Simultaneo Ex vivo Test funzionale di due retine per In vivo Sistema Elettroretinogramma

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la funzione delle cellule di una retina di topo isolata utilizzando un sistema commerciale in vivo, elettroretinogramma o ERG insieme a un adattatore ex vivo. Ciò si ottiene sezionando prima le retine da entrambi gli occhi di un topo. Il secondo passo consiste nel montare la retina con il lato del fotorecettore rivolto verso l'alto in un portacampioni.

Successivamente, il portacampioni viene posizionato su una piastra riscaldante nel sistema ERG in vivo e collegato alla perfusione a gravità controllata. Il passaggio finale consiste nel collegare gli elettrodi del portacampione a un amplificatore e stimolare le retine con la luce per ottenere risposte ERG. In definitiva, l'ERG ex vivo viene utilizzato per mostrare come le vie di segnalazione mediate da bastoncelli e coni possano essere sezionate utilizzando la farmacologia e protocolli specializzati di stimolazione della luce.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come le registrazioni in vivo, ERG o singole cellule, è che fornisce un rapporto segnale/rumore più elevato registrazioni più lunghe e stabili, nonché la possibilità di manipolazioni farmacologiche facili e quantitative. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per lo screening dell'efficacia e della sicurezza di farmaci progettati per trattare le malattie della retina nelle retine dei primati e dei donatori umani Almeno un giorno prima, modificare la parte inferiore del portacampione incollando della carta da filtro grigio nera alla parte superiore delle cupole. Utilizzare resina epossidica bicomponente da cinque minuti lungo i bordi delle cupole e, se necessario, utilizzare un microscopio da dissezione Dopo che la colla si è asciugata, premere la carta da filtro sulla cupola.

Andrà bene per circa un mese di registrazione. Quindi rimuovere la carta e pulire la cupola con etanolo al 70%. Ora per preparare prima l'elettrodo, riempire i canali degli elettrodi con la soluzione dell'elettrodo.

Cerca di evitare di introdurre bolle d'aria. Quindi avvitare gli elettrodi del pellet nei canali degli elettrodi. Collegare le parti superiore e inferiore del portacampioni con quattro viti e riempire le linee di perfusione con una soluzione di elettrodo.

Quindi, misurare la resistenza e la tensione tra i conduttori delle coppie di elettrodi. La resistenza deve essere inferiore a 100 kilo ohm e la tensione inferiore a 10 millivolt. Se i canali sono privi di bolle e gli elettrodi sono in buone condizioni, versare da 400 a 700 millilitri di terreno di perfusione in un flacone di vetro per la perfusione del campione.

Inoltre, versare 300 millilitri per la dissezione e conservarlo in frigorifero. Quindi inserire il tubo di perfusione attraverso il blocco dello scambiatore di calore e posizionare il blocco preriscaldato sulla piastra riscaldante. Ora la bottiglia è dotata di un tappo che ha un ingresso per il gas e un ingresso per il tubo di perfusione.

L'ingresso del gas deve essere fissato a una pietra porosa. Mettere il flacone preriscaldato dove il mezzo di perfusione verrà mantenuto a 37 gradi Celsius. Quindi adescare le linee di perfusione riempiendole con mezzi di perfusione per avviare il flusso guidato dalla gravità in un sistema scientifico ocus.

Posizionare il flacone all'interno della gabbia di Faraday per ridurre al minimo il rumore e utilizzare lunghe linee di perfusione dal portacampioni. Posizionate ben al di sotto del livello del portacampioni e del flacone di perfusione, schermano queste linee di uscita e collegano la schermatura alla massa dell'amplificatore attraverso la gabbia di Faraday. Per evitare l'accoppiamento del rumore elettromagnetico al segnale ERG, collegare la sonda di temperatura allo stadio di riscaldamento.

