&gt;. </li><li> Dopo 24 ore aspirare medio e aggiungere 500 ml di mezzi neuroinduction (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% Glutamax, 10 ng / ml hLIF, 3 micron CHIR99021, 2 mM SB431542) e coltura a 39 ° C, 5% CO 2 da ora in poi. Modificare i media a giorni alterni. </li><li> Il giorno 6 dopo l&#39;infezione preparare laminina rivestite 6-pozzetti-: diluire laminina a 1 mg / ml di DPBS, aggiungere 1 ml di soluzione sulla 6-pozzetti e conservare a 4 ° C per 24 ore. </li><li> Il giorno 7 dopo l&#39;infezione dividere le celle utilizzando DPBS / EDTA: Aspirare il supporto e lavare le cellule una volta con DPBS, poi aggiungere 500 ml di DPBS / EDTA e incubare per 10 min a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Aggiungere 500 ml di DMEM / F12 e rimuovere sospensione dalla piastra in una provetta da 15 ml e centrifugare a 180 xg per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1,5 ml di mezzi neuroinduction, piatto su laminina rivestite 6 pozzetti-e aggiungere ROCK inibitore Y27632 in un conce finalentration di 10 micron per le cellule, coltura a 39 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Modificare i media a giorni alterni. </li><li> Dal giorno 14 dopo l&#39;infezione coltura le cellule a 37 ° C, 5% di CO 2. Colonie roepiteliale si manifestano intorno al giorno 17 dopo l&#39;infezione al microscopio a contrasto di fase. Essi dovrebbero essere abbastanza grandi per essere prelevati circa 20 giorni dopo l&#39;infezione. </li></ol> 3. Isolamento di Colonie putativo INPC <ol><li> Un giorno prima di prendere, cappotto un 48 ben piastra con laminina: diluire laminina a 1 mg / ml di DPBS, aggiungere 300 ml di soluzione su piastre e conservare a 4 ° C per 24 ore. Un giorno dopo aspirare laminina dai piatti e aggiungere 200 ml di mezzi neuroinduction ai pozzetti. </li><li> Lavare i 6 ben piastre contenenti le colonie di essere prelevati una volta con DPBS e aggiungere 2 ml DPBS per pozzetto di 6 ben piastre. Raccogliere le colonie meccanicamente: raschiare intorno colonie usando un ago sottile per liberarsi di cellule circostanti; impostare il 2001; l Pipetman su 50 ml e raccogliere le colonie utilizzando i rispettivi puntali delle pipette. </li><li> Trasferire una colonia ciascuna in un pozzetto di una piastra da 48 pozzetti laminina rivestite e generare una sospensione di cellule singole meccanicamente pipettando su e giù per 10 volte. Aggiungere inibitore ROCK Y27632 in una concentrazione finale di 10 mM alle cellule. </li><li> Grow le celle del 48 micropiastre a 37 ° C, 5% CO 2 per 2 giorni. Modificare i media ogni due giorni fino a quando le cellule raggiungono 80-90% di confluenza (circa 3 - 4 giorni.). </li></ol> 4. Ampliamento e Cryo-conservazione di iNPCs <ol><li> Passaging ed espansione di iNPCs <ol><li> Aspirare il medio e lavare le cellule con DPBS. Aspirare il DPBS e aggiungere 200 microlitri DPBS / EDTA e incubare per 10 min a 37 ° C, 5% CO 2, aggiungere 200 ml di DMEM / F12 e rimuovere sospensione dalla piastra in una provetta da 15 ml, centrifugare a 180 xg per 5 min . </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 0,5 ml di Neuroinduction supporto (punto 2.2), piastra su laminina rivestite 12-pozzetti e aggiungere inibitore ROCK Y27632 in una concentrazione finale di 10 pM alle cellule, coltura a 37 ° C, 5% CO 2. Dopo cellule raggiungono 80-90% confluenza possono essere sia ulteriormente ampliato o congelati come segue. </li></ol></li><li> Congelamento di iNPCs <ol><li> Aspirare il medio e lavare le cellule con DPBS. Aspirare il DPBS e aggiungere DPBS 300μl / EDTA e incubare per 10 min a 37 ° C, 5% CO 2, aggiungere 300 ml di DMEM / F12 e rimuovere sospensione dalla piastra in una provetta da 15 ml, centrifugare a 180 xg per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 0,5 ml di mezzo commerciale di congelamento NSC. Trasferimento sospensione fiale congelamento e mettere in un contenitore cella di congelamento. Conservare a -80 ° C per 2 giorni, poi il trasferimento per l&#39;azoto liquido per la conservazione a lungo termine. </li></ol></li></ol> 5. Differenziazione dei iNPCs <ol><li> Differenziazione verso neuroneal lineage <ol><li> Cellule di coltura su piastre laminina rivestite come sopra descritto. Cambia supporto per neuro-diff-media (DMEM / F-12, 1x N2, 1x B27, 300 ng / ml cAMP, 200 micron di vitamina C, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF) quando le cellule sono circa il 70% confluenti. Modificare i media ogni giorno per tre settimane. Do cellule non dividere durante la differenziazione. </li><li> Dopo tre settimane le cellule dovrebbero esprimere il marcatore TUJ1 neuronale. Per ottenere neuroni maturi e sottotipi neuronali continuano differenziazione fino a 3 mesi. </li></ol></li><li> La differenziazione verso lineage gliali <ol><li> Cambia supporto per i media ad induzione gliale (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 mM β-mercaptoetanolo, 100 micron aminoacidi non essenziali, 1,5 mm L-glutammina, l&#39;insulina 5 mg / ml, 40 ng / ml T3) incluso 20 ng / ml EGF di indurre il differenziamento in cellule precursori gliali. Rimuovere la metà dei media e sostituirli con mezzi freschi ogni giorno per circa 2 settimane. Durante questo periodo le cellule dovrebbero essere divisi1: 3 in presenza di 10 mM inibitore ROCK Y27632 quando viene raggiunto il 100% di confluenza. </li><li> Dopo 2 settimane differenziare le cellule ulteriormente in astrociti: quando le cellule sono supporti cambiamento quasi confluenti ai media commerciali astrociti disponibili, cambiare i media ogni due giorni. Dopo circa 7 giorni cellule iniziano a esprimere marcatori astrociti (ad esempio, GFAP). Se le cellule diventano 100% confluenti durante il protocollo di differenziazione, dividerli in un rapporto 1: 2 in presenza di 10 micron inibitore ROCK Y27632. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Cai, J., Yang, M., Poremsky, E., Kidd, S., Schneider, J. S., Iacovitti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+survive+and+integrate+into+6-OHDA-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neurons derived from human induced pluripotent stem cells survive and integrate into 6-OHDA-lesioned rats.</a> Stem Cells Dev. 19 (7), 1017-1023 (2010).</li>
