Applicazione di lungo termine colta interferone-γ Enzyme Linked immunospot Assay per la valutazione effettori e memoria delle cellule T risposte a Bovino

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di valutare sia le risposte delle cellule T effettrici che quelle delle cellule T di memoria utilizzando rispettivamente saggi spot di interferone gamma L in coltura a breve e lungo termine. La valutazione della risposta della memoria centrale viene effettuata coltivando cellule mononucleate del sangue periferico bovino sotto stimolazione antigenica per 13 giorni. La coltura a lungo termine consente il verificarsi e il declino delle risposte delle cellule T effettrici.

L'interleuchina due viene aggiunta alle colture per il mantenimento delle cellule T di memoria. Il giorno 13, le cellule a lungo termine vengono trasferite su piastre spot L rivestite con anticorpo a cattura gamma IFN. La risposta delle cellule a lungo termine ai singoli antigeni micobatterici viene valutata in presenza o in assenza di cellule presentanti l'antigene autologo.

APC LE APC vengono isolate da p BMC fresche mediante adesione al giorno 13. Inoltre, la risposta del pbmc appena isolato in condizioni ex vivo è valutata come correlata delle risposte effettrici. In diversi studi, è stato dimostrato che la risposta bovina a lungo termine in coltura di sbot agli antigeni micobatterici dopo la vaccinazione è correlata positivamente con l'efficacia del vaccino.

Inoltre, le colture di cellule T a lungo termine contengono principalmente cellule T di memoria centrale sia nell'uomo che nei bovini Al fine di eseguire il test del punto L coltivato a lungo termine. 60 ml di sangue vengono raccolti da animali infetti o vaccinati da m bovis mediante giugulare, venipuntura e P BMC vengono isolati per densità. Centrifugazione in gradiente.

La concentrazione cellulare deve essere regolata a 4 milioni di cellule per ml. In RPMI Media completo iniziare con la piastratura di 500 microlitri di antigeni microbatterici, in questo caso TB 10.4 e antigene 85 A e il derivato proteico purificato della coltura di em bovis chiamato PPDB. Quindi aggiungere 500 microlitri di pbmc isolato da ciascun animale con quattro repliche per animale.

Si noti che tutti i pozzetti devono essere stimolati. In questa fase non sono necessari controlli come l'assenza di stimolazione o di mitogeni, incubare la piastra a 39 gradi Celsius, la temperatura normale del bestiame, per 13 giorni. Il terzo e il settimo giorno, scartare con cura 500 microlitri da ciascun pozzetto pipettando per non disturbare lo strato cellulare sul fondo dei pozzetti.

Riempi il volume con un PMI completo contenente IL Two. Posizionare la piastra nell'incubatore Il giorno 10, scartare 750 microlitri di surnatante da ciascun pozzetto, rabboccare con RPMI completo senza alcun IL due il giorno 12, pipettare e scartare un ml di surnatante da ciascun pozzetto reintegrato con RPMI completo senza IL due. Preparare anche la piastra spot L da rivestire con l'anticorpo IFM Gamma Capture prima pipettare 15 microlitri di alcol al 35% in ciascun pozzetto utilizzando un pipettatore multicanale; questo passaggio aumenta la definizione dello spot.

Lavare bene sei volte con 300 microlitri di PBS. Aggiungere 100 microlitri di anticorpo di cattura a otto microgrammi per ml in PBS. Il pipettaggio deve essere eseguito con attenzione durante tutte le procedure, evitando che i puntali delle pipette tocchino o danneggino la membrana sul fondo del pozzetto, posizionare la piastra all'interno di un sacchetto di plastica e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte.

Il giorno 13, raccogliere 60 ml di sangue mediante puntura della vena giugulare dagli stessi animali campionati il primo giorno. Isolare il pbmc e regolare la concentrazione a 2 milioni di cellule per ml. Etichettare correttamente la piastra spot L per ogni serie di campioni.

