Name: Iniezioni intramuscolari Lungo le piastre Motor finale: un approccio mini-invasivo di navetta Tracers Direttamente nella Motor Neurons (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Scopri un metodo mini-invasivo per iniettare traccianti retrogradi lungo le piastre motorie finali nei muscoli scheletrici. Questa tecnica ottimizza il trasporto ai motoneuroni spinali per studi di neuroanatomia.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un Centro di Ricerca Nazionale Salute e medicina (NHMRC) progetto di sovvenzione a RM

Tutte le procedure sperimentali qui descritte conformi alla Cura e Comitato Etico degli animali di UNSW Australia e sono stati eseguiti in conformità con il Servizio Sanitario Nazionale e il Medical Research Council of Australia regolamenti per la sperimentazione animale. Tutte le procedure di questo protocollo devono essere effettuate in conformità ai requisiti del proprio comitato Animal Care and Ethics. 1. Acetilcolinesterasi istochimica colorazione <ol><li> Preparare la miscela di reazione Acetilcolinesterasi <ol><li> Aggiungere 290 mg di acetiltiocolina ioduro a 200 ml di tampone fosfato 0,1 M (PB). Mescolare con un agitatore magnetico a 900 rpm. </li><li> Aggiungere 600 mg di glicina sotto continua agitazione. </li><li> Aggiungere lentamente 420 mg di solfato di rame alla miscela di reazione sotto agitazione continua fino a quando il prodotto è completamente sciolto. </li></ol></li><li> Togliere la pelle sulla carcassa animale (ottenuto attraverso la condivisione dei tessuti) facendo incisioninella pelle di un ratto o topo perfuso, afferrando la pelle dalla zona del collo e tirandolo oltre i suoi piedi. Assicurarsi che la fascia che copre ogni muscolo o è rimosso o significativamente forato per garantire un&#39;ampia esposizione delle fibre muscolari alla soluzione di reazione. </li><li> Immergere l&#39;intero corpo o di un arto di interesse nella miscela di reazione e incubare O / N a 4 ° C. </li><li> Lavare la carcassa per 2 minuti in acqua distillata. Nota: In questa fase, i muscoli mostrano una colorazione blu e le piastre terminali del motore (MEP) possono essere visti come punti bianchi. </li><li> Esporre la carcassa ad una soluzione di solfuro di ammonio 10% per 3-5 sec. Nota: Le fibre muscolari saranno ben presto diventano marroni e gli eurodeputati saranno osservabili come punti neri macchiati. Se la reazione avviene troppo rapidamente, e le fibre muscolari sono macchiati troppo buio per distinguere tra i deputati e le fibre muscolari provare utilizzando basse concentrazioni di soluzione di solfuro di ammonio (per esempio, 5%). Il tempo di reazione per ottenere laottimale contrasto tra i deputati e le fibre muscolari varia da un campione all&#39;altro. Pertanto è difficile definire il tempo di esposizione esatta al reagente. La reazione deve essere attentamente monitorata e si fermò quando il contrasto è ritenuto adeguato. </li><li> Lavare la carcassa per due volte, con l&#39;agitazione in acqua distillata e tamponare delicatamente la carcassa secca. </li><li> Fotografia sia gli aspetti laterale e mediale degli arti, assicurando che i deputati europei per tutti i muscoli di interesse vengono catturati. </li></ol> 2. intramuscolare iniezioni alle piastre Motor End <ol><li> Tirare micropipette di vetro con un estrattore micropipetta (l&#39;uso di micropipette graduate con pistoni è consigliato). Con l&#39;aiuto di un microscopio da dissezione, rompere le punte delle micropipette con un paio di pinze in modo tale che il diametro interno del lume della micropipetta è circa 0,5 mm. </li><li> Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici utilizzati sono appena sterilizzati in autoclave e thnella zona chirurgica è sterile. </li><li> Riempire le micropipette con Fluoro-oro (5% in acqua distillata). </li><li> Induce