Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di Coxiella burnetii Mutants transposon

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di identificare su larga scala. I fattori COE implicati nelle fasi chiave del ciclo infettivo, tra cui l'ingresso nelle cellule ospiti, la generazione di una nicchia replicativa batterica e la persistenza. Ciò si ottiene generando prima una libreria di comutanti GF PT mediante trasposizione sulla mutagenesi.

Successivamente, le cellule ospiti vengono infettate da ogni mutante isolato. Quindi la replicazione intracellulare di ogni mutante viene seguita in tempo reale utilizzando un lettore di micropiastre al fine di identificare le mutazioni più dannose per l'infezione da coxiella. Infine, le cellule infette da coxiella vengono analizzate mediante microscopia automatizzata.

In definitiva, l'analisi automatizzata delle immagini consente la caratterizzazione morfologica di ogni fenotipo ottenuto per associare a ciascun gene mutato una funzione putativa nel ciclo infettivo della coxiella. Questo metodo può aiutare ad affrontare questioni chiave nel campo delle interazioni ospite-patogeno, come l'identificazione su larga scala dei geni essenziali di un dato patogeno necessari per interagire con l'intera cellula e dirottare i suoi macchinari molecolari a suo vantaggio. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la placcatura e l'isolamento delle colonie di COE sono difficili da ottenere.

Infatti, il COE forma colonie molto piccole che devono essere accuratamente estratte da ACCM due aro morbidi. In che modo questo metodo può fornire informazioni sull'infezione da laboratorio del coccico. Può anche essere applicato ad altri batteri patogeni intracellulari come salmonella, burel, micobatterio, eccetera.

Dopo aver trasformato coxiella competenti con plasmidi di rivestimento trasposone e trasposasi secondo il protocollo di testo, per isolare i singoli mutanti, preparare gli aro di fondo mescolando 10 millilitri di aros 0,5% fuso con 10 millilitri di due X accm, due in una cabina di sicurezza microbica o MSC e aggiungere gli antibiotici appropriati, versare immediatamente in una capsula di Petri e lasciarla raffreddare scoperta per 30 minuti e poi asciugare all'aria per 20 minuti. Per preparare il top bag aros, mescolare 1,25 millilitri di due x accm due con 0,75 millilitri di acqua in un tubo di polistirene da 15 millilitri. Aggiungere gli antibiotici appropriati e incubare a 37 gradi Celsius.

Quindi aggiungere da uno a 100 microlitri di coltura batterica e agitare per cinque secondi. Successivamente, aggiungere 0,5 millilitri di miscela di aros sciolta e versare immediatamente sul fondo. Lasciare raffreddare la piastra per 20 minuti.

Metti il coperchio sopra e incuba a quattro gradi Celsius per 20 minuti per aiutare a solidificare. Quindi rimuovere il coperchio e asciugare la piastra all'aria per 20 minuti prima di trasferirla in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e il 2,5% di ossigeno per sei o sette giorni. Una volta che le colonie sono rilevabili, raccoglierle tagliando l'estremità di un puntale per pipetta da un millilitro e utilizzandolo per isolare i tappi contenenti singole colonie.

Trasferirli poi nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente 1,5 millilitri di accm due. Dopo aver preparato una curva standard, secondo il protocollo di testo, quantificare ogni sospensione batterica erogando cinque microlitri di Triton X 100 al 10% per pozzetto. In una micropiastra da 96 pozzetti con pareti e fondo neri, aggiungere 50 microlitri di sospensioni batteriche a ciascun pozzetto e incubare su un agitatore per piastre per 10 minuti.

A temperatura ambiente, utilizzare un tampone XTE per diluire il reagente di quantificazione del DNA a doppio filamento da uno a 200 e aggiungere 55 microlitri di reagente diluito a ciascun campione. Nella micropiastra a 96 pozzetti con un agitatore per piastre ben miscelato prima di incubare al buio a temperatura ambiente per due-cinque minuti, misurare la fluorescenza dei campioni utilizzando un lettore di micropiastre a fluorescenza e filtri per lunghezze d'onda standard della fluoresceina. Per ottenere il grafico della concentrazione di DNA batterico, le letture di fluorescenza nella curva standard precedentemente preparata, dividere la concentrazione di DNA per la massa del genoma della coxiella per ottenere la concentrazione batterica.

Esprimere i risultati in equivalenti genomici per millilitro dopo aver eseguito la PCR con singola colonia di primer e il sequenziamento del DNA secondo il protocollo di testo. Utilizzando il software di analisi della sequenza, caricare il genoma annotato completo di Coxiella Burnett I 4 93 NM one con la funzione di allineamento al riferimento, caricare e allineare i risultati della sequenza utilizzando il blast N e determinare il sito di trasposizione. Dopo aver preparato una sospensione di cellule Vero da 10 a un quinto di cellule per millilitro in terreno RPMI, secondo il protocollo di testo, erogare 100 microlitri di sospensione in ciascun pozzetto di una piastra nera a 96 pozzetti con fondo piatto e trasparente, centrifugare la piastra a 400 volte G e stanza per cinque minuti e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica durante la notte.

