Name: Iridium (III) luminescente sonda per il rilevamento della proteina malarica Biomarker istidina Rich Protein-II (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Scopri la sintesi di una sonda fosforescente all'iridio per rilevare il biomarcatore della malaria istidina-rich protein 2. Questo metodo offre rilevamento robusto e cinetica rapida per diagnosi affidabili.

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Il supporto per questo lavoro è stato fornito dalla Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. è stato supportato da una NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).

1. Sintesi di Iridium (III) Complesso <ol><li> Pesare 53,6 mg (50 mmol) di [Ir (ppy) 2 -Cl] 2 e sciogliere in 5 ml di cloruro di metilene. Aggiungi questa soluzione in un beuta da ml 50 dotato di ancoretta. </li><li> Pesare 26,2 mg (100 mmol) di AgOTf e sciogliere in 5 ml di metanolo. </li><li> Aggiungere il AgOTf dissolto al [Ir (ppy) 2 -Cl] 2 soluzione e mescolare per 1 ora. Nota: un impasto color crema dovrebbe comportare. </li><li> Dopo 1 ora, filtrare la sospensione attraverso gel di silice in un bicchierino fiala di 25 x 95 mm ed evaporare solvente residuo mediante un evaporatore rotativo (5-10 minuti). </li><li> Una volta che la maggior parte del solvente viene rimosso, verificare che un residuo oleoso giallo rimane nel flaconcino. Per questo residuo, aggiungere 1 ml di metanolo di ri-sciogliere il prodotto e lyophilize 1-2 giorni per rendere il prodotto solido giallo. </li><li> Caratterizzare la Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 + prodotto (IR1) da H &lt;sup&gt; 1 NMR (in CDCl 3), ESI e UV-Vis come descritto in precedenza. 23 </li></ol> 2. Interazioni di Ir1 con vari amminoacidi <ol><li> Preparare una soluzione 2 mM di Ir1 in metanolo (MW 537,10 g / mol). Vortex per garantire la completa dissoluzione del solido. </li><li> Preparare 100 micron soluzioni delle seguenti aminoacidi e biomolecole in HEPES Buffered Saline (HEPES HBS, 100 mm, 137 mM NaCl, pH 7,4) Ala, Asp, Cys, His, Ile, Lys, Ser, Try, Val. </li><li> Pipettare 100 ml di ogni amminoacido in una piastra da 96 pozzetti neri. Aggiungere 100 ml di HBS alla piastra per servire come bianco. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di soluzione 2 Ir1 mM ad ogni campione e agitare la piastra su un agitatore per 10 minuti. </li><li> Dopo 10 min, acquisire gli spettri di emissione dei campioni utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti (365 ex / em 400-700). <ol><li> Porre la piastra in strumento e aprire il software lettore di piastre per configurare un nuovo esperimento. </li><li> Impostare la nuova experiment leggere una scansione di fluorescenza con una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 365 nm e una larghezza della fessura di 9 nm con l&#39;ottica nella posizione superiore. </li><li> Leggi l&#39;emissione 300-700 nm con un passo di 5 nm. </li><li> Esportare i dati per l&#39;analisi dei dati. </li></ol></li><li> Trasferire i campioni ad un chiaro piastra a 96 pozzetti e immagine l&#39;emissione con un Transilluminatore UV. </li></ol> 3. Titolazione di Ir1 con BNT-II <ol><li> Preparare una soluzione madre 1 mM di BNT-II (MW 8233,6 g / mol) in HBS e una soluzione 2 mM di Ir1 in metanolo. </li><li> Dalla soluzione di riserva, preparare 1 ml di 100 mM BNT-II in HBS. Vortex la provetta per assicurarsi il campione viene miscelato. </li><li> Serialmente diluire il 100 mM BNT-II della metà in HBS ad una concentrazione finale di 1,56 mM BNT-II. </li><li> Aggiungere 100 ml di ogni diluizione, in triplice copia, con HBS che serve come un vuoto, ai pozzetti di una piastra ben 96. Per ogni campione, aggiungere 2,5 ml di 2 Ir1 mm. </li><li> Shake la piastra per 10 minuti su un agitatore. </li><li> Dopo aver agitato, leggere l&#39;intensità di emissione a 510 nm (eccitazione a 365 nm) utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti. <ol><li> Porre la piastra in strumento e aprire il software lettore di piastre per configurare un nuovo esperimento. </li><li> Impostare il nuovo esperimento di leggere un endpoint di fluorescenza con una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 365 nm ed emissione lunghezza d&#39;onda di 510 nm. Impostare la larghezza della fessura