Name: Silencing di BRCA2 Per identificare le funzioni biologiche Novel BRCA2-regolamentato coltivate cellule umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Scopri come silenziare BRCA2 nelle cellule umane mediante trasfezione con siRNA e analisi Western blot. Questo metodo ottimizza il rilevamento di proteine ad alto peso molecolare per la ricerca sul cancro.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni FIRB-Merit RBNE08YFN3_005 e RBNE08HWLZ_012 e dal Ministero dell'Economia e delle Finanze italiano al CNR per il progetto "FaReBio di Qualità".

1. Preparare le soluzioni di siRNA <ol><li> Risospendere 5 nmol di strapazzate (Ctrl) e 5 nmol di BRCA2 siRNA pellet secchi in 100 ml di acqua RNase-free (concentrazione siRNA finale: 50 micron). Questo è lo stock siRNA e deve essere conservato a -20 ° C in 10 microlitri aliquote. </li><li> Prendete una aliquota di 10 ml dal magazzino siRNA e aggiungere 40 ml di acqua RNase-free per ottenere la soluzione di lavoro 10 micron siRNA. Questa diluizione deve essere conservata a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. NOTA: La soluzione di lavoro siRNA non deve essere sottoposto a congelamento / scongelamento più di 3 volte. </li></ol> 2. Semina di epiteliali umane linee cellulari <ol><li> Rimuovere il mezzo di crescita di linee cellulari epiteliali umane che crescono come monostrati di cellule in piastre di coltura di tessuti in un incubatore umidificato a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Lavare le cellule nella piastra una volta con PBS RT (10 ml di PBS per una piastra di 100 mm). </li><li> Per staccare le cellule dalla piastra,aggiungere 2 ml di 0,25% tripsina / EDTA soluzione 0,53 mM e incubare 3-5 min a seconda del tipo di cellula. </li><li> Prima di raccogliere le cellule staccate, neutralizzare tripsina aggiungendo 2 ml di terreno di coltura completo contenente siero bovino fetale al 10%. </li><li> Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml. </li><li> Centrifugare le cellule a 320-330 xg per 3 min a 4 ° C in un rotore oscillante secchio. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 5 ml di free-antibiotici medie. </li><li> Contare le cellule sotto il microscopio in una camera di Burker o utilizzando un sistema di conteggio automatico secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Seed le cellule in 6 pozzetti per essere circa l&#39;80% confluenti dopo 24 ore (0,5-1 x10 6 celle in 2 ml di terreno per ogni bene). Numero ottimale di cellule per essere seminati possono variare a seconda delle linee cellulari specifiche e il tasso di crescita. NOTA: Non aggiungere antibiotici nel mezzo a questo punto, perché gli antibiotici interferiscono negativamente con l&#39;efficienza di trasferction. È molto importante che le cellule sono a passaggi su coltura basse (&lt;10) per ottenere un&#39;elevata efficienza di BRCA2 siRNA trasfezione. </li></ol> 3. Le cellule trasfezione con siRNA <ol><li> Ventiquattro ore dopo la placcatura le cellule, procedere con il primo turno di trasfezione. <ol><li> Diluire 6 ml di base lipidica 10 siRNA specifico reagente di trasfezione in 130 ml di mezzo di siero ridotto. </li><li> Diluire 3 ml di 10 micron siRNA (30 pmol) in 130 ml di mezzo di siero ridotto. </li><li> Unire il siRNA diluito con il reagente di trasfezione diluito e incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Durante l&#39;incubazione, rimuovere il terreno dalle cellule e aggiungere 2 ml di mezzo fresco pre-riscaldato a 37 ° C (senza antibiotici). </li><li> Aggiungere 250 l di