anestetizzare l&#39;animale in una camera di induzione con isofluorano (4% in O 2). Verificare la presenza di riflesso di raddrizzamento e di garantire la sua assenza prima di rimuoverlo dalla camera di induzione. Fissare un cono sul muso del topo e fornire isofluorano (2% in O 2) per il mantenimento dell&#39;anestesia. Pinch dita dei piedi degli animali e toccare delicatamente gli occhi dell&#39;animale per garantire che sia il ritiro del pedale e i riflessi corneali sono assenti. Nota: Una miscela di ketamina e xylazil può essere utilizzato anche (80 e 10 mg / kg, rispettivamente, trasportato via intraperitoneale). La ketamina è un allegato 8 (&quot;Controllo&quot;), di droga e protocolli necessari connessi con l&#39;acquisto, l&#39;uso, lo stoccaggio e lo smaltimento del farmaco dovrà essere rispettato. </li><li> Applicare lubrificante occhio per evitare l&#39;essiccazione degli occhi nel corso del procedimento. </li><li> Shave il tarto argeted e uso garza per pulire la zona rasata con tre scrub alternati di clorexidina e il 70% di alcol. Trasferire l&#39;animale per l&#39;area chirurgica. </li><li> Posto l&#39;animale su un underpad pulito e posizionarla in modo appropriato per garantire un buon accesso al muscolo (s) mirato. </li><li> Utilizzare un paio di pinze con le prese dente per sollevare la pelle sopra il muscolo mirato dalla muscolatura sottostante e fare un&#39;incisione nella pelle con le forbici chirurgiche. Assicurarsi che l&#39;incisione è abbastanza grande per esporre completamente i muscoli (s) di interesse. Assicurarsi che vi sia il minimo disturbo per la fascia. </li><li> Utilizzare le fotografie MEP per trasporre mentalmente la posizione e la forma della regione MEP sul muscolo (s). Nota: un pennarello multa potrebbe aiutare a riprodurre la regione eurodeputato dalla fotografia sul muscolo (s) di interesse. </li><li> Eseguire iniezioni multiple lungo la lunghezza della regione MEP (per Fluoro-Gold, 3 o 4 iniezioni di 1-2 ml ogni should essere sufficiente). Pulire delicatamente il muscolo (s) per rimuovere eventuali infiltrazioni. </li><li> Portare le due estremità della pelle incisa ravvicinati con una pinza smussato e chiudere la ferita con clips chirurgiche. Infiltrarsi 0,1 ml Bupivacaine (0,5% in acqua) (o altri anestetici locali) lungo l&#39;intero arco della ferita. </li><li> Spegnere la macchina anestetico fuori e monitorare l&#39;animale fino a quando non è completamente ripreso dall&#39;anestesia. </li><li> Attendere per 14 giorni tra la somministrazione delle iniezioni intra-muscolare e la perfusione degli animali. </li></ol> 3. perfusione <ol><li> Somministrare una dose letale di soluzione di sodio pentobarbitone (es Lethabarb; 150 mg / kg) per l&#39;animale mediante iniezione intraperitoneale. <ol><li> Strettamente monitorare l&#39;animale fino a raggiungere un livello profondo di anestesia, come confermato dall&#39;assenza di ritiro pedale e riflessi corneali. </li></ol></li><li> Posizionare l&#39;animale sulla sua schiena su una tavola di dissezione posto sopra un perfusion lavandino. </li><li> Utilizzare un paio di pinze con le prese dente per sollevare la pelle che ricopre la base dello sterno. Fai una piccola incisione cutanea con un paio di forbici chirurgiche forti immediatamente sotto lo sterno e poi usare il forcipe per afferrare la cartilagine xifoideo dello sterno. Tenendo la cartilagine xifoide, allargare l&#39;incisione su entrambi i lati della cavità toracica, dallo sterno alle ascelle. </li><li> Tagliare il diaframma per esporre il cuore. <ol><li> Iniettare 0.ml di eparina direttamente nella punta del cuore per evitare la coagulazione del sangue. </li><li> Tagliare il vertice per consentire l&#39;inserimento di una cannula nel ventricolo sinistro, e quindi serrare rapidamente la cannula in