per entrambe le lunghezze d&#39;onda a 9nm, con l&#39;ottica nella posizione superiore. </li><li> Leggere la piastra ed esportare i dati per l&#39;analisi. </li></ol></li><li> Trasferire i campioni ad un chiaro piastra a 96 pozzetti e immagine la titolazione usando un transilluminatore UV. </li></ol> 4. in tempo reale Kinetic analisi del sistema Ir1 / BNT-II Utilizzando Biolayer Interferometry <ol><li> Aggiungere 200 ml di tampone cinetico (KB; 1x tampone fosfato con 0,02% Tween-20) a 8 pozzetti nella prima colonna di una piastra a 96 pozzetti nera e inserire la piastra nel sensore di plasticatitolare. Trasferire accuratamente 8 Ni (II) biosensori NTA alla prima colonna nel supporto di plastica in modo che le punte sono sospesi nei pozzetti di tampone. Posizionare il supporto di plastica nella parte sinistra dello strumento interferometria. </li><li> Preparare un 2 ml di una soluzione allo 0,5 micron di BNT-II in KB. </li><li> Preparare 500 ml di una soluzione al 10 micron di Ir1 in KB, e in serie diluire metà in giù a 0,156 micron di KB. </li><li> Per una nuova nera 96 ​​pozzetti, pipetta 200 ml di KB a tutti 8 pozzetti nella colonna A e C. </li><li> Nello stesso piatto, pipettare 200 ml di soluzione di 0.5μM BNT-II ai pozzetti nella colonna B. </li><li> Pipettare 200 ml di ogni diluizione di Ir1 in colonna D, a partire KB come il vuoto in D1 bene. Aggiungere le diluizioni in modo che i pozzi aumentano in concentrazione Ir1 lungo la colonna. </li><li> Inserire questa piastra nello strumento a destra della piastra contenente i sensori pre-bagnatura. </li><li> Nel software biolayer interferometria, ha istituito un Kinet baseesperimento ic definendo le punte piatto, di analisi, e dei sensori. <ol><li> Per definire la piastra, selezionare una colonna sullo schermo, fare clic destro e scegliere la definizione appropriata per i pozzi. Selezionare &quot;Buffer&quot; per le colonne A e C, &quot;Load&quot; per la colonna B, e &quot;Campione&quot; per la colonna D. </li><li> Definire il test nella scheda successiva, aggiungendo le seguenti operazioni (Fare clic su &quot;Aggiungi&quot;): equilibrazione (su ordinazione), 60 sec; Caricamento in corso, 120 sec; Baseline, 60 sec; Associazione, 120 sec; e dissociazione, 300 sec. Selezionare il passo Equilibration e fare doppio clic su colonna A. Ripetere l&#39;operazione per Loading (colonna B), Baseline (colonna C), Association (colonna D), e la dissociazione (colonna C). Selezionare i sensori Ni (II) NTA. </li><li> Spostare alla scheda successiva e confermare che i sensori sono nella colonna A sul supporto del sensore in plastica. </li><li> Confermare l&#39;esperimento è descritto correttamente, inserire un nome di file, in modo che &quot;esperimento ritardo&quot; è selezionata, e premere &quot;Go&quot;. Nota: A causa della natura automatizzata dello strumento, una volta che l&#39;esperimento cinetica è delineato, si verificherà la procedura come programmato. </li></ol></li><li> Una volta che la corsa cinetica è completa, elaborare i dati nel software di elaborazione disponibile. <ol><li> Fare doppio clic sulla cartella con il nome del file di interesse nella parte inferiore del pannello di sinistra. Quindi, fare doppio clic sulla cartella corrispondente alla voce &quot;Cinetica&quot; nella parte superiore del pannello. Passare alla scheda Elaborazione. </li><li> Selezionare la casella Sottrazione a sinistra per aprire la schermata di selezione del sensore. Fare clic destro sul bene A4 e modificare il tipo di bene di riferimento Well. </li><li> Seleziona la casella accanto a Allinea asse Y, e assicurarsi che il passo selezionato è Baseline. Specificare l&#39;intervallo di tempo per essere gli ultimi cinque secondi della linea di base (circa 55-60 secondi). </li><li> Selezionare la casella relativa correzione Inter-passo e selezionare Allinea a dissociazione. Assicurarsi che la casella Savitzky-Golay filtro viene controllato e premere il tasto di processo &quot;Dati! ̶1; </li><li> Passare alla scheda Analisi. Assicurarsi che &quot;Associazione e dissociazione&quot; è la selezione per i passaggi per analizzare e che il modello è di 1: 1. Selezionare un locale, in forma completa e premere &quot;Curve Fit!