<li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li>
<li>Rhee, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-based+human+iPS+cells+efficiently+generate+functional+dopamine+neurons+and+can+treat+a+rat+model+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease.</a> J Clin Invest. 121 (6), 2326-2335 (2011).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).</li>
<li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%E2%80%99s+disease+patient-derived+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+viral+reprogramming+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors.</a> Cell. 136 (5), 964-977 (2009).</li>
<li>Sommer, C. A., Stadtfeld, M., Murphy, G. J., Hochedlinger, K., Kotton, D. N., Mostoslavsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 27 (3), 543-549 (2009).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Montserrat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+poly-beta-amino+esters+as+the+non-viral+gene+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple generation of human induced pluripotent stem cells using poly-beta-amino esters as the non-viral gene delivery system.</a> J Biol Chem. 286 (14), 12417-12428 (2011).</li>
<li>Warren, L., Nu, Y., Wang, J., Guo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA.</a> Sci Rep. 2, 657(2012).</li>
<li>Bosnali, M., Edenhofer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transducible+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Generation of transducible factors.</a> Biol Chem. 389 (7), 851-861 (2008).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+using+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins.</a> Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).</li>
<li>Awe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+conversion+to+putative+clinical-grade+state%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade state.</a> Stem Cell Res Ther. 4 (4), 87(2013).</li>
<li>Kadari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+of+viral+reprogramming+cassettes+by+Cre+protein+transduction+enables+rapid%2C+robust+and+efficient+derivation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Excision of viral reprogramming cassettes by Cre protein transduction enables rapid, robust and efficient derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 5 (2), 47(2014).</li>
<li>Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., Südhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li>
<li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476 (7359), 224-227 (2011).</li>
<li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).</li>
<li>Ladewig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+enable+highly+efficient+neuronal+conversion+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts.</a> Nat Methods. 9 (6), 575-578 (2012).</li>
<li>Han, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+neural+stem+cells+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by defined factors.</a> Cell Stem Cell. 10 (4), 465-472 (2012).</li>
<li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+into+stably+expandable+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+and+region-specific+neural+progenitors+from+primate+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free and region-specific neural progenitors from primate fibroblasts.</a> Cell Rep. 3 (5), 1580-1591 (2013).</li>
<li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Werning, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing%2C+tripotent+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li>
<li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+dermal+fibroblasts+into+neural+progenitor+cells+by+a+novel+cocktail+of+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors.</a> Curr Mol Med. 12 (2), 126-137 (2012).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+enable+OCT4-mediated+direct+reprogramming+into+expandable+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Small molecules enable OCT4-mediated direct reprogramming into expandable human neural stem cells.</a> Cell Res. 24 (1), 126-129 (2014).</li>
<li>Hemmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neural+stem+cells+achieve+long-term+survival+and+functional+integration+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Induced neural stem cells achieve long-term survival and functional integration in the adult mouse brain.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).</li>
<li>Conti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-independent+symmetrical+self-renewal+of+a+mammalian+tissue+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell.</a> PLoS Biol. 3 (9), e283(2005).</li>
