Name: Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di Coxiella burnetii Mutants transposon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Scopri come generare mutanti transposon fluorescenti di Coxiella burnetii e analizzarne i fenotipi di internalizzazione, replicazione e citotossicità. Questo metodo automatizzato consente di identificare i fattori essenziali nel ciclo infettivo del patogeno.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione Avenir/ATIP a Matteo Bonazzi e da una Marie Curie CIG (N° 293731) a Eric Martinez. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Robert Heinzen per la condivisione dei ceppi, degli anticorpi e degli strumenti di C. burnetii, Virginie Georget e Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) per la loro assistenza tecnica e l'analisi dei dati.

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Lo studio delle interazioni ospite / patogeno ha dimostrato di essere un metodo notevole per capire infezioni batteriche e sviluppare strategie alternative per contrastare malattie infettive. Tuttavia, a causa della diversità delle strategie elaborate da diversi batteri patogeni, l&#39;identificazione e la caratterizzazione di fattori di virulenza batterici e dell&#39;ospite vie di segnalazione che sono indirizzate durante le infezioni rappresentano una vera e propria sfida. Ciò richiede lo sviluppo di nuovi approcci per l&#39;identificazione su larga scala dei nodi principali di interazione ospite / patogeno. Il recente sviluppo di prodotti innovativi, ad alto throughput e tecniche di screening ad alto contenuto rappresenta una preziosa risorsa che può essere adattato allo studio di batteri patogeni intracellulari 15. Qui, abbiamo usato il zoonotici batterica patogeno coxiella burnetii come modello per sviluppare approcci di screening che combinano transposon mutagenesi e analisi basate sulla fluorescenza. Importantemente, questo metodo di screening consente il monitoraggio simultaneo di molteplici fasi del ciclo intracellulare Coxiella, fornendo una panoramica globale delle strategie sviluppate da questo batterio di invadere, replicare e persistono all&#39;interno delle cellule infette. L&#39;approccio qui descritto si basa su due tecniche ben consolidate, trasposone mutagenesi e saggi basati sulla fluorescenza, che sono state applicate con successo allo studio di batteri patogeni. Combinando queste tecniche nel contesto di schermi ad alta produttività / elevato contenuto permette di valutare gli effetti di un elevato numero di mutazioni batteriche analizzando un numero molto elevato di eventi (tipicamente 15.000 cellule infettate per mutazioni batteriche vengono esposte e analizzati). Ciò fornisce un importante analisi statistica di eventi come invasione batterica delle cellule ospiti e la replica intracellulare, che sono, per natura, ad una elevata variabilità. È importante notare che le linee cellulari diverse epithelial può essere utilizzato per questo tipo di screening. Tuttavia, le cellule epiteliali piatte e grandi sono ottimali per l&#39;analisi delle immagini come organelli delle cellule ospiti sono più facili da individuare. Poiché la maggior parte dei microscopi automatici può gestire automaticamente un gran numero di piatti, non ci sono limiti al numero di mutanti che possono essere proiettati contemporaneamente. A seconda del patogeno, il privilegio utente può l&#39;uso di un epifluorescenza o un microscopio confocale. Il tempo di acquisizione dell&#39;immagine sarà principalmente dipende dalla sensibilità della telecamera microscopio, il numero di campi acquisiti per pozzetto e dal numero di canali acquisiti per campo di vista. L&#39;utente può decidere come regolare questi fattori per ottimizzare il protocollo di screening. A titolo di esempio, abbiamo ripreso una 96-pozzetti / h utilizzando le condizioni di cui al punto 5.1. L&#39;analisi delle immagini dipende in gran parte la macchina (o cluster di macchine) utilizzato. Usiamo un 12-core (2 x 3,06 GHz 6-Core), 48 GB di RAM workstation. La macchina richiede approxirca 40 minuti per analizzare le immagini acquisite da una piastra. Un aspetto importante da prendere in considerazione nella preparazione di queste analisi è la messa a punto di nuovi (o l&#39;ottimizzazione di protocolli esistenti) per consentire la manipolazione e il trattamento di un gran numero di campioni. Un esempio tipico è lo sviluppo della singola colonia di primer PCR approccio, che ha permesso di amplificare rapidamente e frammenti di sequenza di DNA contenenti Coxiella il sito di inserimento di ciascun trasposone, da campioni molto piccoli. Sulla base della nostra esperienza, la polimerasi ad alta fedeltà deve essere attentamente selezionati e testati per ottenere risultati riproducibili. L&#39;unica limitazione di questo approccio può nascondere nell&#39;osservazione che, nella maggior parte dei casi, circa il 30% dei campioni trattati non sono sfruttabili, sia a causa della PCR o la procedura di sequenziamento. Tuttavia, considerando che l&#39;isolamento di nuovi mutanti di trasposoni Coxiella