Cellule a lungo termine più APC, cellule a lungo termine senza APC e cellule ex vivo. Eliminare l'anticorpo di cattura dai pozzetti di lavaggio della piastra spot Ellis con 300 microlitri di PBS contenente tween. Ripetere sei volte, gettare, lavare il liquido e pipettare.

50 microlitri di p BMC appena isolati nei pozzetti assegnati alle cellule a lungo termine. Più APC. Bloccare altri pozzetti della piastra del punto L con 200 microlitri per pozzetto di RPMI completo Per valutare il fenotipo delle cellule mediante citometria a flusso in parallelo con la piastra del saggio del punto L.

50 microlitri di cellule appena isolate in una piastra a 96 pozzetti a fondo tondo adeguatamente etichettata. Si tratta di un test ausiliario da eseguire in combinazione con il test della macchia gialla per determinare il fenotipo delle cellule che rispondono. Incubare le piastre per 90 minuti a 39 gradi Celsius in un incubatore al 5% di CO2, consentendo alle cellule presentanti l'antigene di aderire.

Incubare anche 200 ml di RPMI completo per riscaldarlo durante questa fase di incubazione di 90 minuti. Raccogli le cellule coltivate a lungo termine dalla piastra a 24 pozzetti. Combinando i duplicati quadrupli di ciascun animale in un unico tubo conico da 15 mil.

Centrifugare le provette per cinque minuti a 400 Gs.Scartare il surnatante mediante inversione della provetta, rimuovere il pellet cellulare e aggiungere cinque ml di PBS, risospendere delicatamente il pellet se necessario. Lavare le celle due volte e quindi regolare la concentrazione delle cellule a 200.000 cellule per ml. Dopo l'incubazione di 90 minuti, prelevare la piastra LPO e l'RPMI completo dall'incubatrice.

Posizionare la piastra LPO su uno shaker per 30 secondi. Quindi rimuovere le cellule non aderenti mediante pipetta a inversione di piastra da 150 microlitri per pozzetto di RPMI completo caldo. Agitare la piastra ed eliminare il liquido di lavaggio.

Ripetere tre volte, scartare quanto più liquido possibile e aggiungere un centinaio di microlitri per pozzetto di ciascun antigene negli appositi pozzetti contenenti APC aderenti. Quindi pipettare 100 microlitri per pozzetto di sospensione cellulare in coltura a lungo termine. 200.000 cellule per ML nei pozzetti etichettati come cellule a lungo termine più APC.

Assicurati che le cellule a lungo termine aggiunte in questa fase provengano dallo stesso animale delle APC già presenti nel pozzetto. Non mischiare APC e cellule coltivate a lungo termine di animali diversi. Inoltre, pipettare 100 microlitri per pozzetto di sospensione cellulare coltivata a lungo termine a una concentrazione di 200.000 cellule per ml in pozzetti senza APC per valutare le risposte a lungo termine.

In assenza di presentazione dell'antigene, aggiungere 100 microlitri per pozzetto di cellule a breve termine, più appena isolate e aggiustate a 2 milioni di cellule per ML per la valutazione della risposta ex vivo. Se si esegue l'analisi di citometria a flusso, lavare il fondo rotondo 96, la piastra a pozzetti e aggiungere le cellule e gli antigeni appena isolati a lungo termine ai pozzetti seguendo le stesse procedure. Impiegato per la piastra IFN Gamma LPO Incubare le piastre durante la notte a 39 gradi Celsius in un incubatore al 5% di CO2.

Assicurati che i piatti siano piatti e non impilare i piatti il giorno 14. Eliminare i liquidi dai pozzetti e lavare le piastre sei volte con 300 microlitri per pozzetto di PBS contenente l'interpolazione, posizionandoli sull'agitatore per piastre ogni volta per 10 secondi prima e tra un lavaggio e l'altro. Quindi lavare una volta con lo stesso volume di acqua distillata e altre sei volte con PBS contenente interpolazione.

Infine, lavare le celle due volte con 300 microlitri per pozzetto di PBS. Rimuovere il liquido di lavaggio picchiettando la piastra su carta assorbente o tamponi assorbenti. Aggiungere 100 microlitri per pozzetto di anticorpo di rilevazione a cinque microgrammi per ml diluito in PBS con albumina sierica bovina all'1%.