<li>Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy,, Socci, G., Tabar, N. D., Studer, V., L, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ES+cell-derived+rosettes+reveal+a+functional+distinct+early+neural+stem+cell+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Human ES cell-derived rosettes reveal a functional distinct early neural stem cell stage.</a> Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).</li>
<li>Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brüstle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rosette-type+self-renewing+human+ES+cell-derived+neural+stem+cell+with+potential+for+in+vitro+instruction+and+synaptic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A rosette-type self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 3225-3230 (2009).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+induction+and+long-term+self-renewal+of+primitive+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells+by+small+molecule+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (20), 8299-8304 (2011).</li>
<li>Reinhardt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+expansion+using+only+small+molecules+of+human+neural+progenitors+for+neurodegenerative+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling.</a> PLoS One. 8 (3), c59252(2013).</li>
<li>Ring, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+mouse+and+human+fibroblasts+into+multipotent+neural+stem+cells+with+a+single+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of mouse and human fibroblasts into multipotent neural stem cells with a single factor.</a> Cell Stem Cell. 11 (1), 100-109 (2012).</li>
<li>Zou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+into+neuronal+restricted+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts into neuronal restricted progenitors.</a> J Biol Chem. 289 (8), 5250-5260 (2014).</li>
<li>Aharonowiz, M., Einstein, O., Fainstein, N., Lassmann, H., Reubinoff, B., Ben-Hur, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor in an animal model of multiple sclerosis.</a> PLoS One. 3 (9), e3145(2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulation+by+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+oligodendroglial+progenitors+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immunomodulation by transplanted human embryonic stem cell-derived oligodendroglial progenitors in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Stem Cells. 30 (12), 2810-2829 (2012).</li>
<li>Kondoh, T., Pundt, L. L., Blount, J. P., Conrad, J. A., Low, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+fetal+tissue+from+spontaneous+abortions+to+a+rodent+model+of+Parkinson%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human fetal tissue from spontaneous abortions to a rodent model of Parkinson’s disease.</a> Cell Transplant. 5 (1), 69-75 (1996).</li>
<li>Takagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neurons+generated+from+monkey+embryonic+stem+cells+function+in+a+Parkinson+primate+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neurons generated from monkey embryonic stem cells function in a Parkinson primate model.</a> J Clin Invest. 115 (1), 102-109 (2005).</li>
<li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+midbrain+dopaminergic+neurons+in+the+brain+of+a+primate+model+of+Parkinson%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinson%E2%80%99s+Dis%22%5BJournal%5D)">Survival of human induced pluripotent stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons in the brain of a primate model of Parkinson’s disease.</a> J Parkinson’s Dis. 1 (4), 395-412 (2011).</li>
<li>Kirkeby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+regionally+specified+neural+progenitors+and+functional+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions.</a> Cell Rep. 1 (6), 703-714 (2012).</li>
<li>Dezawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+induction+of+neuronal+cells+from+bone+marrow+stromal+cells+and+application+for+autologous+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Specific induction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application for autologous transplantation.</a> J Clin Invest. 113, 1701-1710 (2004).</li>
<li>Izrael, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+oligodendrocytes+derived+from+embryonic+stem+cells%3A+Effect+of+noggin+on+phenotypic+differentiation+in+vitro+and+on+myelination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo.</a> Mol Cell Neurosci. 34 (3), 310-323 (2007).</li>
<li>Cassady, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+conversion+of+adult+mouse+liver+cells+and+B+lymphocytes+to+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct lineage conversion of adult mouse liver cells and B lymphocytes to neural stem cells.</a> Stem Cell Rep. 3 (6), 948-956 (2014).</li>
<li>Castano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+efficient+neural+conversion+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Fast and efficient neural conversion of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Rep. 3 (6), 1118-1131 (2014).</li>
<li>Thoma, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells.</a> Stem Cell Rep. 3 (4), 539-547 (2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Qui vi mostriamo l&#39;isolamento e la conversione diretta di fibroblasti umani in cellule progenitrici neurali senza transgene espandibili e la loro progenie differenziata come base putativo per la terapia cellulare di sostituzione o l&#39;applicazione in analisi lo screening di stupefacenti. Conversione lineage diretta di cellule somatiche nel NPC è stato ottenuto mediante espressione forzata di trascrizione specifici lineage fattori 26,33,34. Tuttavia, in molti casi fibroblasti fetali sono stati usati per ...