siRNA-trasfezione complessi reagenti alle cellule (l&#39;importo è per un singolo pozzo di un 6-pozzetti). </li><li> Incubare le cellule in un incubatore umidificato a 3776; C con 5% di CO 2. </li></ol></li><li> Dopo 24 ore, procedere con il secondo turno di trasfezione ripetendo i punti 3.1.1-3.1.5 con la seguente modifica di passo 3.1.2: diluire 5 ml di 10 micron siRNA (50 pmoli) in 130 ml di mezzo di siero ridotto. <ol><li> Incubare le cellule per 1-2 giorni a 37 ° C prima dell&#39;analisi. NOTA: Due turni di trasfezioni e l&#39;uso di un rapporto di reagenti alto siRNA / trasfezione al secondo turno sono essenziali per ottenere un&#39;elevata efficienza di silenziamento BRCA2. </li></ol></li></ol> 4. cellule Lisare per l&#39;analisi immunoblotting <ol><li> Preparare tampone di lisi fresca con PBS (pH 7.4) contenente 1% di non ionico, non denaturante detergente ottilfenossipolietossietanolo, 5 mM sodio pirofosfato, 1 mM orthovanadate di sodio, fluoruro di sodio 10 mM, fluoruro phenylmethylsulfonyl 2 mM, 10 mg / ml leupeptina, 10 ug / ml aprotinina. Keep it sul ghiaccio. </li><li> Rimuovere il supporto da parte delle cellule e wcenere una volta con PBS freddo (2 ml / pozzetto) nella piastra. Per evitare qualsiasi riporto PBS, rimuoverlo completamente dalla piastra. </li><li> Aggiungere 200 ml di tampone di lisi a ciascun pozzetto. NOTA: Se le cellule devono essere utilizzati anche per altri saggi, trypsinize le cellule come descritto al punto 2.1-2.6 e risospendere le cellule in appropriato tampone / supporto secondo l&#39;applicazione da usare. </li><li> Ruotare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente il tampone di lisi e incubare per 15 min a 4 ° C su un rotatore. </li><li> Raccogliere il lisato cellulare in una provetta su ghiaccio con un raschietto cellulare. </li><li> Centrifugare a 17.900 xg per 25 min a 4 ° C e raccogliere il surnatante in una nuova provetta. </li><li> Misurare la concentrazione proteica utilizzando un saggio proteico disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 5. BRCA2 analisi immunoblotting <ol><li> Preparare il tampone di corsa diluendo 50 ml di 20x Tris-acetato SDS esecuzione bUffer (Tricine 50 mM, 50 mM Tris Base, 0,1% SDS, pH 8.24) con 950 ml di acqua distillata. </li><li> Preparare il campione come segue: aggiungere 15 ug di lisato cellulare totale, 5 ml di tampone campione 4x contenenti litio dodecil solfato a pH 8,4, 2 ml di agente riducente 10x campione (0.5 M DTT), e tampone di lisi a un volume finale di 20 ul. NOTA: Questo protocollo consente il rilevamento di BRCA2 in linee cellulari normali anche quando si utilizza una minore quantità di proteine ​​totali (fino a 5 mg). </li><li> Denaturare i campioni a 55 ° C per 10 min. NOTA: E &#39;fondamentale utilizzare 55 ° C. Dal momento che la proteina BRCA2 è termosensibile 11, le temperature più elevate denaturanti provocano la perdita costante di intatta tutta lunghezza (390 kDa) proteina BRCA2. </li><li> Impostare la camera elettroforetico secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Caricare i campioni e 10 ml di alto peso molecolare pre-tinto standard di proteine ​​su un gel precasted (Tris-acetato 3-8%) e correre a 120 V per abfuori 2 ore 12. Fermare la corsa elettroforetica prima del 55 kDa indicatore blu lascia il gel precasted. </li><li> Preparare il buffer di trasferimento con 50 ml di 20x tampone di trasferimento, 100 ml di metanolo 100% e 850 ml di acqua. </li><li> Attiva membrana PVDF (0,45 micron dimensione dei pori) immergendolo in metanolo 100% per 5 minuti, risciacquare