&quot; </li><li> Evidenziare tutte le curve nella tabella e fare clic destro per impostare tutte le curve a un colore. Avanti, selezionare un fit (Full) globale, raggruppati per colore e Rmax scollegato dal sensore. Premere &quot;Curve Fit!&quot; Per ottenere i dati cinetici globali. </li></ol></li></ol> 5.-tallone Rilevazione di BNT-II e rcHRP-II con Ir1 <ol><li> Preparare 1 ml ciascuna di una soluzione 1 mM di BNT-II e rcHRP-II in HBS con Tween (HBST; HBS con 0,025% Tween 20). </li><li> Serialmente diluire ogni proteina della metà in HBST ad una concentrazione finale di 15,6 nM. </li><li> Dispensare 100 ml di ogni diluizione, in triplice copia, in una piastra a 96 pozzetti bianco, con le diluizioni in ordine dal più basso al più alto concentrazione di una colonna. </li><li> Pipettare 10 ml di 50 micron Ni (II) NTA particelle magnetiche agarosio in ogni diluizione bene. <ol><li> Vortex la provetta contenente le particelle magnetiche dopo ogni pipettaggio per garantire le particelle rimangono sospese. </li></ol></li><li> Porre la piastra su un agitatore per 15 minuti per incubare i campioni con le particelle. </li><li> Dopo questo periodo di incubazione, posizionare la piastra su un magnete piastra a 96 pozzetti e attendere 30 sec per le particelle di tirare dalla soluzione. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, tirare fuori il campione originale e scartare come rifiuti. Rimuovere la piastra dal magnete. </li><li> Aggiungere 200 ml di HBST in ogni pozzetto usando la pipetta multicanale. Pompa il buffer su e giù diverse volte per lavare le particelle magnetiche. </li><li> Posizionare la piastra posteriore sul magnete e attendere 30 secondi per le particelle di tirare dalla soluzione. </li><li> Utilizzando la pipetta multicanale, tirare fuori i 200 ml di tampone e scartare come rifiuti. Rimuovere la piastra dal magnete. </li><li> Ripetere i punti 5.8 through 5.10 due volte per completare tre lavaggi delle particelle. </li><li> Aggiungere 100 ml di HBST ad ogni pozzetto contenenti particelle magnetiche seguiti da 2,5 ml di 2 Ir1 mm. </li><li> Incubare le particelle con Ir1 su un agitatore per 1 ora. </li><li> Dopo 1 ora, leggere l&#39;intensità di emissione a 510 nm (eccitazione a 365 nm) utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti. <ol><li> Porre la piastra in strumento e aprire il software lettore di piastre per configurare un nuovo esperimento. </li><li> Impostare il nuovo esperimento di leggere un endpoint di fluorescenza con una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 365 nm ed emissione lunghezza d&#39;onda di 510 nm. Impostare la larghezza della fenditura per entrambe le lunghezze d&#39;onda di 9 nm, con l&#39;ottica nella posizione superiore. </li><li> Leggere la piastra ed esportare i dati per l&#39;analisi. </li></ol></li><li> Trasferire i campioni ad un chiaro piastra a 96 pozzetti e immagine la titolazione mediante una Transilluminatore UV. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Come strumenti diagnostici basati su microparticelle vengono alla ribalta della tecnologia diagnostica moderna, l&#39;individuazione di biomolecole bersaglio direttamente sulla superficie della particella è un grande vantaggio. Metodi di rilevamento molecolari tradizionali, come ELISA e PCR, sono vantaggiosi, in quanto possono raggiungere molto bassi limiti di rilevazione 25. Tuttavia, questi test richiedono ampi reagenti e protocolli lunghi. Questo test è stato progettato per simulare le interazioni di tipo ELISA a sandwich senza il tempo ei requisiti reagenti (Figura 5). Inoltre, il costo della sonda Ir1 per campione è stato stimato a circa un centesimo, mentre il costo di anticorpi per un tipico ELISA è $ 0,20-0,30 per campione. Poiché i metodi sopra descritti si basano su una sonda iridio ciclometallati per il rilevamento del biomarker malarica, questa sonda non sarebbe suscettibile di modi di guasto comune ad altri metodi di rilevamento (es. Fluoroforo quenching e la degradazione degli anticorpi / enzima). Istidina è unico nelle sue caratteristiche di legame metallo. Il lavoro descritto sfrutta questo fenomeno sostituendo gli anticorpi in un tipico panino ELISA con contenenti metalli complessi. Ni (II) NTA cattura rcHRP-II sulla superficie della particella e Ir1 segnala la presenza della proteina. La fase più critica nel