posizione con l&#39;ausilio di un emostatico. </li><li> Fare un&#39;incisione nell&#39;atrio destro con un paio di forbici fini e iniziare immediatamente la pompa peristaltica. Profumato con 0,1 M PB finché il liquido in uscita dell&#39;atrio è quasi privo di sangue e il colore del fegato diventa marrone chiaro. Poi, profumato con una soluzione di paraformaldeide (4% in 0.1 M PB) finché l&#39;intero corpo dell&#39;animale diventa rigida. </li></ol></li></ol> 4. cervicale midollo spinale Dissection e preparazione per Istologia <ol><li> Posare la carcassa animale sul suo addome. </li><li> Tagliare la pelle in linea mediana del corpo con un bisturi e rifletterla dalla base del cranio al livello dell&#39;osso iliaco. </li><li> Tagliare e riflettere i muscoli paravertebrali per esporre la parte dorsale della colonna vertebrale. </li><li> Identificare il processo spinoso ossea di Atlante, il secondo segmento cervicale (cioè, C2), e rimuoverlo con un paio di pinze chirurgiche o rongeurs per individuare la radice dorsale sottostante corrispondente. <ol><li> Identificare il diritto radice C2 e colorare con un pennarello permanente. </li><li> Rimuovere il prossimo vertebre uno per uno e contrassegnare le radici dorsali destra con colori alternati (cioè, C2, C4, C6, C8 e può essere colorato in verde e C3, C5, C7, T1 può essere colORed in blu). </li></ol></li><li> Usare un piccolo ago chirurgico (ad es, 30 G ago calibro) per forare delicatamente attraverso la dura copre l&#39;estremità inferiore del midollo spinale. Con la smussatura dell&#39;ago rivolto verso l&#39;alto, sollevare la dura madre dal cavo mentre si muove l&#39;ago rostrally per fare una fessura longitudinale. <ol><li> Riflettere la dura. </li></ol></li><li> Tagliare il trasversalmente midollo spinale in blocchi uno o due segmenti con una nuova lama di bisturi. <ol><li> Lasciare i segmenti del midollo spinale in situ e, per ciascun blocco, fare attenzione un piccolo segno fiducial sul lato sinistro di ciascun blocco con metà strada tra due bisturi radici adiacenti. Assicurarsi che il marchio fiducial è abbastanza profonda attraverso il tessuto da essere visibili dalla faccia ventrale dei blocchi. Trasformare il marchio fiducial con un angolo di circa 45 °, indicando sia anteriormente o posteriormente rispetto alla anatomia animale, per facilitare l&#39;orientamento del segmento tissutale conseguente dissezione. </li></ol></li><li> Raccogliere i singoli blocchi in piccoli flaconi chiaramente etichettate contenenti una soluzione di paraformaldeide (4% in 0.1 M PB) e lasciare a RT O / N. </li><li> Trasferire i blocchi in puliti, bottiglie etichettate chiaramente contenenti una soluzione di saccarosio (30% in 0.1 M PB) e conservare a 4 ° C per almeno due giorni. </li><li> Posizionare i segmenti in crio-stampi e ricoperto con terreno di congelamento dei tessuti. Per la preparazione longitudinale istologica, orientare i blocchi con la parte dorsale rivolto verso l&#39;alto e utilizzare il marchio fiduciale per orientare il blocco nella crio-stampi. </li><li> Congelare le crio-stampi a -20 ° C e tagliare con un criostato in 50 sezioni micron di spessore. Nota: Le sezioni possono essere montati direttamente su vetrini da microscopio adesione e lasciati asciugare O / N. In alternativa, le sezioni possono essere galleggiare in piastre 48 pozzetti riempiti con 0.1 M PB e successivamente montati usando il marchio fiduciale di orientare le sezioni di tessuto nelle diapositive. </li></ol> 5. vertebrale lombare Cord dissezione e preparazione per Istologia <ol><li> Posare la carcassa animale sulla sua schiena. </li><li> Eseguire un&#39;incisione mediana lungo l&#39;addome dell&#39;animale e rimuovere le viscere. Sezionare i muscoli della parete addominale posteriore per esporre la parte ventrale della colonna