con acqua distillata ed equilibrare in tampone di trasferimento almeno per 5 min. Immergere le spugne del dispositivo di trasferimento in tampone di trasferimento a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Quando la corsa elettroforetica è finita, montare il sandwich nella pila di trasferimento nel seguente ordine (bottom-up): tre spugne saturi nel buffer di trasferimento, un foglio di carta 3MM grado saturo in buffer di trasferimento, il gel, membrane PVDF attivato, uno 3MM foglio di carta di grado saturi in buffer di trasferimento, tre spugne saturo in buffer di trasferimento 13,14. Posizionare la pila nelle proteine ​​apparecchi e di trasferimento a 350 mA per 4 ore a 4 ° C o 180 mA notte a 4 ° C. NOTA: Essendo BRCA2 una grande proteina, è fondamentale per estendere il tempo di trasferimento da 1 hr (come suggerito dal produttore e la maggior parte dei protocolli di trasferimento) per 4 ore o durante la notte per garantire la completa trasferimento di proteine ​​ad alto peso molecolare. In aggiunta, a causa del tempo di trasferimento lungo, è indispensabile effettuare il blotting in una camera fredda a 4 ° C per ridurre al minimo il surriscaldamento e facilitare smontaggio sandwich. Sistemi di trasferimento semi-dry non sono buone per il trasferimento di grandi proteine. </li><li> Dopo il trasferimento, lavare la membrana con TBS, bloccarlo per 1 ora a RT in TBS-Tween 0,25% (TBS-T) contenente latte in polvere 5% nonfat e sonda notte a 4 ° C con 30 microlitri anti-BRCA2 anticorpo policlonale di coniglio ( 200 mcg / ml), diluito in 9 ml TBS-T + 5% latte scremato secca [1: 300 (v / v)] diluizione. </li><li> Lavare la membrana tre volte (10 min ciascuno) con TBS-T, allora il filtro incubare per 1 ora con 1 ml di rafano anti-coniglio anticorpo secondario coniugato con perossidasi diluito in 10 ml di TBS-T + 5% senza grassi latte in polvere. Successivamente, lavare la membrana per tre volte (10 min ciascuno) con TBS-T. </li><li> Eseguire immunolocalizzazione di ECL per rivelare la proteina BRCA2 con chemiluminescenza (ECL) Western Blotting Detection Reagent, seguendo le istruzioni del produttore. Visualizza bande immunochemiluminescenti ad alta risoluzione su pellicole ECL. </li><li> Eseguire immunolocalizzazione con un anticorpo per un gene housekeeping, come β-tubulina (55 kDa), sullo stesso filtro come controllo di caricamento utilizzando un anticorpo monoclonale di β-tubulina diluito a 1: 1.000 (10 ml di anticorpo anti-tubulina in 10 ml TBS-T latte in polvere senza grassi + 5%) per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare e incubare anticorpo secondario come descritto per BRCA2 (5,10-5,11), fatta eccezione per l&#39;utilizzo di perossidasi di rafano-coniugato anti-mouse invece di anticorpo secondario anti-coniglio. </li><li> Acquisire un&#39;immagine digitale dei film impressi con bande immunochemiluminescenti e analizzare l&#39;intensità della banda da immagine dedicato software di analisi (per esempio., ImageJ). </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

A causa mutazioni germinali del gene BRCA2 piombo ad un aumentato rischio di diversi tipi di cancro, tra cui il cancro al seno maschile e femminile, il cancro ovarico, il cancro alla prostata, cancro al pancreas, e il melanoma 3,4, sono state avviate una serie di studi per comprendere la funzione biologica della proteina BRCA2. La maggior parte di questi studi sono genetiche a base principalmente a causa di difficoltà tecniche analizzando una proteina gigante come BRCA2. Il metodo descritto qui di si...