non è un fattore limitante, questo non rappreinviato un grosso problema. Analogamente, lo sviluppo di un test affidabile per quantificare la concentrazione batterica delle scorte mutanti è stato fondamentale per questo approccio. A causa della tendenza ad aggregarsi Coxiella quando in sospensione, l&#39;uso di letture di densità ottica non è applicabile per calcolare la concentrazione di culture Coxiella e l&#39;unica alternativa esistente era PCR quantitativa (qPCR). Qui, l&#39;uso di un DNA agente intercalante fluorescente contrassegnati notevolmente accelerato batteri quantificazione. Questo approccio può anche sfruttare l&#39;uso di linee cellulari stabili esprimenti marcatori fluorescenti per diversi compartimenti intracellulari seconda patogeno utilizzato. Un altro aspetto importante è l&#39;uso di colture cellulari privo di rosso fenolo. Abbiamo osservato che questo indicatore pH ha una fluorescenza naturale attraversa spettro rosso e verde che satura il segnale registrato sul lettore di fluorescenza automatizzato. Tegli strategia qui presentata si basa su casuale mutagenesi trasposoni. Per i mutanti di interesse, si consiglia di convalidare trasposizioni unici (e clonalità) con Southern blot e PCR amplificazioni del sito di inserimento trasposoni. Oltre al materiale descritto nella sezione protocollo, squadre interessate a utilizzare l&#39;approccio di screening qui presentato, avranno grande vantaggio nel set up di un database relazionale per la raccolta dati, un server per la memorizzazione dei dati e di una stazione di lavoro per l&#39;analisi delle immagini rapida. È importante sottolineare che il metodo qui descritto è adatto per lo studio di altri patogeni batterici intracellulari fornito un metodo di mutagenesi casuale esiste per il patogeno, linee cellulari possono essere infettati dal patogeno e questo mostra un fenotipo specifico durante l&#39;infezione.

L&#39;emergente, batterio endemico Coxiella burnetii è responsabile di grandi epidemie di febbre Q, una debilitante zoonosi simil-influenzale con grave salute e l&#39;impatto economico 1. I principali serbatoi di Coxiella sono animali domestici e da fattoria, e si stima che oltre il 90% dei bovini da latte negli Stati Uniti portano C. burnetii 2. Gli esseri umani sono ospiti accidentali che vengono infettati da inalazione di aerosol contaminati. Febbre Q umana si manifesta sia come una malattia acuta o cronica, che può avere complicanze fatali, con un tasso di mortalità raggiunge il 65% 1,3. Con una dose infettiva di 1 - 10 organismi, Coxiella è il patogeno più infettiva noto ed è stato studiato come potenziale arma bio 4. La recente epidemia esplosiva di febbre Q nei Paesi Bassi (2007 - 2010), con casi crescente da 182 a più di 2.000 all&#39;anno, si pone come un esempio della grave virulenza di questo patogeno5. La notevole efficienza di infezioni Coxiella è probabilmente associata con la sua resistenza allo stress ambientale, in combinazione con il suo adattamento unico di ospitare le cellule. Infatti, Coxiella è presente nell&#39;ambiente sotto forma di varianti metabolicamente inattive a piccole cellule (SCV), che sono notevolmente resistenti alle diverse condizioni difficili (essiccamento, temperatura, etc.). Distributori sono up presa da fagociti via α V β 3 integrine 6 mentre l&#39;invasione delle cellule non fagocitiche è mediato dal Coxiella adesione / invasione OmpA 7 e un recettore non ancora identificato. Dopo l&#39;assorbimento, Coxiella risiede in vacuoli aderenti, positivi per i marcatori endosomali primi Rab5 e EEA1 8. I batteri rispondono a endosomiale acidificazione convertendo alle varianti a grandi cellule metabolicamente attive (LCV) e l&#39;attivazione di un sistema di secrezione di tipo 4 Dot / Icm (T4SS) 9, Altamente omologa a quella di Legionella pneumophila 10. La secrezione di effettori Dot / ICM consente coxiella di generare un grande vano acido LAMP1-positivo contenente enzimi lisosomiali attivi dove i batteri possono prosperare e attivamente proteggere le cellule infette da apoptosi 11. Pertanto, il ciclo di intracellulare Coxiella è controllata dalla traslocazione Dot / Icm-mediata di effettori batterici 12, tuttavia, i fattori microbici coinvolti nell&#39;invasione cellula ospite, replicazione batterica e la diffusione dell&#39;infezione sono generalmente poco noti. La combinazione di trasposoni mutagenesi e analisi basate sulla fluorescenza, stiamo sviluppando approcci imparziali per l&#39;identificazione simultanea di fattori batterici coinvolti nelle fasi principali di infezioni Coxiella: 1) internalizzazione all&#39;interno delle cellule ospiti, 2) la replica intracellulare, 3) spread cella-a-cella e 4) la persistenza. Fino ad oggi, abbiamo proiettato oltre 1.000 mutations in 500 sequenze Coxiella codificanti, che ci ha fornito intuizioni senza precedenti nelle interazioni ospite-patogeno che regolano Coxiella patogenesi 7. Da notare, questo approccio può essere applicato allo studio di altri patogeni intracellulari che condividono caratteristiche di biologia cellulare con Coxiella.