Nel 2006 Yamanaka e colleghi potrebbero mostrare per la prima volta la possibilità di riprogrammazione delle cellule somatiche in uno stato pluripotente 1. Questo dedifferentiation è stato raggiunto da sovraespressione di quattro fattori di trascrizione Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc in fibroblasti murini. Le generati cosiddette cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) mostrano l&#39;equivalenza funzionale alle cellule staminali embrionali (ESC) e possono quindi essere differenziati in tutti i tipi di cellule dell&#39;organismo adulto. Un anno dopo la riprogrammazione di iPSCs potrebbe essere realizzata anche per fibroblasti umani 2. Gli esperimenti in modelli animali dimostrano che le cellule IPSC derivati ​​vengono generalmente usate per la terapia cellulare di sostituzione, per esempio, in malattia di Parkinson (PD) 3-5. Tuttavia, alcune limitazioni associate con l&#39;uso di iPSCs rappresentano ostacoli per la piena realizzazione del loro potenziale terapeutico. Prima di tutto, riprogrammazione delle cellule in uno stato pluripotente e successivacontrollo di qualità è generalmente un tempo e processo inefficiente cedevole in ampi e quindi costose procedure di coltura cellulare. In secondo luogo, iPSCs bisogno di essere ri-differenziate nel tipo cellulare desiderato di interesse prima applicazione biomedica e la probabilità di cellule pluripotenti residue nella popolazione differenziata porti un significativo potenziale oncogeno e visualizza quindi un elevato rischio dopo il trapianto di cellule 6. In terzo luogo, il processo di riprogrammazione viene ottenuto inducendo i fattori di riprogrammazione da infezioni lenti- o retrovirale. L&#39;integrazione di questi virus nel genoma dell&#39;ospite potrebbe portare a mutagenesi inserzionale e / o riattivazione incontrollata dei transgeni 7,8. I sistemi non integrativi sono stati sviluppati per fornire i fattori di riprogrammazione di cellule bersaglio, che riducono al minimo il rischio di mutagenesi inserzionale e transgene riattivazione. Esempi di questi approcci senza transgene sono la riprogrammazione delle cellule utilizzando non l&#39;integrazioneAdeno o il virus di Sendai 9,10, basati sul DNA vettori 11 o l&#39;applicazione di metodi senza DNA, come la transfezione di mRNA sintetico 12 o trasduzione di proteine ​​ricombinanti 13,14. Un altro metodo promettente per la derivazione del libero-transgene IPSC è l&#39;uso di costrutti riprogrammazione lentivirali loxP modificati e la successiva eliminazione dei transgeni che utilizzano il sistema di ricombinazione Cre-loxP DNA 15,16. Un approccio più semplice per generare cellule neurali per la terapia di sostituzione cellulare rappresenta conversione diretta dei fibroblasti in neuroni post-mitotico 17-20. Vierbuchen et al. Riferito che la sovraespressione di fattori di trascrizione Ascl1, Brn2 e Myt1l risultati nella generazione di 20% neuroni da fibroblasti murini 17. Nel 2011 è stato dimostrato, che gli stessi tre fattori di trascrizione in combinazione con sovraespressione di NeuroD1 permettono transdifferenziazione di fibroblasti umani in neuRons 19. Umani indotta neuroni potrebbero essere generati anche da sovraespressione di Ascl1 e Ngn2 sotto dual SMAD- e GSK3β- inibizione 20. In particolare, la conversione diretta dei fibroblasti in neuroni genera una popolazione di cellule post-mitotico non proliferativa che non consente ulteriori espansioni e biobanche. Recentemente, la conversione diretta dei fibroblasti in una popolazione di cellule neurali staminali / progenitrici proliferazione è stato segnalato 21-26. Per motivi di chiarezza, tutti questi tipi cellulari saranno nominati come cellule progenitrici neurali indotte (iNPCs) in questo rapporto. Han et al. Sovraespresso Brn4, Sox2, c-Myc e Klf4 per generare iNPCs. Come i loro omologhi di cellule staminali neurali derivate da cellule o tessuti primaria o pluripotenti questi iNPCs sono tripotential e potrebbero essere differenziate in neuroni, astrociti e oligodendrociti 21. Il nostro gruppo ha un protocollo di conversione leggermente diversa che coinvolge sovraespressione di Sox2, Klf4E c-Myc e indotta Oct4-espressione per 5 giorni soltanto. Con questo approccio si potrebbe generare stabilmente proliferanti iNPCs da murine embrionali e adulte fibroblasti che presentano completo silenziamento della riprogrammazione fattori 22. In contrasto con iPSCs, iNPCs non presentano un potenziale cancerogeno dopo il trapianto 27. Abbiamo usato le cellule convertito con successo in un modello animale di demielinizzazione, ratti privi di mielina, dimostrando che iNPCs sono clinicamente utili 22. Fino ad allora, gli NPC possono essere generati solo da cellule staminali pluripotenti o tessuto neurale primaria 28-32. iNPCs sono cellule stabilmente espandibili che possono essere crioconservati e sono in grado di differenziarsi in neuroni, astrociti e oligodendrociti. Sono stati compiuti molti sforzi per adattare