Il BRCA2 (Breast Cancer suscettibilità gene-2) gene codifica per una proteina soppressore del tumore che gioca un ruolo cruciale nella riparazione del DNA rotture del doppio filamento regolando la funzione dell&#39;enzima recombinase Rad51 1. BRCA2 è stato anche coinvolto nella modulazione della trascrizione e nel controllo del ciclo cellulare 2. Mutazioni germinali nel gene BRCA2 inducono un autosomica dominante suscettibilità cancro al seno e alle ovaie nelle donne e il cancro alla prostata negli uomini, nonché la predisposizione di altri tipi di cancro 3,4. Tuttavia, nonostante l&#39;aumento del rischio di sviluppare il cancro, mutazioni BRCA2 che sopprimono o riducono la funzionalità BRCA2 possono rendere le cellule tumorali più vulnerabili agli agenti chemioterapici che causano danni al DNA 5-7. Tumori sporadici presentano un basso tasso di mutazioni BRCA2 (&lt;3%) anche se sono stati rilevati livelli ridotti di proteina BRCA2 in alcuni tipi di cancro, suggerendo che la proteina BRCA2può essere perso durante la tumorigenesi nei tumori sporadici attraverso meccanismi non mutazionale dipendenti 7,8. Pertanto, è importante comprendere appieno funzioni BRCA2 nel contesto della biologia cancro e in altri contesti biologici. Uno strumento potente usato per identificare nuove funzioni di un gene in cellule di mammifero è di mettere a tacere la sua espressione. Come esempio, il silenziamento dell&#39;espressione BRCA2 in una varietà di cellule epiteliali normali ha recentemente portato all&#39;identificazione di una nuova funzione di BRCA2 come regolatore di anoikis resistenza, un passo importante durante l&#39;acquisizione di cellule di cancro invasivo e metastatico capacità 9. Gene silenziamento può essere raggiunto con l&#39;introduzione nelle cellule o small interfering (si) RNA o brevi tornanti (sh) molecole di RNA rivolti al gene specifico. L&#39;elevata potenza di siRNA e la sua facilità d&#39;uso ne fanno lo strumento preferenziale per tacere esperimenti volti ad acquisire nuove conoscenze sui processi biologici critici unnd di identificare nuovi bersagli terapeutici. Tuttavia, l&#39;abbattimento efficiente di espressione genica può non essere facilmente raggiungibile per tutti i geni e può essere molto variabile a seconda del tipo di cellula. Poiché una diminuzione dei livelli di proteine ​​intracellulari è il fenotipo più rilevante in esame, è fondamentale quantificare silenziamento genico mediante immunoblotting analisi del prodotto del gene. Con questo proposito, la proteina BRCA2 presenta un&#39;ulteriore sfida: essere una grande proteina (circa 390 kDa), esistono difficoltà tecniche per l&#39;analisi biochimica convenzionale, compresi immunoblotting. Riportiamo qui un protocollo ottimizzato per tacere efficiente di BRCA2 in linee cellulari epiteliali umane e per la rilevazione rapida e positiva di proteine ​​BRCA2 knockdown mediante immunoblotting analisi.

<table><tbody><tr><td>BRCA2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003462-00</td><td>SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA</td></tr><tr><td>Ctrl siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>&nbsp; D-001810-10-05</td><td>Reagente RNAiMAX per pool di lipofectamina non mirato ON-TARGETplus</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/13778075">13778075</a></td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I Siero ridotto Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Terreno per procedura di trasfezione</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel prefabbricato</td><td>Life Technologies</td><td>EA0378</td><td>Gel per elettroforesi proteica</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Tampone del campione&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>Reagente per elettroforesi delle proteine</td></tr><tr><td>NuPAGE Agente riducente del campione (10x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0004</td><td>Reagente per l'elettroforesi delle proteine</td></tr><tr><td>NuPAGE Antiossidante</td><td>Life Technologies</td><td>NP0005</td><td>Reagente per l'elettroforesi delle proteine</td></tr><tr><td>HiMark Standard delle proteine Life</td><td>Technologies</td><td>LC5699</td><td>Marker prestainato per gel elettroforesi</td></tr><tr><td>XCell SureLoc Mini-Cell&nbsp; System</td><td>Life Technologies</td><td>EI0002</td><td>Apparecchiatura