<table><tbody><tr><td>Acido citrico</td><td>Sigma</td><td>C0759-500G</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S4641-500G</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio</td><td>Sigma</td><td>60218-100G</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Solfato di ferro</td><td>Sigma</td><td>F8633-250G</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S9625-500G</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>L-cisteina</td><td>Sigma</td><td>C6852-25G</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Bacto Neopeptone</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>211681</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Casamino acidi</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>223050</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Metil-B-ciclodestrina</td><td>Sigma</td><td>C4555-10G</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>RPMI con glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>RPMI con glutamax, senza rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td>Per coltura cellulare e infezione</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>GE sanità</td><td>SH30071</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA (0,25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td>Per colorazione in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td>Per colorazione in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Per colorazione in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Cuvetta per elettroporazione 0,1 cm</td><td>Eurogentec</td><td>ce0001-50</td><td>Per la trasformazione Coxiella</td></tr><tr><td>Trackmates tubi con tappo a vite con tappi</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741</td><td>Tappo a vite 2D con codice a barre</td></tr><tr><td>Micropiastra a 96 pozzetti con pareti e fondo</td><td>neri Greiner</td><td>655076</td><td>Fondo scuro piatto, per quantificazione dsDNA</td></tr><tr><td>Micropiastra PCR a 96 pozzetti</td><td>Biorad</td><td>2239441</td> Piastra a 96 pozzetti <td>priva di DNAsi/RNAsi</td></tr><tr><td>, deepwell</td><td>Labcon</td><td>949481</td><td>Per infezioni mutanti Coxiella</td></tr><tr><td>PicoGreen</td><td>Life Technologies</td><td>P7581</td><td>Per la quantificazione del dsDNA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>Per la quantificazione del dsDNA</td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>Per singolo colonia di primer PCR</td></tr><tr><td>Celltracker Rosso CMTPX</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td>Per l'imaging</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-LAMP1</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>Per colorazione in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>L1418</td><td>Per l'imaging</td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre a fluorescenza Infinite 200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio automatizzato per epifluorescenza Cellomica</td><td>Termo Scientifico</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation e multi-fenotipica screening-alto contenuto di<em&gt; coxiella burnetii</em&gt; mutants transposon

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasione e la colonizzazione delle cellule ospiti di batteri patogeni dipendono dall&#39;attività di un gran numero di proteine ​​procariotiche, definite come fattori di virulenza, che può sovvertire e manipolare funzioni host chiave. Lo studio delle interazioni ospite / patogeno è quindi estremamente importante per comprendere le infezioni batteriche e di sviluppare strategie alternative per combattere le malattie infettive. Questo approccio tuttavia, richiede lo sviluppo di nuovi saggi high throughput per la imparziale, l&#39;identificazione automatica e la caratterizzazione dei determinanti di virulenza batterica. Qui, si descrive un metodo per la generazione di una libreria mutante GFP-tagged by trasposone mutagenesi e lo sviluppo di screening ad alto contenuto di approcci per l&#39;identificazione simultanea di più fenotipi trasposoni-associata. Il nostro modello di lavoro è intracellulare batterica burnetii patogeno Coxiella, l&#39;agente eziologico della febbre zoonosi Q, che è associato con sévere epidemie con un conseguente onere sanitario e economico. La natura obbligato intracellulare di questo patogeno è, fino a poco tempo, gravemente ostacolato l&#39;identificazione dei fattori batterici coinvolti nella patogeno ospite, rendendo di Coxiella il modello ideale per l&#39;attuazione di approcci high-throughput / alto contenuto.