Il giorno seguente cadere a temperatura ambiente 96 piastre a pozzetti contenenti i mutanti coxiella e diluire 150 microlitri di sospensioni batteriche in 300 microlitri di RPMI senza rosso fenolo e FBS in una piastra profonda a 96 pozzetti Successivamente, rimuovere il terreno dalle cellule Vero ed erogare 100 microlitri per pozzetto di mutanti coxiella diluiti. Utilizzare il pozzetto A uno come controllo negativo e i pozzetti a due e tre come controlli positivi utilizzando un supporto per piastra da centrifuga a tenuta di aerosol, centrifugare la piastra a 400 volte G e temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, dopo aver incubato la piastra a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata al 5% di anidride carbonica per due ore, sostituire il terreno contenente batteri con 100 microlitri per pozzetto di terreno RPMI completo fresco con un lettore di micropiastre a fluorescenza e filtri per fluoresceina.

Misurare la fluorescenza GFP ogni giorno per sette giorni Il settimo giorno dopo l'infezione, rimuovere il terreno dalla piastra e sostituirlo con 50 microlitri per pozzetto di terreno completo fresco contenente una diluizione da uno a 1000 di colorante fluorescente permeabile alle cellule. Incubare le cellule per 30-60 minuti dopo l'incubazione, sostituire il terreno con 50 microlitri per pozzetto di PFA al 4% in PBS incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi rimuovere il tampone contenente PFA prima di utilizzare il PBS per lavare i pozzetti tre volte Dopo aver rimosso il lavaggio finale, erogare 50 microlitri di soluzione bloccante in ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Quindi sostituire la soluzione bloccante con 40 microlitri per pozzetto, una soluzione bloccante fresca e una diluizione da uno a 500 di anticorpo anti lampada uno. Dopo l'incubazione a temperatura ambiente per 30 minuti, rimuovere la soluzione e utilizzare una lavatrice per piastre per lavare i pozzetti cinque volte applicando 100 microlitri per pozzetto di PBS. Quindi aggiungere 40 microlitri per pozzetto di soluzione bloccante contenente l'anticorpo secondario fluorescente appropriato e agganciare 3, 3, 2, 5, 8 a cinque microgrammi per millilitro.

Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare i campioni cinque volte e lasciare il lavaggio finale del PBS nei pozzetti per evitare che si secchino. Per effettuare l'acquisizione delle immagini, utilizzare un microscopio automatizzato a epifluorescenza dotato di un obiettivo 20x e 3, 4, 88, 5, 55 e sei canali da 15 nanometri.

Acquisisci 21 campi indipendenti per pozzetto al fine di visualizzare un minimo di 5.000 cellule per campione. Applicare la messa a fuoco automatica utilizzando il canale dei nuclei della cellula ospite come riferimento. Infine, utilizzare l'analisi automatizzata delle immagini per estrapolare una serie di caratteristiche rilevanti dalle immagini acquisite.

Questa figura illustra 38 trasposizioni su mutanti in ICM Coxe L a 16 punti Le curve di crescita dei geni che valutano la vitalità dei mutanti sono mostrate qui. Qui. Le curve di crescita intracellulare per mutanti di coxiella incubati con cellule epiteliali forniscono un'analisi quantitativa dei fenotipi associati alla trasposizione sulle inserzioni nel genoma di coxiella. In questa figura, è stata eseguita l'acquisizione automatizzata di immagini per identificare e caratterizzare i nuclei delle cellule ospiti, i contorni cellulari, i lisosomi e le colonie di coxiella.

La correlazione delle colonie di coxiella con cellule e lisosomi consente l'analisi morfologica di coxiella contenente vacuoli. La correlazione delle colonie di coxiella con i contorni delle cellule ospiti consente l'analisi morfologica delle cellule infette. Infine, i quattro canali vengono uniti.

L'area media delle colonie di coxiella viene tracciata rispetto al numero di colonie per cellula al fine di identificare le mutazioni che influenzano la replicazione intracellulare della coxiella e/o la capacità dei batteri di invadere le cellule ospiti. Sono stati osservati mutanti in tre mutazioni a grappolo che hanno influenzato la crescita intracellulare dell'internalizzazione della coxiella coxiella nelle cellule e fenotipi non significativi. Qui, l'area media delle colonie di coxiella viene tracciata rispetto al numero di cellule ospiti sopravvissute all'infezione per identificare le mutazioni che conferiscono citotossicità alla coxiella dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle infezioni batteriche per esplorare le interazioni ospite-patogeno su larga scala e ha identificato l'ospite e i bersagli batterici per lo sviluppo di nuove terapie per contrastare le malattie infettive.