il protocollo conversione diretta da mouse per cellule umane 23,26,33,34. Nel 2012 è stato pubblicato che la sovraespressione del singolo fattore Sox2 nei fibroblasti è sufficiente a generare murine e umane iNPCs <sup&gt; 33. Gli autori hanno riferito generazione di iNPCs umani da fibroblasti prepuzio fetali e caratterizzati dalla colorazione contro Sox2 e Nestin. Tuttavia, le cellule bersaglio utilizzate per la riprogrammazione rappresentano un particolare tipo di cellule che non sarà disponibile nella pratica clinica e non vi era alcuna caratterizzazione funzionale delle cellule trasformate da trapianto in un modello animale eseguita. Una pubblicazione più recente descrive la generazione dei progenitori neuronali ristrette da fibroblasti fetali umane da sovraespressione di Sox2, c-Myc e sia Brn2 o Brn4 34. Le linee di cellule generate hanno mostrato capacità di auto-rinnovamento e potrebbero essere differenziate in vari tipi di neuroni terminali. Tuttavia, l&#39;utilizzo di fibroblasti fetali è sfavorevole, poiché queste cellule sono di origine eterogenea e non si può escludere la presenza di residui esempio, cellule staminali della cresta neurale nei preparati. Nel 2014, Zhu et al. Riportarono la conversione diretta di umano adulto e neonatale fibroblasti in cellule progenitrici neurali tripotential di sovraespressione di Sox2 insieme con Oct4 o Oct4 da solo e l&#39;aggiunta di piccole molecole ai media di coltura cellulare. In particolare, in base al loro studi Sox2 solo non era sufficiente per indurre conversione diretta 26. Più recentemente, Lu et al., Ha riferito che la sovraespressione della Yamanaka fattori Oct4-, Sox2-, Klf4-, c-Myc dal virus Sendai per 24 ore e successiva inattivazione del virus da un aumento di temperatura risultati nella generazione di espandibile neurale tripotential cellule precursori 23. In conclusione, anche se i protocolli di conversione pubblicati per le cellule umane finora hanno in comune la sovraespressione di almeno uno o più dei fattori Yamanaka, spesso in modo tempestivo ristretta, non vi è alcuna chiara indicazione dei fattori molecolari minimi necessari per guidare diretta conversione in iNPCs. La sovraespressione tempestivo limitato di Oct4 genetici, con mezzi, trasfezione con mRNA sintetico, oppure cproteine ​​ell permeanti insieme con l&#39;espressione costitutiva di Sox2, Klf-4, e c-Myc, non ha dato luogo a linee umane stabili INPC ancora. Pertanto, l&#39;applicazione di virus Sendai a overexpress tutti fattori Yamanaka e tempestive limitare la loro attività mediante inattivazione termica del virus 23 unitamente alle condizioni di induzione neurale multimediali ottimizzate 22,31 rappresenta la strategia preferita finora. Diversi studi dimostrano la funzionalità cellulare di cellule staminali neurali o dei loro omologhi differenziate in diversi modelli di malattie degli animali. Progenitori neurali da cellule staminali umane pluripotenti sono state trapiantate in modelli murini della malattia neuroinfiammatoria sclerosi multipla 35,36. L&#39;applicabilità di cellule progenitrici neurali hESC-derivati ​​in EAE (encefalomielite autoimmune sperimentale) -mice stato mostrato nel 2008 35. Cellule precursori neurali multipotenti sono state iniettate nei ventricoli del cervello di topo, e il risultato del trapiantocato nella riduzione dei segni clinici di EAE. Kim et al. Generato precursori oligodendrogliali di hESC e trapiantato quelli intracerebroventricolare in EAE-topi. Anche se il trapianto non sopravvissero per più di 10 giorni, i topi hanno mostrato un miglioramento significativo della funzione neurologica e la riduzione delle cellule immunitarie proinfiammatorie nella sostanza bianca 36. Terapia con cellule staminali è stato applicato anche per il targeting preclinico della malattia di Parkinson come PNG potrebbero essere impiegati con successo nei rispettivi modelli animali. Per questo, le cellule progenitrici sono stati derivati ​​da tessuto cerebrale fetale 37 differenziate da cellule staminali pluripotenti 38-40 o cellule staminali mesenchimali 41 sono state usate. Nel 2012 abbiamo dimostrato che iNPCs mouse sono in grado di produrre la proteina proteolipid, la principale componente proteica mielina, dopo il trapianto nel cervello di mielina-deficienti (md) ratti 22. Con questo esperimento prova di principio del applicabil terapeuticalità di iNPCs primo luogo è stato provato e subito confermata da un altro studio 32. Tuttavia, il pieno potenziale di uso terapeutico di iNPCs umani rimane da esplorare. Qui vi mostriamo un processo affidabile e integrata di (i) derivazione di cellule primarie umane da pazienti adulti tramite biopsia della pelle, (ii) la conversione diretta di fibroblasti umani in uno stato progenitore neuronale e (iii) la capacità di iNPCs essere differenziati in neuronale e lignaggi gliali. L&#39;utilizzo di questo protocollo contribuirà ad accelerare la generazione di cellule umane autologhe per applicazioni terapeutiche.

