Name: Simultaneo Ex vivo Test funzionale di due retine per In vivo Sistema Elettroretinogramma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Scopri l'elettroretinogramma ex vivo per analizzare la funzione cellulare della retina isolata di topo. Questo metodo permette di dissezionare le vie di segnalazione dei bastoncelli e dei coni con farmacologia e stimolazione luminosa.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH sovvenzioni EY019312 e EY021126 (vjk), EY002687 al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive presso la Washington University, e da Research per prevenire la cecità.

Tutti i protocolli sperimentali sono stati in conformità con la guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale Animal Studies presso la Washington University. 1. Impostazione perfusione e Campione di laboratorio <ol><li> Preparare la soluzione per perfusione retina fresco il giorno dell&#39;esperimento. Utilizzare acqua distillata e deionizzata. Utilizzare una delle seguenti tre soluzioni. <ol><li> Preparare Bicarbonato contenenti &#39;soluzione (1 L): 1 bottiglia di Ames&#39; Ames media e 1,9 g di NaHCO 3, </li><li> Preparare la soluzione di Locke (in mM): 112.5 NaCl, 3.6 KCl, 2,4 MgCl 2, 1.2 CaCl 2, 10.0 HEPES, 20.0 NaHCO 3, 3.0 Na succinato, 0,5 Na glutammato, 0,02 EDTA, e 10,0 di glucosio, 0,1% vitamine MEM e ammino Acidi </li><li> Preparare soluzione tamponata HEPES Ringer (in mM): NaCl 133,3, KCl 3,3, 2,0 MgCl 2, 1.0 CaCl 2, 10.0 glucosio, 0,01 EDTA, 12.0 HEPES, pHregolato a 7,5 con ~ 5,8 ml di 1 M NaOH, aggiungere 0,72 g / L Leibovitz mezzo di coltura L-15. Usare 20 - 50 mM DL-AP4 e 50 - 100 pM BaCl 2 per isolare la risposta fotorecettore con qualsiasi mezzo di perfusione. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione per elettrodi 28 (in mM): NaCl 140,0, KCl 3.6, 2.4 MgCl 2, 1.2 CaCl 2, 3, HEPES 0,01 EDTA e aggiustare il pH a 7,4-7,5 con NaOH. Soluzione elettrodo può essere conservata a temperatura ambiente per diversi mesi. </li><li> Preparare e testare il supporto del campione. <ol><li> Incollare il nero / carta grigia filtro in cima alle cupole della parte inferiore del titolare del campione (vedi Figura 1A). Distribuire accuratamente bicomponente 5 min colla epossidica intorno ai bordi delle cime piane delle cupole. Se necessario, farlo al microscopio dissezione. </li><li> Attendere che la colla è quasi asciutto (circa 4 min) e premere la carta filtro cupole utilizzando un elemento piatta. Carta da filtro colla almeno un giorno prima dell&#39;esperimento. Ilcarta da filtro può essere utilizzato più volte, ma deve essere sostituito dopo un mese di registrazioni. Usa il 70% di etanolo per pulire accuratamente cupole da eventuali residui di colla prima di installare la carta sostitutiva. </li><li> Riempire i canali degli elettrodi con soluzione elettrodo cercando di evitare le bolle d&#39;aria e vite elettrodi pellet chiusa con un adattatore filettato nei canali elettrodi (vedi figure 1 A e B). Collegare i superiore e inferiore pezzi del supporto del campione con quattro viti e riempire le linee di perfusione con soluzione elettrodi. </li><li> Misurare la resistenza e la tensione tra i conduttori di ciascuna coppia di elettrodi con un multimetro (Figura 1B). La resistenza deve essere inferiore a 100 Ωk e la tensione sotto 10 mV se i canali sono senza bolle e gli elettrodi sono in buone condizioni. </li></ol></li><li> Versare 400-700 ml di supporti perfusione nella bottiglia. Indipendente altri 300 ml da utilizzare nella dissezione di retine e sstrappò in un frigorifero. Impostare il tubo di perfusione nel blocco scambiatore di calore e posizionare il blocco preriscaldato sulla piastra di riscaldamento (vedi Figura 1D). </li><li> Racchiudere la bottiglia con un tappo che ha collegamenti di CO 2 / O 2 gas (se si usa Ames &#39;o Locke) e per le tubazioni perfusione (Figura 1D). Preriscaldare la bottiglia con il supporto a 37 o C e posizionarlo sulla piastra di riscaldamento o sulla parte superiore dell&#39;unità stimolazione luminosa in bagnomaria a 37-39 ° C 17. <ol><li> Prime linee di perfusione di riempimento d&#39;supporti perfusione di avviare il flusso di gravità-driven. <ol><li> Nel sistema