Dopo l&#39;isolamento di mutanti di trasposoni, singola colonia innesco PCR è un robusto, metodo di high-throughput per identificare il sito di inserimento trasposoni per ogni mutante. Questo approccio deriva da un tipico protocollo nested PCR ma qui un singolo innesco ibrida specificamente e / o non specifico per il DNA template seconda della rigorosità della temperatura di ricottura (Figura 1A). I prodotti tipici di PCR costituiti da più frammenti di DNA, la maggior parte dei quali sono specifici (Figura 1B). L&#39;uso di un diverso Primer di sequenziamento che annealing proprio a monte della ITR trasposone, ed a valle della sequenza riconosciuta da primer di amplificazione prevede specificità per la fase di sequenziamento (Figura 1C). Software automatizzato per l&#39;analisi di sequenza allinea le sequenze ottenute al genoma Coxiella fornendo il luogo esatto di inserzione di trasposoni (Figura 1C). Tutti inserzione di trasposoni possono essere quindi annotated sul genoma Coxiella (Figura 1D). Ogni mutante Coxiella è isolata e amplificata in condizioni asettiche in ACCM-2 di media prima di uno stoccaggio o di screening. La Figura 2 illustra un esempio di 38 mutanti di trasposoni in 16 punti / ICM geni Coxiella (Figura 2A). Per valutare la fattibilità di mutanti Coxiella, curve di crescita axeniche sono ottenute campionando colture batteriche per 7 giorni post-inoculazione e l&#39;applicazione del test di concentrazione batterica descritto in 1.5 (Figurie 2B). Mutanti amplificati vengono poi incubate con cellule epiteliali, in triplicato piastre a 96 pozzetti per 7 giorni. Tutti i mutanti Coxiella generati essendo GFP-tag, curve di crescita intracellulari sono ottenute misurando l&#39;intensità di fluorescenza GFP di ogni pozzetto, ogni 24 ore, e riportando i valori misurati in funzione del tempo (Figura 2C). Intrcurve di crescita acellulari forniscono analisi quantitativa dei fenotipi associati con ogni inserimento trasposoni nel genoma Coxiella. Per aggiungere informazioni qualitative sugli stessi mutanti di trasposoni, abbiamo optato per l&#39;acquisizione automatica delle immagini e analisi. Sette giorni dopo l&#39;infezione, le piastre sono fissate, trasformati per immunofluorescenza come descritto in 4 e analizzati utilizzando un processo automatizzato, microscopio a epifluorescenza come descritto nella 5. immagine automatica software di analisi come CellProfiler (Broad Institute, <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) elabora i canali acquisiti oggetti per analisi comparative (figura 3) in modo indipendente e segmenti identificati. Questo consente l&#39;identificazione e la caratterizzazione morfologica dei nuclei ospitanti cellulari, contorni di cellule, lisosomi e Coxiella colonie (Figura 3 pannelli superiori). Correlazione colonie Coxiella con le cellule ei lisosomi permette ai Identificatisu e specifiche analisi morfologica di Coxiella vacuoli -non (che sono LAMP1 positivi, Figura 3 pannello in basso a sinistra). Correlazione colonie Coxiella con contorni della cellula ospite consente l&#39;identificazione e specifica analisi morfologica delle cellule infette (Figura 3 pannello in basso al centro). Infine, i 4 canali vengono uniti per scopi di controllo qualità illustrazione e (Figura 3 in basso pannello di destra). I dati ottenuti da analisi delle immagini automatizzata possono essere tracciati uno contro l&#39;altro per ottenere &quot;grafici a dispersione multi-fenotipiche&quot;. Come esempio, nella Figura 4A zona media (in micron 2) di colonie Coxiella è tracciata contro il numero di colonie per cella (Figura 4A), al fine di identificare mutazioni che influenzano la replicazione intracellulare di Coxiella (replica fenotipo) e / o la capacità dei batteri di invadere le cellule ospiti (internalization fenotipo). L&#39;analisi statistica è stata usata per definire le regioni nel risultante grafico a dispersione corrispondente a