Silencing di
12 agosto 2015
Il silenziamento genico da parte di siRNA rappresenta una comoda strategia sperimentale per analizzare le funzioni biologiche dipendenti da BRCA2 con implicazioni immediate per comprendere meglio la biologia del cancro. Viene presentato un metodo per silenziare in modo efficiente BRCA2, insieme alla procedura sperimentale per rilevare e quantificare i cambiamenti nell'espressione della proteina BRCA2 mediante immunoblotting in linee cellulari umane.
L'obiettivo generale di questa procedura è silenziare l'espressione di B RCA due mediante trasfezione di SIR A. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto i complessi del reagente di trasfezione SIR a. Successivamente, si esegue un primo ciclo di trasfezione aggiungendo i complessi goccia a goccia su un monostrato di cellule al 80% di confluenza. Quindi, si effettua un secondo ciclo di trasfezione con SIR a utilizzando un rapporto maggiore tra SIR A e reagente di trasfezione.
Infine, i monocapani cellulari vengono lavati con PBS freddo e le cellule sono lisate a quattro gradi Celsius con un buffer di lisi a base di detergente. Alla fine, l'analisi mediante Western blot viene utilizzata per dimostrare il silenziamento di B RCA A due a livello proteico. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che consente un silenziamento genico efficiente nonché una rilevazione ottimale di proteine ad alto peso molecolare come il soppressore tumorale B RCA due. Per iniziare, dopo aver coltivato monocapani di cellule epiteliali umane a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in una camera umidificata, rimuovere il mezzo di crescita e utilizzare PBS a temperatura ambiente per lavare le cellule.
Per staccare le cellule dalla piastra, aggiungere due millilitri di soluzione di tripsina 0,25% ed EDTA 0,53 millimolare e incubare da tre a cinque minuti a seconda del tipo cellulare. Neutralizzare la tripsina aggiungendo due millilitri di mezzo di crescita completo contenente il 10% di FBS prima di trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri. Posizionare i tubi in un rotore con becchi oscillanti e centrifugare da 320 a 330 G a quattro gradi Celsius per tre minuti.
Utilizzare cinque millilitri di mezzo privo di antibiotici per risospendere i pellet prima di contare le cellule mediante una camera di Burker o un sistema di conteggio automatico. Successivamente, seminare circa da 0,5 a 1 × 10⁶ cellule in due millilitri di mezzo privo di antibiotici in ciascun pozzetto di piastre a sei pozzetti e incubare per 24 ore fino al raggiungimento di una confluenza dell'80%. Al termine dell'incubazione, procedere con un primo ciclo di trasfezione diluendo sei microlitri di un reagente di trasfezione specifico per irna a base lipidica in 130 microlitri di mezzo con siero ridotto.
Diluire tre microlitri di S irna 10 micromolare in 130 microlitri di mezzo con siero ridotto. Combinare l'irna diluito con un reagente di trasfezione diluito e incubare per cinque-dieci minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, rimuovere il mezzo dalle cellule e aggiungere due millilitri di mezzo fresco senza antibiotici.
Riscaldare preventivamente a 37 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 250 microlitri dei complessi del reagente di trasfezione con siRNA in ciascun pozzetto di cellule in una piastra a sei pozzetti. Quindi incubare le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.
Dopo 24 ore, diluire cinque microlitri di irna 10 micromolare in 130 microlitri di mezzo con siero ridotto e procedere con un secondo ciclo di trasfezione come appena dimostrato. L'elevata concentrazione di sarna nel secondo ciclo è essenziale per ottenere un'elevata efficienza di silenziamento di B rca. A due.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per uno o due giorni prima dell'analisi, al fine di preparare il lisato cellulare per l'analisi mediante immunoblotting. Preparare un buffer di lisi fresco seguendo la ricetta indicata qui. Rimuovere il mezzo dalle cellule e aggiungere due millilitri per pozzetto di PBS freddo su ghiaccio per lavare le cellule.
Quindi rimuovere completamente il PBS dalla piastra e aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi freddo di ghiaccio a ciascun pozzetto. Ruotare delicatamente la piastra per distribuire in modo uniforme il tampone di lisi e incubare su un agitatore rotante a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, utilizzando una spatola per cellule.
Raccogliere il lisato cellulare in una provetta da microcentrifuga su ghiaccio, centrifugare a 17.900 ×g e a quattro gradi Celsius per 25 minuti e raccogliere il sopranatante per eseguire l'analisi di immunoblotting. Preparare il buffer di corsa diluendo 50 millilitri di buffer di corsa 20x tris acetato SDS con 950 millilitri di acqua distillata. Preparare il campione come segue.
Aggiungere 15 microgrammi di lisato cellulare totale. Cinque microlitri di buffer campione 4x contenente solfato di litio ESAL pH 8,42, 2 microlitri di DTT 0,5 M e buffer di lisi fino a un volume totale di 20 microlitri. Denaturare i campioni a 55 gradi Celsius per 10 minuti.