LKC, posizionare la bottiglia sulla parte superiore dell&#39;unità stimolatore 17 per fornire un flusso gravitazionale significativo che viene poi regolata da regolatori di portata senza essere influenzato dal livello di riduzione della soluzione di perfusione nella bottiglia durante l&#39;esperimento. </li><li> Nel sistema di Ocuscience, posizionare il pbottiglia erfusion all&#39;interno della gabbia di Faraday per minimizzare il rumore e posizionare linee di uscita lungo perfusione del portacampioni (vedi passo 2.8) ben al di sotto del livello del portacampioni (e bottiglia perfusione) per aumentare l&#39;azionamento gravitazionale della soluzione. Schermare le linee di uscita e collegare lo schermo a terra dell&#39;amplificatore per evitare l&#39;accoppiamento del rumore elettromagnetico al segnale ERG. </li></ol></li></ol></li><li> Regolare la perfusione di 3 - 5 ml / min utilizzando regolatori di portata. Collegare 5% di CO 2/95% O 2 gas da una bombola con una corretta regolazione e regolare la portata per garantire gorgoglio costante dei mezzi di comunicazione nella bottiglia attraverso una pietra d&#39;aria. </li></ol> Preparazione 2. campione <ol><li> Montare gli strumenti di dissezione pulite e nitide compreso microscissors straight-lame, uno o due 45 o pinzette, lama di rasoio e un pezzo rettangolare di carta da filtro. </li><li> Versare circa 200 ml di perfu freddosoluzione sione in un grande piatto Petri in modo che tutta la parte inferiore del supporto del campione (comprese le cupole) può essere immerso nella soluzione. Questo passaggio diventa importante quando si monta la retina sui cupole (vedi punto 2.6). Sebbene alcune soluzioni sono progettate per essere saturo di CarboGen (5% CO 2/95% O 2), questo non è essenziale ai fini di dissezione e non è stato fatto negli esperimenti qui descritti. </li><li> Per un tipico esperimento, tenere gli animali in 12/12 ore scuro ciclo / luce e buio si adattano per 6-12 ore prima delle registrazioni. Euthanize l&#39;animale da CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale sotto fioca luce rossa e fare tutte le seguenti procedure previste fioca luce rossa o IR (usare, ad esempio, il filtro rosso davanti alla sorgente luminosa del microscopio). <ol><li> Estrarre gli occhi con l&#39;ausilio di una pinzetta e metterli nei media. Inserire un occhio per volta su un piccolo pezzo di carta (ad esempio, carta da filtro regolare) e fare comeilluminato approssimativamente il livello di ora serrata tenendo l&#39;occhio con una pinzetta (questo è fatto di fuori della soluzione qui). </li></ol></li><li> Tagliare lungo la serrata (o più vicino all&#39;equatore dell&#39;occhio) con microscissors e rimuovere la cornea e la lente. Posizionare l&#39;oculare nei media freddo nella grande capsula di Petri e ripetere la stessa procedura con l&#39;altro occhio. </li><li> Tagliare una piccola incisione dall&#39;alto della tazza occhio verso il nervo ottico, mantenendo la forbice tra la retina e sclera per mantenere la retina intatto possibile. Grip sclera da entrambi i lati dell&#39;incisione utilizzando due pinzette e tirare le pinzette distanti per staccare la retina. <ol><li> Tagliare il nervo ottico e tentare di isolare la retina con una quantità minima di contatto fisico alla superficie distale. RPE sarà principalmente staccare automaticamente dalla retina durante il processo di dissezione. È più importante evitare disturbo meccanico della retina che per eseguire ladissezione rapidamente, generalmente retine può essere incubato almeno 30 min in soluzione senza effetti significativi sulle proprietà di risposta. </li></ol></li><li> Montare le retine sulle cupole del supporto del campione (Figura 1C). Immergere la parte inferiore del supporto del campione nella scatola di Petri con la retina sezionato. Scorrere la retina, fotorecettori lato (la superficie convessa della retina isolata) verso l&#39;alto, sopra la cupola e sollevare il supporto del campione in modo che la retina attacca sulla carta da filtro. Ripetere la procedura per l&#39;altro retina. </li><li> Asciugare con cura la piastra porta per evitare interferenze elettriche tra la retina, così come il rumore e il segnale shunt. Portacampione