lievi (-4 &lt;Z-score ≤ -2) e grave (Z-score ≤ -4) fenotipi. Mutanti sono stati osservati in 3 gruppi principali: le mutazioni che hanno determinato una crescita intracellulare difettoso di Coxiella sono stati raggruppati nella parte più a sinistra del grafico (Figura 4A, puntini rosa e rosso); mutazioni che hanno interessato Coxiella internalizzazione nelle cellule sono state raggruppate nella parte inferiore del grafico (Figura 4A, blu chiaro e scuro punti) e, infine, i punti verdi nella regione più a destra della trama corrisponde a mutazioni conseguente fenotipi non significativi ( Z-score&gt; -2). È importante sottolineare che, mutanti che non riescono a replicare, ma sono ancora in grado di invadere le cellule ospiti, vengono rilevati dopo 7 giorni di infezione da batteri singoli o piccole colonie, adiacente ad ospitare nuclei delle cellule (Figura 4C, secondo pannello). Pertanto, la dimensione di Coxiella colo &quot;Nies &quot;sarà influenzato in modo significativo, ma il numero delle cellule infette non varierà rispetto alle cellule -infected WT Coxiella. Al contrario, le mutazioni che influenzano la capacità di Coxiella di invadere cellule ospiti determinano una diminuzione del numero di colonie / cellule. Quando questo numero è significativamente inferiore a 1, indica che, in media, vi è una diminuzione del numero complessivo di cellule infette. In alternativa, l&#39;area media (in micron 2) delle colonie Coxiella può essere tracciata contro il numero di cellule ospiti sopravvissute infezione (Figura 4B), per identificare mutazioni che conferiscono citotossicità di Coxiella (fenotipo citotossico). Come sopra, l&#39;analisi statistica è stata usata per definire le regioni nel risultante grafico a dispersione corrispondente a lievi (-4 &lt;Z-score ≤ -2) e grave (Z-score ≤ -4) fenotipi. La maggior parte screening mutazioni non ha influenzato in modo significativo la sopravvivenza delle cellule, indipendentemente replicazione batterica all&#39;interno di hostcellule (punti verdi Figura 3B). 37 mutazioni sopravvivenza della cellula ospite forma lieve (Figura 3B, punti luce rossa), e 7 mutazioni erano particolarmente dannoso per ospitare sopravvivenza cellulare (figura 3B, puntini rossi scuri). Si noti che i parametri addizionali ottenute dall&#39;immagine procedura di analisi automatica possono essere usate per derivare altri grafici, a seconda delle esigenze sperimentali. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. Sequencing e annotazione di Coxiella mutanti di trasposoni (A) primer colonia singola PCR è usato per amplificare frammenti di DNA contenenti il sito di inserimento trasposoni. Un primer di amplificazione (Amp) è utilizzato sia come primer specifici e non specifici a seconda della rigorosità della temperatura di ricottura. (B) Tipico risultato di singola colonia di primer PCR. Ogni riattisu produce una serie di frammenti di dimensioni variabili, alcune delle quali contengono il sito di inserzione trasposone; alcuni altri sono amplificati casualmente come sottoprodotti della bassa stringenza ciclo PCR. (C) L&#39;uso di un primer di sequenziamento (Seq) che ibridizza alla sequenza trasposone permette il sequenziamento dei frammenti di interesse. Software (D) Le analisi della sequenza consente l&#39;annotazione automatica di inserzione di trasposoni sul genoma batterico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2:. Axeniche e la crescita intracellulare di Coxiella mutanti di trasposoni (A) Nella schermata pilota, abbiamo isolato, sequenziato e proiettato 38 mutanti di trasposoni in 16 nucleo gEnes del sistema di secrezione dot / ICM Coxiella (indicati in rosso). (B) Al fine di valutare la fattibilità di ogni mutante trasposoni, la crescita di ogni isolare in terreno di coltura axeniche viene monitorata in 8 giorni utilizzando una fluorescenza tagged agente intercalante del DNA. (C) Ogni mutante viene quindi utilizzato per