vertebrale. </li><li> Individuare il breve costola caudale-più e la sua adiacente T13 vertebra dove la T13 radice ventrale esce l&#39;osso. <ol><li> Consecutivamente rimuovere uno per uno rostrale due o tre vertebre a T13 (cioè, T12, T11 e, se necessario, T10) con sottili Rongeurs chirurgici per seguire il T13 radice ventrale fino al suo punto di entrata nella parte ventrale del cavo ventrale segnare con un pennarello permanente. </li><li> Da questo punto in poi, ripetere la stessa procedura per identificare la posizione dei punti di ingresso della radice ventrale per L1, L2, L3, L4, L5, L6 e S1, li colorazione con colori alternati. </li></ol></li><li> Seguire la stessa procedura descritta nella sezione 4,5-4,10 per lumbar dissezione del midollo spinale. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il targeting intramuscolare e successivo trasferimento retrograda di transgeni terapeutici ai corrispondenti motoneuroni α per il trattamento sperimentale condizione neuromuscolare non è una nuova strategia. Per esempio, questo metodo di consegna è stato utilizzato per ritardare la degenerazione neuromuscolare in diverse fasi della progressione ALS in topi e ratti 1,9-12 SOD1 nonché nei topi con SMA 13. Mentre promettente, l&#39;efficacia di questi scenari di terapia genica è stata limitata. A ques...

La perdita di controllo del movimento volontario che deriva da condizioni neurologiche come la malattia del motoneurone e spinal- nonché Duchenne atrofia muscolare è una condizione debilitante che ha un impatto elevato e duraturo sulla vita quotidiana di individui affetti. Negli ultimi dieci anni, gli sforzi di ricerca volti a fermare o almeno ritardare gli effetti deleteri di queste malattie neuromuscolari è stata una priorità per molti medici e scienziati di tutto il mondo. A questo proposito, la recente generazione di modelli animali che imitano queste malattie neuromuscolari è stato determinante per ottenere intuizioni fondamentali sui meccanismi fisiologici alla base dello sviluppo e la progressione di queste condizioni 1-13. Il trattamento di queste malattie neuromuscolari richiede l&#39;accesso diretto al midollo spinale e può essere ottenuto mediante iniezioni spinali 14,15. I recenti progressi nella terapia genica hanno mirato i muscoli striati del superiore earti inferiori a navetta geni terapeutici ai corrispondenti motoneuroni α che si trovano all&#39;interno del corno ventrale del midollo spinale 1,9-13. Tuttavia, questa strategia una volta promettente non è riuscita a migliorare il risultato di queste condizioni neurologiche. Mentre è giusto concludere che questi poveri risultati potrebbero essere, almeno in parte, essere attribuibile alla bassa efficacia di questi geni protettivi, non si può escludere la scarsa efficacia di questi metodi di trasferimento genico. Piastre laterali del motore (deputati) sono regioni specializzate delle miofibre scheletriche che sono rientrati dai terminali degli assoni di fibre motorie periferiche di grandi dimensioni provenienti da α motoneuroni. Insieme, le terminazioni delle fibre nervose periferiche e gli eurodeputati formano la giunzione neuromuscolare, cioè il luogo in cui gli impulsi sinaptici sono attivati ​​dal rilascio anterograda del neurotrasmettitore, l&#39;acetilcolina. È importante sottolineare che il rapporto tra le fibre nervose periferiche e gli eurodeputati è bi-tivazionale, anche se diversi motori sono responsabili per il trasporto di molecole e organelli verso e via dal neurone somata 16-18. Alla luce di queste considerazioni anatomiche, i deputati sembrano essere gli obiettivi di scelta per la consegna e il successivo trasporto retrogrado di materiale genetico alle corrispondenti motoneuroni. In questo contesto, non è sorprendente che il successo del motoneurone trasduzione dipende molto dalla