anelli O-ring intorno cupole parte inferiore per impedire soluzione fuoriuscita tra il fondo e le parti superiori del titolare, nonché per aiutare l&#39;isolamento elettrico dei fotorecettori e cellule gangliari lati dei singoli retine. Fissare la parte superiore del supporto con le quattro viti (Figura 1B) e riempire i canali di perfusione con soluzione di perfusione utilizzando una siringa e un ago. </li><li> Trasferire il titolare del campione accanto al blocco scambiatore di calore e collegare le linee di ingresso e di uscita di perfusione al titolare del campione (Figura 1D). Collegare gli elettrodi all&#39;amplificatore ERG (top elettrodi collegano alla terra / meno pin nel amplificatore) e collegare l&#39;unità stimolatore / di controllo sul supporto del campione utilizzando un adattatore o far scorrere la piastra elettrica nell&#39;unità stimolatore a seconda di quale in vivo Sistema ERG è utilizzato. </li></ol> 3. Registrazioni <ol><li> Configurare le impostazioni dell&#39;amplificatore e di stimolo utilizzando il software del sistema in vivo. Impostare la frequenza di acquisizione di un valore compreso tra 1 e 10 kHz e filtrazione passabasso a 300 Hz. Non utilizzare il filtro passa-alto. Utilizzare 60 Hz (o 50 Hz in Europa) segnare il filtro, se necessario. </li><li> Record di base senza stimolazione luminosa e lo spiritoh stimolazione dim (ad es., la luce verde di -35 dB o 0.3 mCd sm -2) per testare per buon collegamento elettrico tra gli elettrodi e il campione retina. Attendere 10 - 20 min prima di iniziare la raccolta di dati in modo che la temperatura e la funzione retinica raggiungere uno stato stabile. <ol><li> Scegli i parametri di stimolo secondo qualsiasi esperimento specifico e avviare la raccolta dei dati. Ad esempio, utilizzare la luce verde da -40 a 0 dB o da 0,1 fino a 1.000 mCd sm -2 per una famiglia risposta scotopic. Usa circa 2 a 3 log-unità più luminoso lampeggia registrazioni fotopiche dove aste devono essere soppressi dalla luce di fondo (3-30 Cdm -2) o un&#39;unità flash sonda (circa 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, vedi figura 3). </li><li> Tuttavia, ricordare che gli esatti valori di intensità della luce potrebbe essere un po &#39;dipende dal sistema di calibrazione e condizioni sperimentali. Come regola generale, le intensità di scala in calo di 5 - 10 volte rispetto a in vivo </em&gt; registrazioni quando si utilizza la luce verde 17. Un coperchio nero con aperture sopra la retina (inclusi nel sistema adattatore commerciale) può essere utilizzato per ridurre la dispersione della luce nel portacampioni e facilitare omogenea e stimolo uguale dei due retine dalla sfera Ganzfeld dei sistemi commerciali in vivo. NOTA: Per le registrazioni di retina adattata al buio, le intensità dei lampi di prova utilizzati in un tipico esperimento di candeggina solo una frazione trascurabile del pigmento in modo che la mancanza di rigenerazione RPE-driven non è un problema. Inoltre, è stato precedentemente dimostrato che la rigenerazione pigmento cono può ancora avvenire nella retina isolata mediante la cella Müller ciclo visivo 20. </li></ol></li><li> Come esperimenti durano in genere da 30 minuti fino a diverse ore, monitorare la deriva della linea di base, il livello di rumore e la stabilità di risposta durante l&#39;esperimento come movimenti di questi potrebbero indicare problemi tecnici. NOTA: L&#39;aumento o la diminuzione del rumoreampiezze d risposta possono indicare bolle d&#39;aria nei canali di perfusione o elettrodi, troppo bassa o alta temperatura, la soluzione di perdita / fuoriuscita o spostamento della retina. </li></ol> 4. Pulizia <ol><li> Staccare il supporto del campione dalle linee di perfusione, aprirlo e lavare la retina dalla carta da filtro. Rimuovere gli elettrodi e sciacquare con acqua distillata (non utilizzare etanolo). Pulire il supporto del campione (compresi i canali di perfusione) con etanolo e / o di acqua distillata. Tubazione perfusione Lavare accuratamente con&gt; 70% di etanolo. </li><li> Sciacquare la bottiglia di perfusione con acqua distillata (non utilizzare detergenti). L&#39;etanolo può essere utilizzata anche per pulire la bottiglia. </li></ol>