<table><tbody><tr><td>Terreni per astrociti</td><td>ScienCell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>LifeTechnologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia</td><td>pfm medical</td><td>48301</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A6885</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon medchem</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi Type2</td><td>Worthington Biochimico</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Dispasi</td><td>PAN</td><td>P10-032100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>LifeTechnologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>LifeTechnologies</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roth</td><td>4720</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>LifeTechnologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom AG</td><td>50115</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>GFAP-anticorpo</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>LifeTechnologies</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>hLIF</td><td>Peprotech</td><td>300-05</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Seralab</td><td>GEM-700-112-P</td><td></td></tr><tr><td>Ki67-anticorpo</td><td>NeoMarkers</td><td>RM-9106-S</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>LifeTechnologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>LifeTechnologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nestina-anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>LifeTechnologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>LifeTechnologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Mezzi di congelamento NSC</td><td>Sigma</td><td>C6295</td><td></td></tr><tr><td>Oct4-anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc9081</td><td></td></tr><tr><td>Pax6-anticorpo</td><td>Covance</td><td>PRB-278P</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Invivogen</td><td>inh-sb43</td><td></td></tr><tr><td>Virus Sendai: Kit di riprogrammazione CytoTune Sendai</td><td> LifeTechnologies</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Sox1-anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>AF3369</td><td></td></tr><tr><td>Sox2-anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>MAB2018</td><td></td></tr><tr><td>T3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-205725</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>TUJ1-anticorpo</td><td>Covance</td><td>MMS-435P-250</td><td></td></tr><tr><td>Vitamina C</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Calbiochem</td><td>CAS 146986-50-7</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanolo</td><td>LifeTechnologies</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) da fibroblasti cutanei adulti e la successiva differenziazione in cellule somatiche fornisce prospettive affascinanti per la derivazione dei trapianti autologhi che aggirano le barriere di istocompatibilità. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e la successiva differenziazione completa in linee desiderati rimane un posto di blocco per la traduzione clinica della tecnologia IPSC a causa del potenziale neoplastico e genomica instabilità associata. Recentemente, noi e gli altri dimostrato che le cellule somatiche non possono essere convertiti in iPSCs ma anche in diversi tipi di cellule staminali somatiche multipotenti solo utilizzando fattori definiti, eludendo così la progressione attraverso lo stato pluripotente. In particolare, la conversione diretta di fibroblasti umani in cellule progenitrici neurali indotte (iNPCs) prelude alla possibilità di una fonte di cellule autologhe romanzo per varie applicazioni come la sostituzione delle cellule, modelli di malattiae lo screening di stupefacenti. Qui, descriviamo l&#39;isolamento di adulti fibroblasti primari umani da biopsia cutanea e la loro conversione diretta efficace in iNPCs di espressione tempestivo ristretto di Oct4, Sox2, Klf4, così come c-Myc. Colonie neuroepiteliale Sox2-positivi compaiono dopo 17 giorni di induzione e linee INPC possono essere stabiliti in modo efficiente isolamento monoclonale ed espansione. Regolazione precisa della molteplicità di infezione virale e l&#39;integrazione della leucemia fattore inibitorio durante la fase di induzione rappresentano fattori critici per raggiungere efficienze di conversione fino al 0,2%. Finora, le linee INPC specifici del paziente potrebbero essere ampliati per più di 12 passaggi e uniforme mostrano caratteristiche morfologiche e molecolari delle cellule staminali / progenitrici neurali, come l&#39;espressione di nestina e Sox2. Le linee INPC possono essere differenziate in neuroni e astrociti come giudicato dalla colorazione contro TUJ1 e GFAP, rispettivamente. In conclusione, riportiamo un protocollo robusto per la derivazione e terribileconversione ct di fibroblasti umani in cellule progenitrici neurali stabilmente espandibili che potrebbero fornire una fonte cellulare per applicazioni biomediche come autologo sostituzione delle cellule neurali e modelli di malattia.