saggio sta permettendo le particelle magnetiche per mescolare con il campione e la sonda. In una piastra a 96 pozzetti ELISA, biomolecole e reagenti raggiungono l&#39;equilibrio con la superficie bidimensionale del fondo del pozzo. Particelle magnetiche hanno la tendenza a stabilirsi dalla soluzione per il loro nucleo di ferro-ossido denso, che ridurrebbe i siti di legame disponibili. Così, le particelle devono essere miscelati durante il tempo di saggio per garantire la massima vincolante. Nel progettare un reagente per la diagnosi di malattia, bisogna tenere presente forma di campione del paziente come pure la concentrazione fisiologica del biomarker. Permalaria, la concentrazione di pf HRP-II nel sangue di un paziente può variare da basso a alto picomolare nanomolare. Mentre questo saggio è clinicamente rilevante per i livelli più alti di infezione, il limite di rilevamento deve essere migliorata al fine di individuare i pazienti asintomatici con basso picomolare circolante pf HRP-II. Nei metodi descritti sopra, la &quot;switch-on&quot; segnale generato da Ir1 si verifica in presenza di istidina. Mentre il biomarker malarica è ricca di istidina, altre proteine ​​del siero, come albumina di siero umano e istidina ricca glicoproteina, risulterebbe in una risposta di segnale con la sonda. Ciò a sua volta portare a diagnosi di falsi positivi. Questo rende la cattura della proteina sulla superficie della particella un passo vantaggioso, in quanto la proteina di interesse può essere rapidamente estratto da un campione clinico. Inoltre, la progettazione di una sonda bifunzionale, che le coppie un ricco peptide istidina ad un elemento di riconoscimento molecolare robusta (es. Aptamer), Potrebbe aggiungere un altro strato di specificità del test. Il peptide dovrebbe essere caricato con iridio prima dell&#39;accoppiamento al aptamer. In tale disegno, la sonda stabile Ir1 può ancora essere utilizzata mentre il raggiungimento dell&#39;obiettivo specificità con aptamer. Ciò consentirebbe l&#39;applicazione della sonda per rilevare nativa HRP-II in una matrice complessa (es. Plasma o sangue intero) e ridurre gli effetti vincolanti non specifici. Al fine di migliorare ulteriormente il segnale di test diagnostici rapidi, il dosaggio potrebbe essere incorporato in un sistema electrochemiluminescent (ECL), dove pf HRP-II può essere rilevata sulla RDTs come un visualizzatore 26 elettrochimica. Questa sonda generazione iridio successivo sarebbe migliorare notevolmente la nostra on-bead ELISA per la rilevazione di biomarcatori di malattia.

Etichettatura colorimetrica e fluorescenti è un metodo importante per l&#39;individuazione e la localizzazione di molecole biochimiche e dei processi 1,2. I marcatori fluorescenti più comuni sono a basso peso molecolare, coloranti organici 3,4, ma queste molecole non hanno sempre proprietà ottiche ideali. Coloranti fluorescenti sono inclini a photobleaching, spesso hanno piccoli spostamenti Stokes, e può avere sovrapposizioni di eccitazione e spettri di emissione. Etichettatura colorimetrico è spesso raggiunto con l&#39;uso di etichette enzimatiche, che hanno un segnale amplificato utile immunodosaggio quantificazione 5,6. Questi enzimi hanno anche i loro svantaggi, tra cui fotosensibilità, condizioni di reazione, e la shelf life breve substrato. Queste proprietà tendono a richiedere saggi immunologici e metodi di etichettatura di proteine ​​deve essere fatto in condizioni ben controllate utilizzano reagenti costosi. Complessi di metalli di transizione emissivi sono stati esplorati come un approccio di etichettatura alternativa for rilevamento biochimica. In particolare, ciclometallati Ir (III) è stata studiata nel contesto di diodi luminosi organici (OLED) di rilevamento 7-9 ossigeno 10, Catalisi 11, e proteine ​​/ cella colorazione 12-14. Alta fotostabilità ed efficienza quantica rendono questa classe di sonde un buon candidato per il rilevamento di biomolecole 15,16. In precedenza era emerso che ciclometallati Ir (III), nella forma [Ir (C ^ N) 2 (solv) 2] +, irreversibilmente legano istidina e suscitare una risposta del segnale blu-verde 12,17. Questi complessi sono non emissive nello stato solvento, ma quando istidina sposta le molecole di solvente e si lega al centro metallico, rilasciano un segnale fosforescente intenso dopo irradiazione onde lunghe UV. Questo segnale si verifica solo dopo sostituzione del legante, ed è il risultato di un elettrone tripletto relax allo stato fondamentale attraverso l&#39;attivazione di trasferimento di carica metallo legante (3 MLCT) e trasferimento al centro ligando (3 LC) percorsi 8,15. Questi complessi possono potenzialmente essere usati come sonde di rilevamento per le proteine ​​ricche di istidina. Proteine ​​ricche di istidina e dei loro livelli di regolazione sono importanti in molte malattie, tra cui la cirrosi epatica, cancro e disordini thrombic. 