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Washington University di St. Louis ha un accordo di licenza con Xenotec, Inc. e può ricevere una royalty dalla vendita dell&#39;adattatore ex vivo.

<html> Dimostriamo qui i passaggi critici per l&#39;ottenimento di alta qualità ex registrazioni vivo ERG contemporaneamente da due retine isolate del mouse utilizzando componenti in vivo del sistema ERG insieme ad un ex vivo adattatore ERG. In questo studio abbiamo perfusione entrambe le retine da animali con la stessa soluzione (sia Ames &#39;, Locke o Ringer), ma è anche possibile perfusione ogni retina con una soluzione diversa per esempio, a scopo di test di droga. I pass...

Elettroretinogramma (ERG) è una tecnica ben consolidata che può essere utilizzato per registrare l&#39;attività elettrica della retina innescata dalla luce. Il segnale ERG è generato principalmente dalle variazioni di tensione causate da correnti radiali (lungo l&#39;asse dei fotorecettori e cellule bipolari) scorre nello spazio extracellulare resistivo della retina. Il primo segnale ERG è stato registrato nel 1865 dal Holmgren dalla superficie di un occhio di pesce 1. Einthoven e Jolly 1908 2 diviso la risposta ERG all&#39;insorgenza di luce in tre differenti onde, denominato a-, b-, e c-onde, che sono ormai noti per riflettere principalmente l&#39;attività dei fotorecettori, cellule bipolari ON, e dell&#39;epitelio pigmentato cellule, rispettivamente 3-8. ERG può essere registrato dagli occhi di animali o esseri umani (in vivo) anestetizzati, dalla preparazione isolato occhio 9, attraverso isolato retina intatto (ex vivo) 3,10-15 o attraverso strati della retina specifici con i microelettrodi (localeERG) 4,16. Di questi, in vivo ERG è attualmente il metodo più usato per valutare la funzione della retina. Si tratta di una tecnica non invasiva che può essere usato per scopi diagnostici o per seguire la progressione di malattie retiniche negli animali o pazienti. Tuttavia, in vivo registrazioni ERG producono un segnale complicato con diversi componenti sovrapposti, spesso contaminato da rumore extraocular fisiologico (ad esempio, la respirazione e l&#39;attività cardiaca). ERG locale può essere utilizzato per registrare il segnale attraverso strati specifici della retina ma è il più invasivo e ha il segnale-rumore più basso (SNR) rispetto alle altre configurazioni di registrazione ERG. ERG locale è anche tecnicamente impegnativo e richiede costose attrezzature (ad esempio, microscopio e micromanipolatori). Transretinal ERG dal intatto, isolato retina (ex vivo ERG) offre un compromesso tra in vivo e metodi ERG locali permettendo stabile e high SNR registrazioni da retine intatte di animali o esseri umani 17. Recentemente, questo metodo è stato utilizzato con successo per studiare l&#39;asta e cono fotorecettori funzione in mammiferi, primati e umani retine 18-20. In aggiunta, a causa dell&#39;assenza di dell&#39;epitelio pigmentato in ex vivo retina, il componente c-onda positiva del segnale ERG viene rimosso e un componente importante negativo lento PIII è rivelato nelle ex vivo registrazioni. Il componente lenta PIII è stato dimostrato che provengono dalla attività delle cellule glia Müller nella retina 21-23. Così, ex vivo metodo ERG potrebbe essere utilizzato anche per studiare le cellule Müller nella retina intatto. Diversi studi hanno anche dimostrato che ex vivo registrazioni ERG potrebbero essere utilizzati per misurare la concentrazione di agenti farmacologici in giro per la retina 24 e testare la sicurezza e l&#39;efficacia dei farmaci 25-27. Commerciale multipla sistemi in vivo sono disponibili eutilizzato in molti laboratori che non hanno necessariamente vasta elettrofisiologia sfondo. Al contrario, ex vivo dispositivi non sono stati disponibili fino a poco 17 e come risultato solo pochi laboratori sono attualmente in corso vantaggio di questa tecnica potente. Sarebbe utile per effettuare registrazioni ex vivo ERG disponibile per più laboratori per far avanzare le nostre conoscenze sulla fisiologia della retina e la patologia, e di sviluppare nuove terapie per le malattie accecante. Dimostriamo qui un dispositivo semplice ed economico ex vivo ERG 17 e mostriamo come può essere utilizzato in combinazione con diversi sistemi disponibili in commercio in vivo ERG per registrare la segnalazione Rod- e cono-mediata (a- e b-onde) e la funzione di cellule Müller (lenta PIII) da intatte retine di topo wild-type.