per elettroforesi/trasferimento di proteine</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetato SDS Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LA0041</td><td>Reagente per Western blotting</td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Reagente per Western blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0006-1</td><td>Reagente per Western blotting</td></tr><tr><td>BRCA2 H-300 coniglio anticorpo policlonale</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8326</td><td>diluizione 1:300</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale beta-tubulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4026-100UL</td><td>1:1.000 diluizione</td></tr><tr><td>Latte scremato in polvere</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70166</td><td>Reagente per Western blotting</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>Reagente per Western blotting</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico/Femto Substrato chemiluminescente</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>34080/34096</td><td>Sistema di chemiluminescenza</td></tr><tr><td>PNT1A cellule</td><td>SIGMA Aldrich (per ECACC)</td><td>95012614</td><td>PNT1A epitelio prostatico umano normale immortalato con cellule SV40</td></tr><tr><td>Nthy</td><td>SIGMA Aldrich (per ECACC)</td><td>90011609</td><td>Nthy-ori 3-1 Linea cellulare umana, cellule epiteliali follicolari tiroidee</td></tr><tr><td>Proliferazione cellulare Kit I (MTT)</td><td>Roche</td><td>11465007001</td><td>Kit per saggi di proliferazione cellulare</td></tr></tbody></table>

silencing di<em&gt; brca2</em&gt; per identificare le funzioni biologiche novel brca2-regolamentato coltivate cellule umane

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silenziamento della proteina BRCA2 soppressore del tumore e la sua individuazione da analisi biochimiche convenzionali rappresentano una grande sfida tecnica a causa delle grandi dimensioni della proteina BRCA2 umana (circa 390 kDa). Riportiamo modifiche di protocolli di trasfezione e immunoblotting siRNA standard per tacere BRCA2 umano e rilevare proteina BRCA2 endogena, rispettivamente, nelle linee di cellule epiteliali umane. Passaggi chiave includono un alto siRNA rapporto reagente di trasfezione e due successivi turni di siRNA trasfezione all&#39;interno dello stesso esperimento. Utilizzando queste e altre modifiche al protocollo standard che costantemente raggiungere oltre il 70% silenziamento del gene BRCA2 umano come giudicato da immunoblotting con anticorpi anti-BRCA2. Inoltre, denaturazione dei lisati cellulari a 55 ° C invece che nel tradizionale 70-100 ° C e altre ottimizzazioni tecniche della procedura immunoblotting consentono di individuare proteina BRCA2 intatta anche when molto basse quantità di materiale di partenza sono disponibili o quando i livelli di espressione della proteina BRCA2 sono molto basse. Silenziamento efficiente di BRCA2 nelle cellule umane offre una valida strategia per interrompere la funzione BRCA2 in cellule con BRCA2 intatte, comprese le cellule tumorali, per esaminare nuovi percorsi molecolari e funzioni cellulari che possono essere interessati da mutazioni BRCA2 patogeni nei tumori. L&#39;adattamento di questo protocollo per tacere e l&#39;analisi di altre proteine ​​&quot;grandi&quot; come BRCA2 efficiente dovrebbe essere facilmente realizzabile.

Prima di procedere con un saggio biologico / biochimico per esaminare l&#39;effetto di silenziamento BRCA2 sulle funzioni cellulari, il primo passo è per confermare la specificità del silenziamento utilizzando un siRNA criptato (non-targeting siRNA) fianco a fianco con BRCA2 siRNA (Figura 1A ). E &#39;importante eseguire una seconda tornata di siRNA trasfezione con un elevato rapporto siRNA / trasfezione per ottenere un&#39;elevata efficienza di silenziamento BRCA2. In effetti, l&#39;e...

Il silenziamento genico da parte di siRNA rappresenta una comoda strategia sperimentale per analizzare le funzioni biologiche dipendenti da BRCA2 con implicazioni immediate per comprendere meglio la biologia del cancro. Viene presentato un metodo per silenziare in modo efficiente BRCA2, insieme alla procedura sperimentale per rilevare e quantificare i cambiamenti nell'espressione della proteina BRCA2 mediante immunoblotting in linee cellulari umane.