18 Plasmodium falciparum istidina Rich Protein II (pfHRP-II), in particolare, è un biomarcatore ben validato per l&#39;infezione parassita della malaria. Questa proteina è 67 kDa e contiene il 34% istidina, per lo più all&#39;interno di caratteristici AHHAHHAAD ripetendo motivi 19. Queste ripetizioni istidina possono legare ioni metallici liberi 19 e 20 eme complessi nel sangue dell&#39;ospite. pfHRP-II è comunemente rilevato in ambienti con scarsa risorsa utilizzando immunocromatografici test di diagnosi rapida (RDTs), ma questi test sono spesso imprecisi a causa delle condizioni del campione, bassa concentrazione di biomarker, standard di produzione poveri e la degradazione degli anticorpi 21. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; sonde fosforescenti a base di metallo, come il ciclometallati Ir (III) di cui sopra sono opzioni interessanti per la rilevazione di pfHRP-II a causa della loro legame selettivo di istidina e le loro proprietà stabili e di emissione efficiente. In questo lavoro, l&#39;uso di [Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2] + (IR1) per rilevare BNT-II, un peptide mimica ramificata di pfHRP-II viene esplorata 22. Cinetica di questa interazione sono stati monitorati in tempo reale utilizzando le tecniche di interferometria biolayer. Il dosaggio è stato anche adattato per un on-tallone formato ELISA-tipo, dove sono stati raggiunti i limiti nanomolari di rilevamento. Questo test detiene vantaggi rispetto ELISA tradizionali perché può essere eseguito in meno di 2 ore con i reagenti senza anticorpi, invece del 4-5 hr e reagenti biologici richiesti con ELISA tipici.

<table><tbody><tr><td>Dicholortetrakis(2-(2-piridinil)fenil)diiridio(III)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>658383</td><td></td></tr><tr><td>trifluorometanosolfonato d'argento</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>176435</td><td></td></tr><tr><td>Gel di silice</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6858</td><td></td></tr><tr><td>L-Aminoacidi</td><td>Fisher Scientific</td><td>varia</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>BNT-II peptide</td><td>sintetizzato in house</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ricombinante HRPII</td><td>Immunology Consultants Laboratory inc.</td><td>AGPF-55</td><td></td></tr><tr><td>Costar Piastra a 96 pozzetti in polipropilene nero</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-567</td><td></td></tr><tr><td>Costar Piastra a 96 pozzetti in polipropilene bianco</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Grenier Piastra a 96 pozzetti in polipropilene nero</td><td>VWR</td><td>89089-582</td><td></td></tr><tr><td>Ni(II)NTA particelle di agarosio magnetico</td><td>Qiagen</td><td>36111</td><td></td></tr><tr><td>Ni(II)NTA sensori per interferometria a biostrati</td><td>ForteBio</td><td>18-5101</td><td></td></tr><tr><td>Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet</td><td>ForteBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotek Synergy H4 Lettore di micropiastre</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher Transilluminatore Biotech</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBDLT-88</td><td></td></tr></tbody></table>

iridium (iii) luminescente sonda per il rilevamento della proteina malarica biomarker istidina rich protein-ii