<table><tbody><tr><td>In vivo Sistema ERG</td><td>OcuScience</td><td>HMsERG</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/id77.html">www.ocuscience.us/id77.html</a></td></tr><tr><td>In vivo Sistema ERG</td><td>LKC Technologies</td><td>UTAS-E 3000</td><td><a href="http://www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html">www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html</a></td></tr><tr><td>Ex adattatore vivo</td><td>OcuScience</td><td>Ex VIVO ERG adapter</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/id107.html">www.ocuscience.us/id107.html</a></td></tr><tr><td>Microscopio per dissezione</td><td>North Central Instruments</td><td>Leica M80</td><td><a href="http://www.ncimicro.com/store/ListProduct.asp?bSub=T&amp; idCategory=27">Può utilizzare qualsiasi marca</a></td></tr><tr><td>emettitore IR</td><td>Opto Diode Corp.</td><td>OD-50L</td><td><a href="http://www.optodiode.com/">www.optodiode.com</a></td></tr><tr><td>Prowler Visori notturni</td><td>B.E. Meyers Electro Optics</td><td>D4300-I</td><td>Prodotto di livello militare.</td></tr><tr><td>Filtro rosso</td><td>Rosco Laboratories</td><td>Roscolux #27 Medio Rosso</td><td>Può essere utilizzato al posto del sistema IR</td></tr><tr><td>Luce frontale rossa</td><td>OcuScience</td><td>ERGX011</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/catalog/i29.html">www.ocuscience.us/catalog/i29.html</a></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>WPI, Inc.</td><td>500086</td><td><a href="http://www.wpiinc.com/">www.wpiinc.com/</a></td></tr><tr><td>Dumont pinzette #5</td><td>WPI, Inc.</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>Lame di rasoio</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>72000</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com</a></td></tr><tr><td>Scala</td><td>Metler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Può utilizzare qualsiasi marca</a>Misuratore di</td></tr> <tr><td>pH ed elettrodo</td><td>Beckman Coulter</td><td>pHI 350</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Può utilizzare qualsiasi marca</a></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60129</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Può utilizzare qualsiasi marca</a></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63020</td><td>1.0 M soluzione</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>1.0 M soluzione</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Ames medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>BaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0750</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>DL-AP4</td><td>Tocris Bioscience</td><td>101</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Acido succinico sale disodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224731</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Acido L-glutammico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2834</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Terreno di coltura Leibovitz L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>di vitamine MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>aminoacidi MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN3156</td><td>5% CO2</td></tr></tbody></table>

simultaneo<em&gt; ex vivo</em&gt; test funzionale di due retine per<em&gt; in vivo</em&gt; sistema elettroretinogramma

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Un segnale di elettroretinogramma in vivo (ERG) è composto da diversi componenti sovrapposti provenienti da diversi tipi di cellule retiniche, nonché da rumore proveniente da fonti extra-retiniche. Ex vivo ERG fornisce un metodo efficiente per sezionare la funzione delle cellule retiniche direttamente da una retina isolata intatta di animali o occhi di donatori. Inoltre, l'ERG ex vivo può essere utilizzato per testare l'efficacia e la sicurezza di potenziali agenti terapeutici sul tessuto retinico di animali o esseri umani. Mostriamo qui come i sistemi ERG in vivo disponibili in commercio possano essere utilizzati per condurre registrazioni ERG ex vivo da retine di topo isolate. Combiniamo le unità di stimolazione luminosa, elettronica e riscaldamento di un sistema standard in vivo con portacampioni progettato su misura, sistema di perfusione a gravità controllata e schermatura elettromagnetica del rumore per registrare simultaneamente segnali ERG ex vivo a basso rumore da due retine con il software di acquisizione incluso in commercial in vivo Sistemi. Inoltre, dimostriamo come utilizzare questo metodo in combinazione con trattamenti farmacologici che rimuovono specifici componenti ERG al fine di sezionare la funzione di alcuni tipi di cellule retiniche.

Abbiamo registrato risposte flash di tipo selvaggio adattata al buio (WT) C57BL / 6 retine topo seguendo i protocolli sperimentali sopra descritte ed illustrate in figura 1 utilizzando diverse soluzioni standard di perfusione (Figura 2). Le forme d&#39;onda di risposta e la cinetica e sensibilità bastoncelli apparsi simili in Ames &#39;e mezzi di Locke (Figura 2A e B). D&#39;altra parte, in soluzione di Ringer HEPES-buffered (senza bicarbonato o 5% CO <...