distanza tra l&#39;iniezione intramuscolare di vettori virali e europei del muscolo 19-20. Sorprendentemente, tuttavia, la posizione esatta delle zone MEP sulle miofibre di ratto e topo di laboratorio, le due specie di scelta per modellare malattie neuromuscolari, non erano disponibili fino a poco tempo. Abbiamo prodotto le mappe complete della regione MEP per diversi muscoli degli arti anteriori nel ratto e nel topo 21-22. Più di recente, abbiamo mostrato i dettagli dell&#39;organizzazione del deputato rEgion per diversi muscoli della arti posteriori del mouse 23 e stiamo attualmente analizzando le caratteristiche dei deputati sulla arti posteriori del ratto. Nelle nostre mani, iniezioni intramuscolari di traccianti retrogradi diretti alle intere zone MEP in questi muscoli hanno dato luogo a neuroni motori più marcati che si abbracciano segmenti del midollo spinale di più di quanto precedentemente riportato. Presentiamo qui il protocollo che è stato sviluppato negli ultimi anni per rivelare la posizione dei deputati sulla superficie esterna e per tutto lo spessore e hindlimb forelimb muscoli sia nel topo e nel ratto.

<table><tbody><tr><td>Fluoro-Gold</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td>Nil</td><td>Diluito al 5%</td></tr><tr><td>Drummond PCR Micropipepets 1-10 &; l</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td>accompagnato da stantuffi</td></tr><tr><td>Acetiocolina Ioduro</td><td>Sigma Life Science</td><td>A5751-25G</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di rame (II) anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61230-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Composto</td><td>Sakura Finetek</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Ajax Finechem</td><td>1083-500G</td><td></td></tr><tr><td>Destrano, tetrametilrodamina e biotina</td><td>Life Technologies</td><td>D-3312</td><td>Diluito in acqua distillata</td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Provet</td><td>ISOF00</td><td>1000 mg/g Isoflurano inalazione vapore Autoclip</td></tr><tr><td>9 mm Clip per ferite</td><td>Texas Scientific Instruments, LLC</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>Lethabarb Enthanasia Injection</td><td>Virbac (Australia) Pty Ltd.</td><td></td><td></td>LETHA450</tr><tr><td>Soluzione di formaldeide</td><td>Ajax Finechem</td><td>A809-2.5L PL</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus vetrini</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Solfuro di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1952</td><td>Diluito al 10%</td></tr><tr><td>Marcain Spinal 0,5% (Bupivacaina cloridrato)</td><td>Astrazenca</td><td></td><td>Diluito allo 0,25%</td></tr></tbody></table>

iniezioni intramuscolari lungo le piastre motor finale: un approccio mini-invasivo di navetta tracers direttamente nella motor neurons

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Malattie che colpiscono l&#39;integrità dei neuroni motori del midollo spinale sono tra le condizioni neurologiche più debilitanti. Durante gli ultimi decenni, lo sviluppo di diversi modelli animali di questi disturbi neuromuscolari ha fornito alla comunità scientifica con differenti scenari terapeutiche volte a ritardare o invertire la progressione di queste condizioni. Sfruttando la macchina retrograda dei neuroni, uno di questi approcci è stata quella di indirizzare i muscoli scheletrici, al fine di navetta geni terapeutici in corrispondenti motoneuroni del midollo spinale. Anche se una volta promettente, il successo dell&#39;approccio consegna tale gene è stata ostacolata dal numero non ottimale dei motoneuroni trasdotte che finora ha dimostrato di cedere. Piastre terminali Motor (MEP) sono regioni altamente specializzati sulla muscolatura scheletrica che sono in contatto sinaptico diretto al midollo spinale