È fondamentale utilizzare questa temperatura poiché la proteina b RCA due è termosensibile. Successivamente, preparare la camera elettroforetica seguendo le istruzioni del produttore. Quindi caricare i campioni insieme a 10 microlitri di un marcatore proteico standard ad alto peso molecolare su un gel prefabbricato ed eseguire l'elettroforesi a 120 volt per circa due ore.
Nel frattempo, preparare il buffer di trasferimento con 50 millilitri di buffer di trasferimento 20x, 100 millilitri di metanolo al 100% e 850 millilitri di acqua. Attivare la membrana in PVDF immergendola in metanolo al 100% per cinque minuti. Risciacquare con acqua distillata ed equilibrare nel buffer di trasferimento per almeno cinque minuti.
Inzuppare le spugne dell'apparecchio di trasferimento nel buffer di trasferimento a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso. Arrestare la corsa prima che il marcatore blu di 55 kilodalton esca dal gel preconfezionato e assemblare il sandwich a partire da tre spugne inzuppate nel buffer di trasferimento. Quindi un foglio di carta da tre mm saturato nel buffer di trasferimento.
Successivamente, aggiungere il gel, quindi la membrana PVDF attivata, seguita da una carta Whatman 3M imbevuta di tampone e infine da tre spugne imbevute. Posizionare il sandwich nell'apparato e trasferire le proteine a 350 milliampere per quattro ore a quattro gradi Celsius oppure a 180 milliampere e quattro gradi Celsius durante la notte. Al termine del trasferimento, lavare la membrana con TBS e bloccare per un'ora con TBST e latte in polvere scremato al 5%.
Quindi sostituire il tampone con nove millilitri di tampone TBST contenente latte, aggiungendo 30 microlitri di anticorpo policlonale anti-BCA2 da coniglio, e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo aver lavato la membrana tre volte con TBST per 10 minuti ciascuna, incubare il filtro per un'ora con un microlitro di anticorpo secondario anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano, diluito in 10 millilitri di tampone TBST contenente latte. Dopo aver lavato la membrana tre volte, eseguire la rilevazione immunochemiluminescente KEMMA seguendo le istruzioni del produttore.
Visualizzare le bande su pellicole ECL ad alta risoluzione per confermare la specificità dell'RNAi per B rca. A due. Un RNAi randomizzato è stato utilizzato in parallelo all'RNAi per B RCA due, come mostrato qui. Come menzionato in precedenza, è importante eseguire un secondo ciclo di trasfezione di RNAi con un elevato rapporto tra RNAi e reagente di trasfezione per ottenere un'elevata efficienza di silenziamento di B RCA A due.
I risultati qui mostrati evidenziano la differenza nell'efficienza di silenziamento tra l'uso di un rapporto basso e alto di siRNA rispetto al transfezionamento, a seconda del tipo cellulare. Il tempo minimo ottimale per ottenere il massimo livello di silenziamento genico può variare dopo il secondo ciclo di transfezionamento dell'siRNA; ad esempio, come mostrato in questa figura, 24 ore sono sufficienti per le cellule tiroidee NTHY, mentre sono necessarie fino a 48 ore per un efficace silenziamento di B RCA A two nelle cellule prostatiche PNT one A. Il silenziamento di b RCA two è piuttosto stabile fino al settimo giorno dopo il secondo ciclo di transfezionamento. Come menzionato in precedenza, la denaturazione dei lisati cellulari a una temperatura superiore ai 55 gradi Celsius comporta una perdita fino al 50% della proteina B RCA A two.
In questo esperimento, la sensibilità delle cellule PNT1A con B RCA A due volte silenziato al farmaco inibitore della PARP rucaparib è stata esaminata dopo un trattamento di 24 ore con il composto. Si è osservata una riduzione dipendente dal tempo della proliferazione cellulare nelle cellule PNT1A con B RCA due depletato rispetto ai controlli. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come silenziare geni che codificano per proteine lunghe mediante un CRNA e di come rilevare in modo efficiente il loro prodotto proteico attraverso una procedura immunochemiluminescente ottimizzata oltre a BRC due.
Questa metodologia può essere applicata a molte altre proteine grandi e difficili, in particolare quando sono espresse a livelli molto bassi nelle cellule.
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Panoramica
In questo articolo viene presentato un metodo per silenziare l'espressione di BRCA2 mediante trasfezione con siRNA in linee cellulari umane. La procedura comprende la preparazione di complessi di reagente per la trasfezione con siRNA e successivi cicli di trasfezione, seguiti da analisi con Western blot per valutare i livelli proteici di BRCA2.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Silenziamento genico
- Biologia del cancro
- Analisi dell'espressione proteica
Sfondo
- BRCA2 è un gene chiave soppressore dei tumori.
- Comprendere la sua regolazione è fondamentale per la ricerca sul cancro.
- L'RNAi offre un approccio mirato per il silenziamento genico.
- Il blotting Western è un metodo affidabile per la rilevazione delle proteine.
Scopo dello studio
- Per silenziare in modo efficiente l'espressione di BRCA2.
- Per analizzare gli effetti del silenziamento di BRCA2 sui livelli proteici.
- Per migliorare le metodologie per lo studio dei geni associati al cancro.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di complessi di reagente per la trasfezione di siRNA.