Ex vivo ERG può essere utilizzato per registrare l'attività elettrica delle cellule retiniche direttamente da retine intatte isolate di animali o esseri umani. Dimostriamo qui come i comuni sistemi ERG in vivo possano essere adattati per registrazioni ERG ex vivo al fine di sezionare l'attività elettrica delle cellule retiniche.

Simultaneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Test funzionale di due retine per<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Elettroretinogramma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la funzione delle cellule provenienti dalla retina isolata di un topo utilizzando un sistema commerciale in vivo di elettroretinogramma, o ERG, insieme a un adattatore ex vivo. Questo obiettivo viene raggiunto innanzitutto dissezionando le retine da entrambi gli occhi di un topo. Il secondo passaggio consiste nel montare le retine con il lato dei fotorecettori verso l'alto all'interno di un portacampioni.Successivamente, il portacampioni viene posizionato su una piastra riscaldante nel sistema ERG in vivo e collegato alla perfusione controllata per gravità. L'ultimo passaggio consiste nel collegare gli elettrodi del portacampioni a un amplificatore e stimolare le retine con luce per ottenere risposte ERG. In definitiva, l'ERG ex vivo viene utilizzato per dimostrare come i percorsi di segnalazione mediati dai bastoncelli e dai coni possano essere analizzati mediante farmacologia e protocolli specializzati di stimolazione luminosa.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come le ERG in vivo o le registrazioni da singola cellula, è che fornisce un rapporto segnale/rumore più elevato, registrazioni più lunghe e più stabili, nonché la possibilità di effettuare manipolazioni farmacologiche in modo semplice e quantitativo. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per valutare l'efficacia e la sicurezza di farmaci progettati per trattare malattie retiniche in retine di primati e donatori umani. Almeno un giorno prima, modificare la parte inferiore del portacampioni incollando un foglio di carta filtro grigio scuro sulla sommità delle cupole. Utilizzare una colla bicomponente a presa rapida (cinque minuti) lungo i bordi delle cupole e, se necessario, operare con un microscopio da dissezione. Dopo che la colla si è indurita, premere la carta filtro contro la cupola in modo da appiattirla completamente.Sarà adatto per circa un mese di registrazione. Quindi rimuovere la carta e pulire la cupola con etanolo al 70%. Ora, per preparare innanzitutto l'elettrodo, riempire i canali dell'elettrodo con la soluzione per elettrodi.Cercare di evitare l'introduzione di bolle d'aria. Quindi avvitare gli elettrodi a pellet nei canali degli elettrodi. Collegare le parti superiore e inferiore del portacampioni con quattro viti e riempire le linee di perfusione con la soluzione per elettrodi.Successivamente, misurare la resistenza e la tensione tra i cavi delle coppie di elettrodi. La resistenza deve essere inferiore a 100 kiloohm e la tensione al di sotto di 10 millivolt. Se i canali sono privi di bolle e gli elettrodi sono in buone condizioni, versare ora da 400 a 700 millilitri di mezzo di perfusione in una bottiglia di vetro per la perfusione del campione.Inoltre, versare 300 millilitri per la dissezione e conservarli in frigorifero. Quindi far passare il tubo di perfusione attraverso il blocco scambiatore di calore e posizionare il blocco preriscaldato sulla piastra riscaldante. Ora chiudere la bottiglia con un tappo che abbia un ingresso per il gas e un ingresso per il tubo di perfusione.L'ingresso del gas deve essere collegato a una pietra aerante. Posizionare la bottiglia preriscaldata nel punto in cui il mezzo di perfusione verrà mantenuto a 37 gradi Celsius. Quindi, eseguire la preparazione iniziale delle linee di perfusione riempiendole con il mezzo di perfusione per avviare il flusso per gravità in un sistema Ocus Science.Posizionare la bottiglia all'interno della gabbia di Faraday per ridurre al minimo il rumore e utilizzare lunghi tubi di uscita per la perfusione provenienti dal supporto del campione. Posizionare questi tubi di uscita ben al di sotto del livello del supporto del campione e della bottiglia di perfusione, schermarli e collegare lo schermo a massa dell'amplificatore attraverso la