α motoneuroni. A questo proposito, è importante notare che, finora, gli sforzi per retrogradotrasferimento di geni in neuroni motori sono stati effettuati senza riferimento alla posizione della regione MEP nei muscoli mirati. Qui, descriviamo un semplice protocollo 1) per rivelare la posizione esatta dei deputati sulla superficie dei muscoli scheletrici e 2) di utilizzare queste informazioni per guidare la consegna intramuscolare e successivo trasporto retrogrado ottimale di traccianti retrogradi in neuroni motori. Ci auguriamo di poter utilizzare i risultati di questi esperimenti che tracciano in ulteriori studi in indagando trasporto retrogrado di geni terapeutici per spinale neuroni motori cavo attraverso la destinazione dei deputati.

Acetilcolinesterasi colorazione istochimica rivela la posizione delle piastre terminali del motore attraverso l&#39;ampiezza dei muscoli. La Figura 1 illustra i risultati di tale colorazione eseguita su un intero zampa anteriore di ratto. Si suggerisce di ottimizzare la concentrazione della soluzione di solfuro di ammonio (ad es., 5-7% invece del 10%) e il momento in cui il campione viene immerso nella soluzione se lo sfondo non specifico macchie sulle fibre muscolari è troppo eccessiva. <stron...

L'efficacia dell'assorbimento intramuscolare e del trasporto retrogrado delle molecole ai corrispondenti motoneuroni dipende dalla posizione dei siti di iniezione rispetto alle placche terminali del motore (MEP). Qui, descriviamo come localizzare i MEP sui muscoli scheletrici per ottimizzare il trasporto retrogrado dei traccianti nei motoneuroni.

Iniezioni intramuscolari Lungo le piastre Motor finale: un approccio mini-invasivo di navetta Tracers Direttamente nella Motor Neurons

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è aumentare l'efficacia del trasporto retrogrado dei traccianti neuroanatomici ai motoneuroni del midollo spinale dopo un'iniezione intramuscolare. Questo risultato si ottiene avviando una reazione istochimica dell'acetilcolinesterasi in un tessuto d'interesse simulato per identificare la posizione delle placche motrici sulla muscolatura dell'animale. Nel secondo passaggio, vengono effettuate iniezioni intramuscolari del tracciante retrogrado lungo tutta l'estensione della regione della placca motrice.Sui muscoli di interesse, gli animali vengono quindi mantenuti per 14 giorni per consentire il trasporto del tracciante nel midollo spinale. I motoneuroni che innervano l'intera lunghezza della regione della giunzione neuromuscolare producono un numero maggiore di motoneuroni marcati, che si estendono su più segmenti del midollo spinale del roditore quando visualizzati mediante microscopia a fluorescenza. Le implicazioni di questo studio si estendono allo sviluppo di terapie per le disfunzioni neuromuscolari, che comprendono lesioni del midollo spinale e sclerosi laterale amiotrofica.Essendo questo un metodo minimamente invasivo e quindi clinicamente rilevante per il trasferimento di geni terapeutici nel midollo spinale e nei neuroni motori, in generale le persone alle prime esperienze con questa tecnica incontrano difficoltà poiché le regioni delle placche motrici non possono essere visualizzate nel tessuto muscolare di animali vivi. Una dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale, poiché le iniezioni intramuscolari richiedono la proiezione mentale della posizione della placca motrice sui muscoli. Per creare una mappa della placca motrice finalizzata all'iniezione intramuscolare, iniziare immergendo il corpo o l'arto scuoiato di interesse nella miscela reattiva per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, lavare la carcassa per due minuti in acqua distillata.A questo stadio, i muscoli avranno un colore bluastro e le placche motrici appariranno come puntini bianchi. Immergere