In Situ rilevamento di batteri all'interno dei tessuti in paraffina utilizzando una sonda DNA Digossina marcato targeting 16S rRNA

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di localizzare i batteri all'interno di tessuti inclusi in paraffina utilizzando sonde di DNA mirate a 16 s ribosomiale marcate con DIG. Ciò si ottiene preparando prima la sonda con l'amplificazione PCR e la marcatura DIG. Il secondo passo consiste nel preparare le sezioni di tessuto in modo da avere siti target più accessibili e meno legami di fondo.

Successivamente, le sezioni di tessuto preparate vengono ibridate con la sonda marcata DIG. Infine, la sonda ibridata viene rilevata con fosfatasi alcalina, marcata con anticorpi anti-D dig. In definitiva, questo metodo di ibridazione in C 2 può mostrare la presenza di batteri con tessuti inclusi in paraffina.

Il vantaggio di dominio di questo metodo di rilevamento rispetto a quello esistente come l'ING è che questo metodo è in grado di rilevare i batteri SHS nel contesto di alcune strutture istologiche. Questo metodo può fornire informazioni sulla patogenesi, ma sarà vari infiammatori come la parodontite e il pianeta R. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di preparazione dei tessuti e digestione ibrida sono difficili da eseguire perché le sezioni di tessuto si danneggiano facilmente.

Per realizzare la sonda per batteri U, utilizzare una coppia di 70 basi, un frammento di DNA come modello e due primer da 15 coppie di basi per amplificare la sonda mediante PCR. Raccogliere l'amplicone nel tampone a una concentrazione nota. Quindi etichettare la sonda con un kit di etichettatura e rilevamento del DNA dig

Per prima cosa mescolare tre microgrammi di sonda in 15 microlitri di acqua. Denaturare la sonda nel blocco termico per 10 minuti a 95 gradi Celsius. Quindi mettere la sonda denaturata sul ghiaccio.

Quindi, aggiungi due microlitri di 10 nucleotidi XH, due microlitri di DN NTP e un microlitro di enzima canale. Una volta miscelata, lasciare incubare la sonda a 37 gradi Celsius per 24-48 ore dopo. Arrestare la reazione riscaldando la miscela a 65 gradi Celsius.

Quindi misurare la concentrazione di DNA della sonda marcata a 260 nanometri e regolare una concentrazione a 100 nanogrammi per microlitro. Utilizzando il kit, controllare prima la sensibilità delle sonde su una membrana di nylon caricare un microlitro di controllo positivo diluito in serie. Sonda e sonda etichettata DIG

Lasciare asciugare la membrana per cinque minuti. Una volta asciugata, immergere brevemente la membrana in due XSSC e poi trasferirla in un'incubatrice a 80 gradi Celsius per un'ora. Per immobilizzare il DNA dopo l'incubazione, immergere brevemente la membrana in tampone di acido maleico, quindi trasferirla in tampone bloccante concentrato con anticorpi coniugati AP a una diluizione da uno a 5.000 dopo mezz'ora.

Lavare la membrana in MABT. Quindi mescolare 40 microlitri di N-B-T-B-C-I-P in due millilitri di tampone di rilevamento. E dopo il bagno, aggiungi questa miscela alla membrana per un minuto.

Dopo aver rimosso la paraffina e reidratato le sezioni di tessuto come descritto nel protocollo di testo, prepararle per l'ibridazione C due, immergere prima i vetrini in acido cloridrico normale 0,1 per 20 minuti. Dopo il bagno acido, lavare via i vetrini con acqua trattata con DEPC per 30 secondi. Quindi, utilizzando una penna a cera, delineare i campioni su ogni vetrino.

Successivamente, aggiungere da 50 a 400 microlitri di soluzione di proteinasi K ai campioni, a seconda delle loro dimensioni. Lasciare agire l'enzima per 30 minuti a 37 gradi Celsius, quindi lavare i vetrini in DEPC trattato con un XPBS per un minuto. Trasferire ora i vetrini all'aldeide paraforme al 4% in PBS trattato con DEPC per 10 minuti.

Lavare via il fissativo con PBS come prima. Quindi bagnare i vetrini in trietanolammina cloridrato 0,1 molare a pH otto con 0,5% di acetico e idruro dopo 20 minuti, lavare via i vetrini con acqua pulita come prima. Ora inizia il secondo in C immergendo prima le diapositive in due XSSC per 20 minuti.