gabbia di Faraday. Per evitare l'accoppiamento del rumore elettromagnetico al segnale ERG, fissare la sonda di temperatura alla piastra riscaldante.Ora, utilizzando i regolatori, regolare il flusso della soluzione a tre-cinque millilitri al minuto. Infine, se necessario, introdurre aria e gas nella soluzione e regolare il regolatore in modo da ottenere un flusso costante di bollicine dalla pietra porosa. Iniziare versando circa 200 millilitri di soluzione di perfusione fredda in una grande capsula di Petri, in modo che la parte inferiore del portacampioni possa essere completamente immersa.Sopprimere un animale allevato in un ciclo luce/buio di 12 ore e successivamente adattato al buio per sei-dodici ore prima delle registrazioni. Tutte le seguenti procedure devono essere eseguite sotto luce rossa debole o infrarossa. Dopo aver isolato ogni occhio, posizionarlo nel mezzo per occhi.Quindi trasferire un occhio su un piccolo pezzo di carta filtrante posizionato sul foglio. Afferrarlo con pinzette e praticare una fessura a livello approssimativamente corrispondente alla ora serrata, partendo dalla fessura. Tagliare lungo l'ora serrata o in un punto più vicino all'equatore per rimuovere la cornea e il cristallino.Quindi rimuovere la cornea e le estremità del cristallino e trasferire nuovamente la coppa oculare nel mezzo freddo. Ripetere la stessa procedura con l'altro occhio. Ora, lavorando con una coppa oculare, praticare un piccolo taglio dalla parte superiore verso il nervo ottico.Mantenere le forbici tra la retina e la sclera in modo che la retina rimanga il più integra possibile. Successivamente, afferrare la sclera su entrambi i lati dell'incisione utilizzando due pinzette e tirare in direzioni opposte per staccare la retina. Per isolare la retina, tagliare il nervo ottico e rimuovere la retina con il minimo contatto possibile alla sua superficie distale.Ora, montare le retine isolate sulle cupole del portacampioni. Innanzitutto, immergere la parte inferiore del portacampioni nella piastra di Petri contenente le retine dissezionate. Diapositiva successiva.Il fotorecettore retinico o il lato convesso rivolto verso l'alto sulla cupola. Sollevare quindi delicatamente il portacampioni in modo che la retina aderisca alla carta filtrante. Ripetere quindi la procedura per l'altra retina.Ora asciugare con cura la piastra del supporto per prevenire il rumore da crosstalk e il deviamento del segnale. Dopo aver asciugato il supporto, avvitare la parte superiore e riempire i canali di perfusione con la soluzione di perfusione da una siringa utilizzando un ago. Posizionare il portacampioni accanto al blocco di scambio termico.Quindi collegare i tubi di perfusione di ingresso e di uscita. Completare l'allestimento collegando gli elettrodi all'amplificatore di ERG e attaccando l'unità di controllo dello stimolatore al portacampioni. Utilizzando un adattatore, per ottenere risposte ampie e riutilizzabili, è fondamentale eseguire un'attenta dissezione e montaggio delle retine, oltre a mantenere una perfusione stabile e priva di bollicine sopra le retine prima della raccolta dei dati.Attendere da 10 a 20 minuti in modo che la temperatura e la funzione della retina si stabilizzino. Le risposte al lampo sono state registrate da retine di tipo selvatico C57 Black Six adattate al buio utilizzando diverse soluzioni standard di perfusione. Le forme d'onda e la cinetica delle risposte sono risultate simili nei mezzi Ames e nei mezzi Locke. Anche la sensibilità dei fotorecettori a bastoncello era simile.D'altra parte, in soluzioni tampone di Ringer senza bicarbonato o risposta al carbogeno, le ampiezze erano significativamente più piccole. La stabilità della BWA era inoltre spesso compromessa nel ringer di Heap. L'aggiunta di 40 micromolar di A PB rimuoveva in modo efficiente l'onda B positiva.Ciò ha rivelato un'onda negativa lenta e ampia, attribuita all'attività delle cellule di Müller, che viene abolita aggiungendo 100 micromolar di bario. Questo componente rivela la risposta dei fotoricettori nel segnale ERG ex vivo. Questo metodo può essere combinato con altri strumenti come la farmacologia e la genetica per rispondere a domande sui meccanismi molecolari della segnalazione retinica e delle malattie che causano cecità, in retine di mammiferi, inclusa quella umana.