la carcassa in solfuro di ammonio, lavare la carcassa tre volte, asciugare delicatamente l'arto e rilevare la regione delle placche motrici, quindi analizzare il contrasto per iniettare il muscolo vivo a livello delle placche motrici. Per prima cosa, utilizzare un tiratore di micropipette per ottenere microcapillari di vetro graduati dotati di stantuffi. Successivamente, utilizzando un microscopio stereoscopico, rompere le punte delle micropipette con una pinzetta in modo che il diametro interno di ogni lume sia di circa 0,5 millimetri.Quindi riempire le pipette del dispositivo con Flora Gold. Applicare ora un lubrificante oculare a un animale anestetizzato e rasare l'arto da iniettare. Utilizzare una garza per detergere l'area rasata con tre passaggi alternati di clorexidina e alcol al 70%.Quindi posizionare l'animale su un tappetino pulito per consentire l'accesso al muscolo bersaglio. Una volta che l'animale è in posizione, utilizzare una pinzetta con morsetti a denti per sollevare la pelle sopra il muscolo bersaglio, staccandola dalla muscolatura sottostante, e usare forbici chirurgiche per praticare un'incisione nella pelle. Prestare attenzione affinché l'incisione sia sufficientemente ampia da esporre completamente il muscolo di interesse con il minimo disturbo alla fascia.Quindi, utilizzando le fotografie della placca motrice, individuare mentalmente la posizione e la forma della regione di interesse della placca motrice sul muscolo ed eseguire tre o quattro iniezioni di uno o due microlitri di oro floreale lungo tutta l'estensione della regione della placca motrice. Dopo l'ultima iniezione, pulire delicatamente il muscolo per rimuovere eventuali fuoriuscite. Successivamente, utilizzare pinze ottuse per avvicinare i due lembi della cute incisa, chiudere la ferita con clip chirurgiche e infiltrare l'intera lunghezza della ferita con l'anestetico locale appropriato.Dopo due settimane dalle iniezioni, effettuare una perfusione intracardiaca dell'animale con fissativo. Per dissezionare il midollo spinale cervicale, posizionare l'animale in posizione prona e utilizzare un bisturi per tagliare la cute lungo la linea mediana del corpo. Riflettere la cute dalla base del cranio fino al livello dell'osso iliaco.Quindi praticare un'incisione e riflettere i muscoli paravertebrali per esporre l'aspetto dorsale della colonna vertebrale. Dopo aver identificato il processo spinoso osseo dell'epistrofeo, rimuovere il segmento con una pinza per individuare la corrispondente radice dorsale sottostante. Etichettare la radice C2 destra con un pennarello indelebile.Quindi rimuovere le vertebre successive una alla volta, marcando le radici dorsali destre con colori alternati. Ad esempio, qui C2, 4, 6 e 8 sono state colorate in blu, mentre C3, 5, 7 e T1 sono state etichettate in nero. Successivamente, utilizzare un ago chirurgico da 30 gauge per perforare delicatamente la dura che ricopre l'estremit&agrave; inferiore del midollo spinale, con il bisello dell'ago rivolto verso l'alto.Sollevare la dura dal midollo mentre si muove l'ago delicatamente. Per realizzare un'incisione longitudinale e riflettere la dura, utilizzare una nuova lama di bisturi per tagliare trasversalmente il midollo spinale in blocchi di uno o due segmenti, al fine di facilitare l'orientamento del segmento di tessuto dopo la dissezione. Lasciare i segmenti al loro posto e, per ciascun blocco, utilizzare il bisturi per effettuare con attenzione un piccolo segno di riferimento sul lato destro di ogni blocco, a metà strada tra le due radici adiacenti.Quindi, per preparare i tessuti all'analisi istologica, trasferire i blocchi singoli in piccole bottiglie ben etichettate contenenti paraldeide, lasciandoli in incubazione durante la notte a temperatura ambiente. La mattina seguente, trasferire i blocchi