infettare cellule epiteliali. Come il trasposone possiede una cassetta GFP, la crescita batterica intracellulare è monitorato oltre 7 giorni di infezione, seguendo le variazioni di fluorescenza GFP associata con la replica Coxiella, usando un lettore per micropiastre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3: analisi delle immagini automatizzata delle infezioni Coxiella Un auto.microscopio a epifluorescenza accoppiate viene utilizzato per l&#39;immagine di 21 posizioni per pozzetto di triplicato piastre da 96 pozzetti. I segmenti software di analisi dell&#39;immagine oggetti in ogni canali acquisiti per la quantificazione e analisi. In tutti i casi, sono esclusi oggetti toccano il bordo delle immagini. (A) Il canale Hoechst è utilizzato per identificare i nuclei della cellula ospite (cerchiato in verde). (B) Questi sono usati come semi per identificare contorni della cellula ospite nel canale Cy3 (la posizione dei nuclei è cerchiato in blu, contorni cellulari sono in verde). (C) Il canale Cy5 è utilizzato per identificare compartimenti LAMPADA1-positive (cerchiato in verde); solo gli oggetti inclusi nei contorni di cellule individuate in precedenza (in rosso) sono conservati per l&#39;analisi delle immagini. (D) Il canale GFP viene utilizzato per identificare colonie Coxiella (cerchiato in verde). (E) Correlazione colonie Coxiella con scomparti LAMPADA1 positivo permette l&#39;identificazione di Coxiella </em&gt; vacuoli -contenenti (CCV); solo gli oggetti inclusi nei contorni di cellule individuate in precedenza (in verde) sono conservati per l&#39;analisi delle immagini. (F) Correlazione colonie Coxiella con contorni cellulari permette l&#39;identificazione delle cellule infette (pseudocolored). (G) Le immagini acquisite nei 4 canali di fluorescenza (corrispondente a colonie Coxiella (verde), nuclei delle cellule ospite (blu), membrana plasmatica della cellula ospite (grigio), compartimenti LAMPADA1-positivo (rosso)) vengono fuse e utilizzata per l&#39;illustrazione e la qualità controllo. Scala bar 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4: identificazione su larga scala dei fattori coinvolti nella Coxiella host / patogeno interagisconoioni. (A) La superficie media (in micron 2) di colonie Coxiella è tracciata contro il numero relativo di colonie per cella, per identificare replica e internalizzazione fenotipi di interesse. Punti verdi rappresentano fenotipi che si discostano da WT coxiella da un Z-score&gt; -2 (non significativo). Rosa e puntini blu rappresentano replica e internazionalizzazione fenotipi, rispettivamente, con un Z-score tra -2 e -4 (fenotipi lievi). Rosso e puntini blu scuro rappresentano fenotipi con Z-score ≤ -4 (fenotipi forti). (B) La superficie media (in micron 2) delle colonie Coxiella è stata tracciata contro il numero totale di cellule infettate (e non infetti) sopravvissute 7 giorni di infezione per valutare l&#39;effetto citotossico risultante dalla inserzione di trasposoni. Punti verdi rappresentano fenotipi che si discostano da WT coxiella da un Z-score&gt; -2 (non significativo). Puntini rosa rappresentano citotossico phenotypes con Z-score tra -2 e -4 (fenotipi lievi). I punti rossi rappresentano fenotipi citotossici con Z-score ≤ -4 (fenotipi forti). Le frecce indicano mutanti illustrate dal corrispondente lettera minuscola in C. (C) Immagini rappresentative della replica, internalizzazione e fenotipi citotossici. In tutti i casi, i nuclei delle cellule ospiti sono in rosso, colonie Coxiella sono in verde. Scala bar 50 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Coxiella burnetii è un batterio Gram-negativi obbligato intracellulare responsabile della zoonotici malattia febbre Q. Qui si descrivono i metodi per la generazione di Coxiella mutanti di trasposoni fluorescente nonché l&#39;identificazione automatizzata e l&#39;analisi dei risultanti internalizzazione, replica e citotossici fenotipi.