Qui vi presentiamo una descrizione di un processo integrato che permette la generazione di cellule indotte neurali progenitrici (iNPCs) da fibroblasti umani che sono stati ottenuti da una biopsia di pelle in meno di 8 settimane (Figura 1). INPCs paziente-specifc possono essere ulteriormente differenziati in lignaggi neuronali e gliali e porto un enorme potenziale per la terapia di sostituzione cellulare e modelli di malattia. L&#39;infezione dei fibroblasti con Oct4-, Klf4-,...

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte fornisce prospettive affascinanti per la derivazione di trapianto autologo. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e laborioso ri-differenziazione impedisce ancora di traduzione clinica. Qui si descrive la derivazione di fibroblasti umani adulti e la loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali indotte e la successiva differenziazione in linee neurali.

Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

L'obiettivo generale di questa procedura è abbreviare l'approccio classico Yamanaka IPS generando direttamente cellule progenitrici neurali indotte da una biopsia cutanea del paziente per applicazioni terapeutiche. Ciò viene realizzato innanzitutto eseguendo una biopsia a punzone sul paziente per ottenere cellule fibroblastiche primarie coltivabili in vitro. Il secondo passaggio consiste nell'espandere e successivamente infettare i fibroblasti coltivati con virus che codificano fattori di riprogrammazione per indurre una trasdifferenziazione.Successivamente, le colonie di cellule progenitrici neurali indotte putative convertite, o INPC, devono essere selezionate attentamente mediante validazione visiva e successivamente isolate mediante picking manuale circa 20 giorni dopo l'infezione. L'ultimo passaggio consiste nel clonare monoclonalmente le IPC e nell'espanderle in un mezzo di induzione neurale; infine, viene effettuata una differenziazione in vitro mirata e viene utilizzata la microscopia a immunofluorescenza per dimostrare che le IPC direttamente convertite dal paziente sono in grado di differenziarsi in cellule neuronali e gliali, rendendole così una fonte praticamente illimi

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Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione di neuroblasti pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di progenitori neuronali umane e tipi di cellule neuronali nel sistema nervoso centrale per lo sviluppo neurale riparazione.

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Questo video mostra una tecnica per isolare le cellule progenitrici neurali indotte (iNPC) derivate da fibroblasti umani adulti. Delinea le fasi dell'isolamento delle colonie di iNPC e della loro coltura in pozzetti a piastre multipozzetto rivestiti di laminina in presenza di terreni di coltura adeguati che facilitano la continua proliferazione ed espansione della popolazione di iNPC.