Silencing di<em&gt; BRCA2</em&gt; Per identificare le funzioni biologiche Novel BRCA2-regolamentato coltivate cellule umane

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è silenziare l'espressione di B RCA due mediante trasfezione di SIR A. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto i complessi del reagente di trasfezione SIR a. Successivamente, si esegue un primo ciclo di trasfezione aggiungendo i complessi goccia a goccia su un monostrato di cellule al 80% di confluenza. Quindi, si effettua un secondo ciclo di trasfezione con SIR a utilizzando un rapporto maggiore tra SIR A e reagente di trasfezione.Infine, i monocapani cellulari vengono lavati con PBS freddo e le cellule sono lisate a quattro gradi Celsius con un buffer di lisi a base di detergente. Alla fine, l'analisi mediante Western blot viene utilizzata per dimostrare il silenziamento di B RCA A due a livello proteico. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che consente un silenziamento genico efficiente nonché una rilevazione ottimale di proteine ad alto peso molecolare come il soppressore tumorale B RCA due. Per iniziare, dopo aver coltivato monocapani di cellule epiteliali umane a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in una camera umidificata, rimuovere il mezzo di crescita e utilizzare PBS a temperatura ambiente per lavare le cellule.Per staccare le cellule dalla piastra, aggiungere due millilitri di soluzione di tripsina 0,25% ed EDTA 0,53 millimolare e incubare da tre a cinque minuti a seconda del tipo cellulare. Neutralizzare la tripsina aggiungendo due millilitri di mezzo di crescita completo contenente il 10% di FBS prima di trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri. Posizionare i tubi in un rotore con becchi oscillanti e centrifugare da 320 a 330 G a quattro gradi Celsius per tre minuti.Utilizzare cinque millilitri di mezzo privo di antibiotici per risospendere i pellet prima di contare le cellule mediante una camera di Burker o un sistema di conteggio automatico. Successivamente, seminare circa da 0,5 a 1 × 10⁶ cellule in due millilitri di mezzo privo di antibiotici in ciascun pozzetto di piastre a sei pozzetti e incubare per 24 ore fino al raggiungimento di una confluenza dell'80%. Al termine dell'incubazione, procedere con un primo ciclo di trasfezione diluendo sei microlitri di un reagente di trasfezione specifico per irna a base lipidica in 130 microlitri di mezzo con siero ridotto.Diluire tre microlitri di S irna 10 micromolare in 130 microlitri di mezzo con siero ridotto. Combinare l'irna diluito con un reagente di trasfezione diluito e incubare per cinque-dieci minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, rimuovere il mezzo dalle cellule e aggiungere due millilitri di mezzo fresco senza antibiotici.Riscaldare preventivamente a 37 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 250 microlitri dei complessi del reagente di trasfezione con siRNA in ciascun pozzetto di cellule in una piastra a sei pozzetti. Quindi incubare le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.Dopo 24 ore, diluire cinque microlitri di irna 10 micromolare in 130 microlitri di mezzo con siero ridotto e procedere con un secondo ciclo di trasfezione come appena dimostrato. L'elevata concentrazione di sarna nel secondo ciclo è essenziale per ottenere un'elevata efficienza di silenziamento di B rca. A due.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per uno o due giorni prima dell'analisi, al fine di preparare il lisato cellulare per l'analisi mediante immunoblotting. Preparare un buffer di lisi fresco seguendo la ricetta indicata qui. Rimuovere il mezzo dalle cellule e aggiungere due millilitri per pozzetto di PBS freddo su ghiaccio per lavare le cellule.Quindi rimuovere completamente il PBS dalla piastra e aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi freddo di ghiaccio a ciascun pozzetto. Ruotare delicatamente la piastra per distribuire in modo uniforme il tampone di lisi e incubare su un agitatore rotante a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, utilizzando una spatola per cellule.Raccogliere il lisato cellulare in una provetta da microcentrifuga su ghiaccio, centrifugare a 17.900 ×g e a quattro gradi Celsius per 25 minuti e raccogliere il sopranatante per eseguire l'analisi di immunoblotting. Preparare il buffer di corsa diluendo 50 millilitri di buffer di corsa 20x tris acetato SDS con 950 millilitri di acqua distillata. Preparare il campione come segue.Aggiungere 15 microgrammi di lisato cellulare totale. Cinque microlitri di buffer campione 4x contenente solfato di litio ESAL pH 8,42, 2 microlitri di DTT 0,5 M e buffer di lisi fino a un volume totale di 20 microlitri. Denaturare i campioni a 55 gradi Celsius per 10 minuti.