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare su larga scala i fattori COE implicati nei passaggi chiave del ciclo infettivo, inclusi l'ingresso nelle cellule ospiti, la generazione di un nicchia replicativa batterica e la persistenza. Questo viene ottenuto innanzitutto generando una libreria di doppi mutanti GF PT mediante mutagenesi mediata da trasposone.Successivamente, le cellule ospiti vengono infettate con ciascun mutante isolato. Quindi, la replicazione intracellulare di ogni mutante viene monitorata in tempo reale mediante un lettore di micropiastre, al fine di identificare le mutazioni che compromettono maggiormente l'infezione da Coxiella. Infine, le cellule infettate da Coxiella vengono analizzate mediante microscopia automatizzata.In definitiva, l'analisi automatizzata delle immagini consente la caratterizzazione morfologica di ogni fenotipo ottenuto, associando ciascun gene mutato a una funzione putativa nel ciclo infettivo di Coxiella. Questo metodo può contribuire a risolvere questioni fondamentali nel campo delle interazioni ospite-patogeno, come l'identificazione su larga scala dei geni essenziali di un determinato patogeno necessari per interagire con l'intera cellula e sfruttarne a proprio vantaggio i meccanismi molecolari. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la semina e l'isolamento delle colonie di COE sono difficili da ottenere.Effettivamente, il COE forma colonie molto piccole che devono essere estratte con attenzione dall'ACCM morbido due aro. In che modo questo metodo può fornire informazioni sull'infezione da lab coccale. Può inoltre essere applicato ad altri batteri patogeni intracellulari come salmonella, burel, mycobacterium, e così via.Dopo aver trasformato cellule competenti di Coxiella con plasmidi contenenti il trasposone e la trasposasi secondo il protocollo descritto nel testo, per isolare mutanti individuali, preparare l'agarosio inferiore mescolando 10 millilitri di agarosio fuso al 0,5% con 10 millilitri di due X ACCM, in un armadio di sicurezza microbiologica (MSC), aggiungere immediatamente gli antibiotici appropriati, versare in una piastra di Petri e lasciare raffreddare scoperto per 30 minuti, quindi essiccare all'aria per 20 minuti. Per preparare l'agarosio superiore, mescolare 1,25 millilitri di due X ACCM due con 0,75 millilitri di acqua in un tubo in polistirene da 15 millilitri. Aggiungere gli antibiotici appropriati e incubare a 37 gradi Celsius.Quindi aggiungere da uno a 100 microlitri di coltura batterica e vortexare per cinque secondi. Successivamente, aggiungere 0,5 millilitri di aros mix fuso e versare immediatamente sopra l'aros di fondo. Lasciare raffreddare la piastra per 20 minuti.Posizionare il coperchio in alto e incubare a quattro gradi Celsius per 20 minuti per favorire la solidificazione. Rimuovere quindi il coperchio e lasciare asciugare all'aria la piastra per 20 minuti prima di trasferirla in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica e 2,5% di ossigeno per sei o sette giorni. Una volta rilevabili le colonie, raccoglierle tagliando l'estremità di una punta per pipetta da un millilitro e utilizzandola per isolare tappi contenenti singole colonie.Quindi trasferirli nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente 1,5 millilitri di accm due. Dopo aver preparato una curva standard, secondo il protocollo descritto nel testo, quantificare ciascuna sospensione batterica dispensando cinque microlitri di Triton X-100 al 10% per pozzetto. In una micropiastrella a 96 pozzetti con pareti e fondo neri, aggiungere 50 microlitri delle sospensioni batteriche in ciascun pozzetto e incubare su un agitatore per piastre per 10 minuti.A temperatura ambiente, utilizzare un buffer XTE per diluire il reagente di quantificazione del DNA a doppio filamento di 1 a 200 e aggiungere 55 microlitri del reagente diluito a ciascun campione. Nella piastra microtitolazione a 96 pozzetti, mescolare bene con uno shaker per piastre prima di incubare al buio a temperatura ambiente per due-cinque minuti; quindi misurare la fluorescenza dei campioni utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza con filtri per le lunghezze d'onda standard della fluoresceina. Per ottenere il grafico della concentrazione del DNA batterico, utilizzare le letture di fluorescenza nella curva standard precedentemente preparata e dividere la concentrazione del DNA per la massa del genoma di Coxiella per determinare la concentrazione batterica.Esprimere i risultati in equivalenti genomici per millilitro dopo aver eseguito la PCR su colonie con un singolo primer e il sequenziamento del DNA secondo il protocollo descritto nel testo. Utilizzando un software di analisi delle sequenze, caricare il genoma annotato completo di Coxiella burnetii 493 NM con la funzione di allineamento al genoma di riferimento, caricare e allineare i risultati delle sequenze mediante blastn e determinare il sito di trasposizione. Dopo aver preparato una sospensione di cellule Vero a una concentrazione di 10 alla quinta cellule per millilitro in