Ora, utilizzando i regolatori, regolare il flusso della soluzione da tre a cinque millilitri al minuto. Infine, se necessario, introdurre l'auto e il gas nella soluzione e regolare il regolatore per un flusso costante di bolle dalla pietra porosa. Iniziare versando circa 200 millilitri di soluzione di perfusione fredda in una grande capsula di Petri in modo che l'intera parte inferiore del portacampioni possa essere completamente immersa.

Eutanasia di un animale allevato con un ciclo di luce oscura di 12, 12 ore e poi adattato al buio per sei-12 ore prima delle registrazioni. Tutte le seguenti procedure devono essere eseguite in condizioni di luce rossa fioca o infrarossa. Dopo aver isolato ciascun occhio, posizionali nel mezzo oculare.

Quindi trasferisci un occhio su un piccolo pezzo di carta da filtro sulla carta. Afferralo con una pinzetta e taglia una fessura all'incirca allo stesso livello dell'aura serrata dalla fessura. Taglia lungo l'aura serrata o da qualche parte più vicino all'equatore per rimuovere la cornea e il cristallino.

Quindi rimuovere la cornea e le estremità della lente e trasferire nuovamente l'oculare nel mezzo freddo. Ripeti la stessa procedura con l'altro occhio. Ora lavorando con una conchiglia oculare, fai una piccola incisione dall'alto verso il nervo ottico.

Tieni le forbici tra la retina e la sclera in modo che la retina rimanga il più intatta possibile. Quindi, afferra la sclera su entrambi i lati dell'incisione usando due pinzette e separa il tessuto per staccare la retina. Per isolare la retina, tagliare il nervo ottico e rimuovere la retina con una quantità minima di contatto con la sua superficie distale.

Ora, montare le retine isolate sulle cupole del portacampioni. Per prima cosa, immergere la parte inferiore del portacampioni nella capsula di Petri con le retine sezionate. Prossima diapositiva.

Il fotorecettore della retina o il lato convesso verso l'alto sopra la cupola. Quindi sollevare delicatamente il portacampioni in modo che la retina si attacchi alla carta da filtro. Quindi ripetere la procedura per l'altra retina.

Ora asciugare accuratamente la piastra di supporto per evitare rumori di diafonia e deviazioni del segnale. Dopo aver asciugato il supporto, avvitare la parte superiore e riempire i canali di perfusione con la soluzione di perfusione di una siringa utilizzando un ago. Posizionare il portacampioni accanto al blocco di scambio termico.

Quindi collegare le linee di perfusione di ingresso e di uscita. Completare la configurazione collegando gli elettrodi all'amplificatore ERG e collegando l'unità di controllo dello stimolatore al portacampioni. Utilizzo di un adattatore Per ottenere risposte ampie e riutilizzabili, è importante eseguire un'attenta dissezione e montaggio delle retine, nonché mantenere una perfusione stabile e priva di bolle sopra le retine Prima di raccogliere i dati.

Attendere da 10 a 20 minuti in modo che la temperatura e la funzione delle retine stabilizzino le risposte del flash sono state registrate da sei retine nere di tipo C 57 selvatiche adattate al buio utilizzando diverse soluzioni di profusione standard. Le forme d'onda e la cinetica della risposta sono apparse simili nei mezzi di ames e nei mezzi di lock. Anche la sensibilità dei fotorecettori Rod era simile.

D'altra parte, in cumuli di soluzione ringer tamponata senza risposta al bicarbonato o al carbogena, le ampiezze erano significativamente più piccole. Anche la stabilità BWA è stata spesso compromessa nella suoneria dell'heap. L'aggiunta di 40 micromolari di A PB ha rimosso in modo efficiente l'onda B positiva.

Ciò ha rivelato una grande e lenta onda negativa che è stata attribuita all'attività delle cellule di Mueller, aggiungendo 100 micromolari di bario aboliti. Questo componente rivela la risposta fotorecettoriale del segnale ERG ex vivo. Questo metodo può essere combinato con altri strumenti come la farmacologia e la genetica per rispondere a domande sui meccanismi molecolari della segnalazione retinica e delle malattie della cecità nei mammiferi, comprese le retine umane.