È fondamentale utilizzare questa temperatura poiché la proteina b RCA due è termosensibile. Successivamente, preparare la camera elettroforetica seguendo le istruzioni del produttore. Quindi caricare i campioni insieme a 10 microlitri di un marcatore proteico standard ad alto peso molecolare su un gel prefabbricato ed eseguire l'elettroforesi a 120 volt per circa due ore.Nel frattempo, preparare il buffer di trasferimento con 50 millilitri di buffer di trasferimento 20x, 100 millilitri di metanolo al 100% e 850 millilitri di acqua. Attivare la membrana in PVDF immergendola in metanolo al 100% per cinque minuti. Risciacquare con acqua distillata ed equilibrare nel buffer di trasferimento per almeno cinque minuti.Inzuppare le spugne dell'apparecchio di trasferimento nel buffer di trasferimento a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso. Arrestare la corsa prima che il marcatore blu di 55 kilodalton esca dal gel preconfezionato e assemblare il sandwich a partire da tre spugne inzuppate nel buffer di trasferimento. Quindi un foglio di carta da tre mm saturato nel buffer di trasferimento.Successivamente, aggiungere il gel, quindi la membrana PVDF attivata, seguita da una carta Whatman 3M imbevuta di tampone e infine da tre spugne imbevute. Posizionare il sandwich nell'apparato e trasferire le proteine a 350 milliampere per quattro ore a quattro gradi Celsius oppure a 180 milliampere e quattro gradi Celsius durante la notte. Al termine del trasferimento, lavare la membrana con TBS e bloccare per un'ora con TBST e latte in polvere scremato al 5%.Quindi sostituire il tampone con nove millilitri di tampone TBST contenente latte, aggiungendo 30 microlitri di anticorpo policlonale anti-BCA2 da coniglio, e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo aver lavato la membrana tre volte con TBST per 10 minuti ciascuna, incubare il filtro per un'ora con un microlitro di anticorpo secondario anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano, diluito in 10 millilitri di tampone TBST contenente latte. Dopo aver lavato la membrana tre volte, eseguire la rilevazione immunochemiluminescente KEMMA seguendo le istruzioni del produttore.Visualizzare le bande su pellicole ECL ad alta risoluzione per confermare la specificità dell'RNAi per B rca. A due. Un RNAi randomizzato è stato utilizzato in parallelo all'RNAi per B RCA due, come mostrato qui. Come menzionato in precedenza, è importante eseguire un secondo ciclo di trasfezione di RNAi con un elevato rapporto tra RNAi e reagente di trasfezione per ottenere un'elevata efficienza di silenziamento di B RCA A due.I risultati qui mostrati evidenziano la differenza nell'efficienza di silenziamento tra l'uso di un rapporto basso e alto di siRNA rispetto al transfezionamento, a seconda del tipo cellulare. Il tempo minimo ottimale per ottenere il massimo livello di silenziamento genico può variare dopo il secondo ciclo di transfezionamento dell'siRNA; ad esempio, come mostrato in questa figura, 24 ore sono sufficienti per le cellule tiroidee NTHY, mentre sono necessarie fino a 48 ore per un efficace silenziamento di B RCA A two nelle cellule prostatiche PNT one A. Il silenziamento di b RCA two è piuttosto stabile fino al settimo giorno dopo il secondo ciclo di transfezionamento. Come menzionato in precedenza, la denaturazione dei lisati cellulari a una temperatura superiore ai 55 gradi Celsius comporta una perdita fino al 50% della proteina B RCA A two.In questo esperimento, la sensibilità delle cellule PNT1A con B RCA A due volte silenziato al farmaco inibitore della PARP rucaparib è stata esaminata dopo un trattamento di 24 ore con il composto. Si è osservata una riduzione dipendente dal tempo della proliferazione cellulare nelle cellule PNT1A con B RCA due depletato rispetto ai controlli. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come silenziare geni che codificano per proteine lunghe mediante un CRNA e di come rilevare in modo efficiente il loro prodotto proteico attraverso una procedura immunochemiluminescente ottimizzata oltre a BRC due.Questa metodologia può essere applicata a molte altre proteine grandi e difficili, in particolare quando sono espresse a livelli molto bassi nelle cellule.

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