Nel frattempo, diluire la sonda marcata a un nanogrammo per microlitro in tampone di ibridazione per un controllo negativo. Utilizzare una concentrazione 10 volte superiore a quella della sonda non etichettata. Quindi denaturare le sonde riscaldandole a 90 gradi Celsius per 10 minuti, quindi raffreddandole rapidamente su ghiaccio.

Successivamente, applicare su ciascun vetrino lo stesso volume di diluizione della sonda della proteinasi K precedentemente applicata. Quindi copri accuratamente lo slip e sigilla le sezioni usando lo smalto per unghie. Ora, riscalda i vetrini su un blocco di macchina PCR a 90 gradi Celsius per 10 minuti e trasferiscili in un incubatore umidificato a 45 gradi Celsius durante la notte del giorno successivo.

Raffreddare i vetrini a quattro gradi Celsius per mezz'ora, quindi rimuovere con cura i vetrini coprioggetti. I tessuti sono fragili. Infine, passare i vetrini attraverso una serie di tampone SSC a temperatura ambiente.

Per prima cosa, lavare i due vetrini ibridati NC per cinque minuti in MABT. Quindi applicare da 50 a 400 microlitri di soluzione bloccante all'1% tra 20 per 20 minuti. Dopo l'incubazione a blocchi, applicare da 50 a 400 microlitri di uno a 1000 anticorpi anti-D dig fosfatasi alcalina e soluzione bloccante.

Lasciare legare per 90 minuti a 37 gradi Celsius dopo l'applicazione del primario. Lavare i vetrini in MABT per 10 minuti. Quindi, per cinque minuti, mettere i vetrini nel buffer di rilevamento con l'1%tween 20.

Applicare ora da 50 a 400 microlitri di un millimolare in soluzione tampone di rilevamento su ciascun vetrino e incubarli per cinque minuti per inattivare la fosfatasi alcalina endogena. Successivamente, aggiungere da 50 a 400 microlitri di N-B-T-B-C-I-P diluito in rivelazione. Tamponare da uno a 100 per ogni vetrino e lasciare incubare i vetrini per due o tre ore in una camera umidificata in base all'esperienza.

Sciacquare i vetrini con acqua deionizzata, quindi applicare il verde metile allo 0,05% in peso in volume e lasciare agire la macchia di contrasto sul tessuto per 10 minuti. A 37 gradi Celsius. Lavare nuovamente i vetrini con acqua deionizzata e poi disidratarli con etanolo al 100%, seguito da un tuffo nello xilene.

Infine, applicare 80 microlitri di supporto di montaggio e vetrino coprioggetto. Le diapositive dopo le sonde sono state etichettate come scavo. La loro sensibilità è stata confrontata con la diluizione della sonda di controllo positivo.

La sonda specifica per gengivale da 3 43 coppie di basi era 25 volte più sensibile della sonda batterica ingegnerizzata da 70 coppie di basi. Le due sonde sono state poi applicate ai tessuti gengivali di pazienti con parodontite cronica ad alto ingrandimento. Le varie forme di batteri erano distinguibili utilizzando la sonda batterica.

Mentre la sonda specifica p gingivalis ha rilevato solo batteri a forma di bastoncello, sulla mucosa gengivale dei topi è stata applicata una giunzione stretta che interrompe la DSS chimica. I campioni di tessuto di questi topi sono stati utilizzati per confrontare le sonde in un contesto diverso. Qui, la sonda batterica U è stata in grado di rilevare i batteri che l'altra non poteva.

La sonda per batteri U è stata successivamente testata per la sua capacità di rilevare altri batteri in sezioni di tessuto polmonare contenenti tumori. I batteri sono stati rilevati sia all'esterno del tumore che all'interno del tumore. Nell'esame dei tessuti di pazienti con malattia del lichen planus orale, un'eziologia sconosciuta, la sonda batterica ha rilevato segnali batterici all'interno delle cellule dell'epitelio e della lamina propria dove è stata osservata un'infiltrazione infiammatoria.

Fin dal suo sviluppo, questa tecnica ha aiutato i ricercatori nel campo delle malattie infettive a esplorare l'invasione dei batteri nei tessuti sia nell'uomo che negli animali Seguendo questa procedura. Altri metodi, come il rilevamento immunochimico, la crescita al marcatore cellulare possono essere erettili per rispondere a ulteriori domande, come il tipo di cellule che ospitano i batteri all'interno dei tessuti.