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Neuroscienze

Lo sviluppo del elettroretinogramma multifocale (mfERG) è un importante passo avanti nella diagnosi e caratterizzazione della retinopatia. Electroretinograms multifocali sono una media matematica di una approssimazione di un b-wave. I software possono derivare ERG da più di un centinaio di aree retiniche in pochi minuti per occhio. Scotomi e disfunzioni della retina possono essere mappati e quantificati.

Electroretinograms multifocale

Descriviamo un metodo relativamente semplice di transretinal elettroretinogramma (ERG) per l'ottenimento di registrazioni fotorisposte asta e cono da retina di topo intatto. Questo approccio sfrutta il blocco della trasmissione sinaptica da fotorecettori per isolare le loro risposte chiare e registrarli usando elettrodi posizionati sul campo in tutto il isolato piatto montato retina.

Transretinal Recordings ERG di retina di topo: Rod e fotorisposte Cone

Questo articolo descrive la registrazione delle singole cellule da fluorescente tag popolazioni neuronali della retina topo intatto. Con l'eccitazione a due fotoni infrarossi cellule transgenetically etichettati sono stati mirati per patch-clamp per lo studio di registrazione le loro risposte luce, proprietà del campo recettivo, e la morfologia.

Caratterizzazione elettrofisiologica di GFP-Esprimendo popolazioni di cellule nella retina intatto

Questo video dimostra come registrare l'elettroretinogramma (ERG) e il potenziale evocato visivo (VEP) in un ratto cosciente. Il ratto, con elettrodi impiantati chirurgicamente, viene prima adattato al buio. Dopo aver applicato le gocce dilatanti, l'animale viene posto in un sistema di ritenuta e posizionato in una ciotola di Ganzfeld. I segnali ERG e VEP vengono quindi registrati.

Registrazione dell'elettroretinogramma e del potenziale evocato visivo in un ratto

L'elettroretinogramma (ERG) è un potenziale elettrico generato dalla retina in risposta alla luce. Questo articolo descrive come utilizzare l'ERG per valutare la funzione retinica, nei ratti adattati al buio, e come può essere utilizzato per valutare un intervento neuroprotettivo, in questo caso il precondizionamento ischemico remoto.

Utilizzando il Elettroretinogramma per valutare la funzione in roditori Retina e gli effetti protettivi del Remote Limb ischemico precondizionamento

Questo protocollo descrive la misurazione simultanea dell'elettroretinogramma e dei potenziali evocati visivi in ratti anestetizzati.

Registrazione simultanea di elettroretinografia e Potenziali evocati visivi nei ratti anestetizzati

Qui, presentiamo un metodo per registrare le risposte elettriche evocate dalla luce dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) nei topi usando una tecnica nota come DC-ENG descritta per la prima volta da Marmorstein, Peachey e colleghi nei primi anni 2000.

Elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG) per la registrazione delle risposte elettriche evocate dalla luce dell'epitelio pigmentato retinico del mouse

Il rispetto degli standard internazionali e il mantenimento dell'adattamento al buio retinale sono fondamentali per acquisire valide risposte all'elettroretinogramma a campo completo nella diagnosi e nella gestione delle malattie retiniche ereditarie. Viene fornito un pratico protocollo che  utilizza una camera oscura portatile per ottenere l'elettroretinogramma a campo completo per neonati e bambini sotto sedazione o anestesia generale nell'ambiente della sala operatoria.

Registrazione elettroretinogramma per neonati e bambini in anestesia per ottenere un adattamento oscuro ottimale e standard internazionali

L'imaging in vivo è un potente strumento per lo studio della biologia in salute e malattia. Questo protocollo descrive l'imaging transpupillare della retina del topo con un microscopio standard a due fotoni. Dimostra anche diversi metodi di imaging in vivoimaging per marcare in modo fluorescente più coorti cellulari della retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

La modifica dell'array multielettrodo esistente o delle apparecchiature patch clamp rende l'elettroretinogramma ex vivo più ampiamente accessibile. Metodi migliorati per registrare e mantenere le risposte alla luce ex vivo facilitano lo studio della funzione dei fotorecettori e delle cellule bipolari ON nella retina sana, nei modelli animali di malattie degli occhi e nelle retine dei donatori umani.

Ottimizzazione della configurazione e delle condizioni per l'elettroretinogramma ex vivo per studiare la funzione della retina in occhi piccoli e grandi

Questo protocollo presenta e descrive i passaggi per l'isolamento, la dissezione, la coltivazione e la colorazione degli espianti retinici ottenuti da un topo adulto. Questo metodo è utile come modello ex vivo per lo studio di diverse malattie neurovascolari retiniche come la retinopatia diabetica.

Espianto retinico della retina del topo adulto come modello ex vivo per lo studio delle malattie neurovascolari retiniche

Scopri l'elettroretinogramma ex vivo per analizzare la funzione cellulare della retina isolata di topo. Questo metodo permette di dissezionare le vie di segnalazione dei bastoncelli e dei coni con farmacologia e stimolazione luminosa.

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