mezzo RPMI, secondo il protocollo descritto nel testo, distribuire 100 microlitri della sospensione in ciascuna pozzetta di una piastra nera a 96 pozzette con fondo piatto e trasparente, centrifugare la piastra a 400 × g per cinque minuti a temperatura ambiente e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tutta la notte.Il giorno successivo, trasferire a temperatura ambiente le piastre a 96 pozzetti contenenti i mutanti di Coxiella e diluire 150 microlitri di sospensioni batteriche in 300 microlitri di RPMI senza rosso fenolo e FBS in una piastra a 96 pozzetti profondi. Successivamente, rimuovere il mezzo dalle cellule Vero e distribuire 100 microlitri per pozzetto dei mutanti di Coxiella diluiti. Utilizzare il pozzetto A1 come controllo negativo e i pozzetti A2 e A3 come controlli positivi. Usando un portapiastra per centrifuga ermetico contro gli aerosol, centrifugare la piastra a 400 × g e a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo aver incubato la piastra a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata al 5% di anidride carbonica per due ore, sostituire il mezzo contenente i batteri con 100 microlitri per pozzetto di mezzo RPMI completo fresco. Leggere la fluorescenza con un lettore per micropiastre dotato di filtri per la fluoresceina.Misurare la fluorescenza GFP ogni giorno per sette giorni. Al settimo giorno post-infezione, rimuovere il mezzo dalla piastra e sostituirlo con 50 microlitri per pozzetto di mezzo completo fresco contenente una diluizione 1:1000 di un colorante fluorescente permeabile alle cellule. Incubare le cellule per 30-60 minuti; al termine dell'incubazione, sostituire il mezzo con 50 microlitri per pozzetto di 4% PFA in PBS e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Rimuovere quindi il tampone contenente la PFA prima di lavare i pozzetti con PBS per tre volte. Dopo aver rimosso l'ultimo lavaggio, aggiungere 50 microlitri di soluzione bloccante in ogni pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.Quindi sostituire la soluzione di blocco con 40 microlitri per pozzetto, una soluzione di blocco fresca e una diluizione 1:500 dell'anticorpo anti-lamp1. Dopo un'incubazione a temperatura ambiente per 30 minuti, rimuovere la soluzione e utilizzare un lavatore di piastre per lavare i pozzetti cinque volte, applicando 100 microlitri per pozzetto di PBS. Quindi aggiungere 40 microlitri per pozzetto di soluzione di blocco contenente l'anticorpo secondario fluorescente appropriato e hooked 3 3 2 5 8 a cinque microgrammi per millilitro.Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare i campioni cinque volte e lasciare l'ultimo lavaggio con PBS nei pozzetti per evitare che si secchino. Per l'acquisizione delle immagini, utilizzare un microscopio automatizzato a fluorescenza in epifluorescenza dotato di un obiettivo 20x e canali da 3 4 88 5 55 e sei 15 nanometri.Acquisire 21 campi indipendenti per pozzetto al fine di ottenere un'immagine di almeno 5.000 cellule per campione. Applicare la messa a fuoco automatica utilizzando il canale dei nuclei delle cellule ospiti come riferimento. Infine, utilizzare l'analisi automatica delle immagini per estrapolare un numero di caratteristiche rilevanti dalle immagini acquisite.Questa figura illustra 38 trasposoni su mutanti in 16 punti dell'ICM Coxe L a Genes aen, le curve di crescita che valutano la vitalità dei mutanti sono mostrate qui. Le curve di crescita intracellulare per i mutanti di Coxiella incubati con cellule epiteliali forniscono un'analisi quantitativa dei fenotipi associati agli inserimenti di trasposone nel genoma di Coxiella. In questa figura, l'acquisizione automatica delle immagini è stata eseguita per identificare e caratterizzare i nuclei delle cellule ospiti, i contorni cellulari, i lisosomi e le colonie di Coxiella.La correlazione tra colonie di Coxiella e cellule e lisosomi permette l'analisi morfologica delle vacuole contenenti Coxiella. La correlazione tra colonie di Coxiella e i contorni delle cellule ospiti consente l'analisi morfologica delle cellule infette. Infine, i quattro canali vengono sovrapposti.L'area media delle colonie di Coxiella è riportata in funzione del numero di colonie per cellula al fine di identificare mutazioni che influenzano la replicazione intracellulare di Coxiella e/o la capacità dei batteri di invadere le cellule ospiti. Sono stati osservati mutanti in tre gruppi: mutazioni che influiscono sulla crescita intracellulare di Coxiella, sull'internalizzazione di Coxiella nelle cellule e su fenotipi non significativi. Qui, l'area media delle colonie di Coxiella è riportata in funzione del numero di cellule ospiti sopravvissute all'infezione per identificare mutazioni che conferiscono citotossicità a Coxiella dopo il suo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle infezioni batteriche per esplorare le interazioni tra ospite e patogeno su larga scala, identificando i bersagli dell'ospite e dei batteri per lo sviluppo di nuove terapie contro le malattie infettive.

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