Incubare le piastre per 120 minuti a 39 gradi Celsius. Durante questa fase di incubazione, preparare la soluzione di fosfatasi alcalina dallo standard del kit VTA stain A BC AP seguendo le istruzioni del produttore 30 minuti prima dell'uso o 90 minuti dopo l'aggiunta dell'anticorpo di rilevamento ai pozzetti. Diluire il reagente in PBS contenente tween dopo 120 minuti di incubazione, scartare l'anticorpo di rilevamento mediante inversione di piastra, lavare le piastre sei volte con 300 microlitri per pozzetto di PBS contenente tween.

Rimuovere il liquido di lavaggio picchiettando la piastra su carta assorbente. Quindi aggiungere 100 microlitri per pozzetto di soluzione di fosfatasi alcalina. Incubare le piastre per 45 minuti a temperatura ambiente.

Eliminare il liquido e lavare ogni piastra sei volte con PBS contenente interpolazione. Preparare la soluzione del substrato dal kit vector blue AP substrato tre seguendo le istruzioni del produttore. Diluire i reagenti in tampone tris HCL 0,1 molare a pH 8,2.

Pipettare 50 microlitri di substrato D.Ogni pozzetto incubare a temperatura ambiente fino a quando il colore blu inizia a svilupparsi circa 30 minuti. Scartare il liquido e lavare le piastre con abbondanti quantità di acqua distillata. Rimuovere la piastra inferiore per esporre la parte posteriore di lavaggio della membrana dei pozzetti e lasciare asciugare la piastra all'aria.

Misurare la risposta utilizzando un analizzatore di immagini immuno spot o tenere le piastre al buio a temperatura ambiente fino a quando la risposta non viene misurata. Grazie all'elevata stabilità della reazione, la qualità del substrato viene preservata per diversi anni. Se si valuta il fenotipo e la risposta delle citochine mediante citometria a flusso, eseguire le procedure di colorazione standard delle cellule piatte sul fondo rotondo 96, vengono mostrate le TCM rappresentative della piastra in presenza o assenza di APC, le risposte del punto gamma L dell'IFN ex vivo presidiate da animali infetti e animali non infetti.

Le risposte specifiche a m bovis sono valutate mediante stimolazione antigenica PBDB o ESAT six, CFP 10. Le macchie sul fondo delle piastre sono il prodotto colorato del saggio delle macchie gialle. Ogni punto rappresenta tipicamente una singola cellula produttrice di citochine, fornendo una misura quantitativa della produzione di IFN gamma da parte delle cellule T con cellule di animali infetti.

Le risposte spot a lungo termine dell'IFN gamma L, presentate come cellule formanti macchie o SFC, sono chiaramente visualizzate: poca o nessuna produzione di IFN gamma in risposta alla stimolazione dell'antigene si osserva con cellule di bovini non infetti e con cellule non stimolate di bovini infetti o non infetti. Una robusta risposta delle cellule T dovrebbe verificarsi in risposta al mitogeno poke weed come mostrato dalla TCM e dalle risposte ex vivo a PPDB ed ESAT sei. CCFP 10 sono stati rilevati da tutti gli animali infetti da 3M bovis e sono state rilevate risposte minime o nulle di MTC ed ex vivo dall'animale di controllo.

La presenza di APC era necessaria per risposte ottimali alla MTC da parte degli animali infetti, come dimostrato dalle risposte notevolmente ridotte delle cellule coltivate a lungo termine. In assenza di APC autologhe, sono state presentate cellule formanti macchie da embrion, bovis e animali non infetti. Il numero di SFC di ciascun animale è stato calcolato in base a un numero medio di SFC da 10 a una sesta cellula in campioni duplicati in risposta a PPDB meno la rispettiva risposta alle sole risposte dei terreni differiva in base allo stato di infezione, alla presenza o all'assenza di APC e alla lunghezza della coltura, cioè la coltura a lungo termine rispetto alla coltura ex vivo.