in nuove bottiglie contenenti soluzione di saccarosio a quattro gradi Celsius. Dopo almeno due giorni, spostare i segmenti in stampi criogenici individuali.Orientare i blocchi con l'aspetto dorsale rivolto verso l'alto e coprirli con del mezzo di congelamento per tessuti. Successivamente, congelare gli stampi criogenici a meno 20 gradi Celsius e tagliare sezioni di 50 micron con un criostato. Per dissezionare il midollo spinale lombare, posizionare l'animale in posizione supina ed eseguire un'incisione mediana lungo l'addome.Rimuovere le viscere ed estrarre i muscoli della parete addominale posteriore. Per esporre l'aspetto ventrale della colonna vertebrale, individuare la costola più corta e la vertebra T13 adiacente da cui esce la radice ventrale di T13. Successivamente, utilizzando pinzette chirurgiche fini in modo consecutivo, rimuovere fino a tre vertebre in direzione rostrale rispetto a T13 per seguire la radice ventrale di T13 fino al punto di entrata e all'aspetto ventrale del midollo ventrale.Contrassegnare la radice ventrale con un pennarello indelebile. Successivamente, rimuovere le vertebre come appena dimostrato, contrassegnando L1 fino a L6 e S1 con colori fino all'ottavo per una facile identificazione. Infine, dissezionare i blocchi e prepararli per l'istologia come appena dimostrato in questo tessuto rappresentativo simulato; durante la colorazione istochimica per l'acetilcolinesterasi, le placche motrici del trapezio acromiale, del deltoide spinale e del tricipite brachiale risultano evidenti come puntini bianchi irregolari che formano una linea continua che attraversa l'intera larghezza del muscolo, mentre le fibre muscolari assumono una tinta verde-blu. Dopo l'immersione e il solfuro di ammonio, le placche motrici sono diventate nere sulle fibre muscolari marroni. Successivamente, è stato iniettato un tracciante neuronale retrogrado lungo tutta la regione della piastra motrice del muscolo tricipite brachiale di un topo vivo. Come previsto, il tracciante ha etichettato i motoneuroni formando una colonna longitudinale che si estende attraverso più segmenti del midollo spinale, targettizzando soltanto una parte della regione della piastra motrice, come mostrato qui dalle aree verdi, blu o rosse del tricipite.La regione della placca motrice del brachio risulta in una ridotta marcatura dei motoneuroni, come mostrato dalle colonne motorie verdi, blu o rosse. Pertanto, per un'assunzione massimale del tracciante nei motoneuroni innervanti, l'intera regione della placca motrice deve essere iniettata seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'immunohistochimica o il conteggio stereologico delle cellule, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come le reazioni antigene-anticorpo e la morfologia dei motoneuroni marcati, dopo il loro sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per sviluppare strategie terapeutiche come la terapia genica, modelli di roditore ER di disfunzione neuromuscolare.

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Iniezioni intramuscolari lungo le piastre terminali del motore per trasportare i traccianti direttamente nei motoneuroni del ratto

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Questo rapporto descrive una tecnica semplice e rapida di intratecale ago puntura per una trasfezione di siRNA localizzato nel midollo spinale lombare nel topo sotto breve anestesia leggera durata.

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Iniezioni intramuscolari Lungo le piastre Motor finale: un approccio mini-invasivo di navetta Tracers Direttamente nella Motor Neurons (Video) | JoVE Journal

Iniezioni intramuscolari Lungo le piastre Motor finale: un approccio mini-invasivo di navetta Tracers Direttamente nella Motor Neurons

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