Isolamento di colonie di cellule progenitrici neurali indotte derivate da fibroblasti umani adulti

Questo video mostra il processo di differenziazione delle cellule progenitrici neurali indotte (iNPC) in neuroni e astrociti utilizzando mezzi specializzati.

Differenziazione delle cellule progenitrici neurali indotte in astrociti

Il video dimostra la generazione di neuroni da fibroblasti dermici umani adulti (aHDF). Gli aHDF vengono riprogrammati utilizzando un vettore lentivirale che trasporta geni per fattori di trascrizione neuronale e RNA a forcina corta (shRNA). Gli shRNA inibiscono l'espressione di un repressore trascrizionale neuronale e i fattori di trascrizione neuronale attivano i geni per differenziare gli aHDF in neuroni. Questi aHDF riprogrammati vengono coltivati in un mezzo di conversione neuronale...

Generazione di neuroni riprogrammando le cellule dei fibroblasti dermici umani

Riportiamo un metodo per isolare precursori pelle-derivato multipotenti (SKP) cellule naïve da colture primarie di fibroblasti umani. Abbiamo dimostrato che queste SKPs derivati ​​da colture di fibroblasti Share proprietà delle cellule staminali a quelle derivate direttamente da biopsie cutanee umane. Queste cellule esprimono il marcatore cresta neurale, nestin, oltre ai marcatori multipotenti quali OCT4 e Nanog.

Naïve Adult Stem Cells isolamento da colture primarie di fibroblasti umani

Questo protocollo descrive un metodo tagliere meccanico romanzo che consente l'espansione di staminali e cellule progenitrici aggregati sferici neurali senza dissociazione di una sospensione di cellule singole. Mantenere il contatto cellula / cellula consente una crescita rapida e stabile per oltre 40 passaggi.

Un metodo di espansione cGMP-applicabile per Aggregati di neurali umane staminali e cellule progenitrici derivate da cellule staminali pluripotenti o fetale tessuto cerebrale

Targeting cellule cerebrali residente per discendenza diretta-riprogrammazione offre nuove prospettive per la riparazione del cervello. Qui si descrive un protocollo di come preparare le culture arricchito da pericytes cervello residente da adulto corteccia cerebrale umana e convertirli in neuroni indotti dall'espressione retrovirus-mediata dei fattori di trascrizione Sox2 e Ascl1.

Lineage-riprogrammazione di cellule pericyte-derivate del cervello umano adulto in neuroni indotti

Un metodo è stato sviluppato per derivare direttamente le cellule staminali neurali umane da cellule progenitrici ematopoietiche arricchite da cellule del sangue periferico.

Induzione diretta di cellule staminali neurali umane da cellule periferiche del sangue emopoietiche progenitrici

Riprogrammazione neuronale diretto genera neuroni che mantengono l'età della cellula somatica partenza. Qui, descriviamo un metodo basato su vettori per generare neuroni indotti dai fibroblasti cutanei ottenuti da donatori umani adulti.

Semplice generazione di una cultura ad alto rendimento dei neuroni indotti da fibroblasti umani della pelle adulta

La riprogrammazione cellulare richiede l'introduzione di geni chiave, che regolano e mantengono lo stato cellulare pluripotente. Il protocollo descritto consente la formazione di colonie di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da fibroblasti dermici umani senza metodi virali/integranti, ma utilizzando RNA non modificati (NM-RNA) combinati con fattori di evasione immunitaria che riducono i meccanismi di difesa cellulare.

Isolamento di fibroblasti dermici umani adulti dalla pelle addominale e generazione di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un metodo non integrato

Descriviamo un protocollo per riprogrammare i fibroblasti derivati dalla pelle umana in cellule progenitrici neuronali indotte (INPC) e la loro successiva differenziazione in Astrociti indotti (iA). Questo metodo porta a una generazione rapida e riproducibile di iNPC e iA in grandi quantità.

Modellazione in vitro per malattie neurologiche utilizzando la conversione diretta dai fibroblasti alle cellule progenitrici neuronali e la differenziazione in astrociti

Scopri la conversione diretta di fibroblasti umani in progenitori neurali indotti per applicazioni terapeutiche. Questo metodo accelera la generazione di cellule neuronali e gliali specifiche per paziente.

Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

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