- Eseguire due trasfezioni di siRNA in cellule in coltura.
- Lavaggio delle cellule con PBS dopo la trasfezione.
- Analisi mediante Western blot per quantificare l'espressione proteica di BRCA2.
Risultati principali
- È stato ottenuto un silenziamento efficace di BRCA2.
- Il dosaggio mediante Western blot ha confermato una riduzione dei livelli proteici di BRCA2.
- Il metodo ha dimostrato efficienza nel silenziamento genico.
- Le proteine ad alto peso molecolare sono state rilevate in modo efficace.
Conclusioni
- Il metodo di trasfezione con siRNA è efficace per il silenziamento di BRCA2.
- Questo approccio può migliorare la comprensione delle funzioni di BRCA2.
- Fornisce uno strumento prezioso per la ricerca in biologia del cancro.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La silenziamento efficiente di grandi proteine soppressori tumorali come BRCA2 permette l'analisi meccanicistica delle vie di riparazione del DNA in modelli cellulari umani. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi stabilendo collegamenti causali tra la perdita di BRCA2 e i fenotipi cellulari rilevanti per la scoperta di farmaci oncologici. Il protocollo affronta una barriera tecnica fondamentale nello studio di proteine ad alto peso molecolare, migliorando la riproducibilità negli sforzi preclinici di riduzione del rischio degli obiettivi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi funzionale dei percorsi regolati da BRCA2 per chiarire i meccanismi di soppressore tumorale nei tumori epiteliali.
- Valore operativo: Raggiunge un silenziamento di BRCA2 superiore al 70% mediante rapporti ottimizzati di trasfezione con siRNA, consentendo una valutazione affidabile del fenotipo.
- Valore scientifico: Facilita il rilevamento della proteina endogena BRCA2 mediante denaturazione a bassa temperatura (55°C), preservando l'integrità dell'epitopo per l'immunoblotting.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore operativo: Un flusso di lavoro standardizzato di trasfezione siRNA in due fasi migliora l'efficienza di trasfezione per geni di grandi dimensioni, aumentando la robustezza del saggio.
- Valore scientifico: Consente letture quantitative mediante Western blot dei livelli proteici di BRCA2 da correlare con esiti funzionali come la sensibilità agli inibitori di PARP.
- Valore operativo: Compatibile con lisati a basso input, consentendo schermature scalabili nelle fasi iniziali delle campagne di validazione del target.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega il silenziamento di BRCA2 a una maggiore sensibilità agli inibitori della PARP (ad esempio, rucaparib), sostenendo modelli preclinici guidati da biomarcatori.
- Valore operativo: L’abbattimento stabile per un periodo fino a sette giorni dopo la trasfezione consente saggi fenotipici in serie temporale negli studi sulla risposta ai farmaci.
- Valore scientifico: Fornisce un sistema rilevante per la malattia per modellare le mutazioni di tipo loss-of-function di BRCA2 osservate nei tumori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nella fase di biologia della scoperta, consentendo la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi metabolici prima dell'identificazione del capostazione e della validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico isolando la funzione di BRCA2 nelle vie di riparazione del DNA e di stabilità genomica.
- Screening: Fornisce letture quantitative riproducibili a livello proteico, essenziali per la standardizzazione dei saggi attraverso diverse linee cellulari.
- Analisi: Genera segnali rilevabili di BRCA2 mediante immunoblotting ottimizzato, consentendo il confronto dell'efficienza di silenziamento e degli effetti a valle.
- Ricerca traslazionale: Collega la perdita di BRCA2 alla sensibilità agli inibitori della PARP, in linea con le strategie traslazionali dei biomarcatori nei modelli di cancro ovarico e mammario.
- Riutilizzo aziendale: Adattabile ad altre proteine grandi e a bassa abbondanza, posizionandola come una piattaforma riutilizzabile per classi di target difficili.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei fenotipi associati a BRCA2 consentendo un silenziamento genico specifico e sostenuto.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso rapporti standardizzati di siRNA e una lisi a bassa temperatura, minimizzando la variabilità nella rilevazione di proteine di grandi dimensioni.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto validando la dipendenza dal bersaglio in modelli preclinici prima dell'investimento in composti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio dei bersagli delle vie di riparazione del DNA sulla base di evidenze genetiche funzionali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'ottimizzazione della trasfezione di siRNA e nell'immunoblotting di proteine ad alto peso molecolare.
- Necessita dell'accesso a reagenti per la trasfezione, tamponi di lisi e sistemi di elettroforesi compatibili con la separazione di proteine di grandi dimensioni.
- Richiede la standardizzazione dei rapporti tra siRNA e reagente e dei tempi di trasfezione tra diverse linee cellulari per ottenere un knockdown costante.
- Comporta considerazioni di adattamento relative ai diversi livelli di espressione di BRCA2 e alle efficienze di trasfezione nei vari modelli epiteliali.
- È limitato dalla termosensibilità di BRCA2, che richiede un controllo preciso della temperatura durante la preparazione dei campioni per evitare la perdita dell'epitopo.