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Questo lavoro descrive la sintesi di un non-emissivi, ciclometallati Ir (III), Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 + (IR1), che provoca una rapida, segnale fosforescenti longeva quando coordinate per un histidine- contenente proteina immobilizzata sulla superficie di una particella magnetica. Sintesi di Ir1, in alte rese, è completo O / N e prevede la separazione del genitore ciclometallati Ir (III) dimero cloro-ponte in due equivalenti del complesso solvatato. Per confermare la specificità, diversi aminoacidi sono stati sondati per l&#39;attività di coordinamento quando aggiunto alla sonda sintetizzato, e solo istidina suscitato un segnale di risposta. Utilizzando BNT-II, un peptide mimica ramificato del biomarker malarica Istidina Rich Protein II (pfHRP-II), la sonda di iridio è stata convalidata come strumento per il rilevamento HRP-II. Effetti tempra sono stati notati nella titolazione BNT-II / Ir1 rispetto alla L-istidina / Ir1, ma questi sono stati attribuiti al sterico e triPlet tempra Stato. Biolayer interferometria stata utilizzata per determinare la cinetica in tempo reale di interazione di Ir1 con BNT-II. Una volta che il sistema è stato ottimizzato, il limite di rilevazione di rcHRP-II utilizzando la sonda è risultato essere 12,8 nM in soluzione. Quando questa proteina era immobilizzato sulla superficie di una particella magnetica agarosio 50 micron, il limite di rilevazione era 14,5 nM. La risposta forte segnale di questa sonda inorganico, nonché la flessibilità di impiego in soluzione o immobilizzato su una superficie, possono prestarsi verso una varietà di applicazioni, da uso diagnostico all&#39;imaging.

Come mostrato in figura 1, la sintesi del Ir1 solvento complesso splitting coinvolto del ponte cloruro nelle dimero genitore per precipitazione del cloruro sotto forma di AgCl insolubile e associazione di molecole d&#39;acqua al centro metallico. La formazione di Ir1 stata confermata da H 1 NMR e ESI. Inoltre, le bande UV-visibile caratteristici di legante metallo trasferimento di carica e π-π transizioni * sono stati assegnati allo spettro, convalidando ulteriormente la formazione di Ir1. Questo solvatato presenta complessi nessun personaggio emissivo quando eccitato a 365 nm. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig1.jpg" /> Figura 1:. Sintesi e caratterizzazione di Ir1 reazione ponte Cloruro scissione Dichlorotetrakis (2- (2-piridinil) fenil) diiridium (III) per creare il complesso aquo Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 </sub&gt; + (IR1). Dopo aggiunta di L-His al complesso aquo in tampone acquoso, il segnale luminescente è acceso. Una volta che il complesso è stato sintetizzato e caratterizzato, la selettività amminoacido è stato analizzato come descritto in precedenza utilizzando un iridio simile analogico 17. Figura 2A mostra che solo istidina suscitato una risposta segnale a 510 nm, quando eccitato a 365 nm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig2.jpg" /> Figura 2: aminoacidi Selettività e titolazione di Ir1 con istidina Rich peptidi (A) Interazione di 200 micron di vari amminoacidi (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, la sua) con 50 micron. IR1 in HBS. Scansioni spettrali sono state prese 400-700 nm a una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 365 nm in un nero 96 pozzetti. Segnale in unità di fluorescenza relativa (RFU) da tutti gli aminoacidi baggiunto che oltre istidina (tratteggiata traccia nera) è stato trascurabile. Le concentrazioni (B) nanomolari di BNT-II (▪) e rcHRP-II (♦) è stata titolata con Ir1 in HBS. Le ricche peptidi istidina sono state incubate con la sonda per 15 min in soluzione prima di leggere l&#39;emissione a 510 nm dopo l&#39;eccitazione con luce 365 nm. Limite di rilevazione è stato calcolato come il valore di x quando y = 3σ vuoto. Questo &quot;interruttore on-&quot; della fosforescenza della sonda di iridio si verifica perché lo stato eccitato di singoletto (1 MLCT / 1 LC) del Ir (III) Bioconjugate subisce incrocio intersistema per la tripletta stato eccitato (3 MLCT), quando istidina è coordinato al centro metallico. Questa sonda è stato applicato a BNT-II un peptide mimica del biomarcatore malaria Plasmodium falciparum istidina Rich Protein II (pf HRP-II). In una titolazione di BNT-II con Ir1, una risposta di segnale dipendente dalla concentrazione è stato osservato ( <strong&gt; Figura 2B). Ricombinante HRP-II (rcHRP-II) espone anche una risposta simile in soluzione. I limiti di rilevamento di BNT-II e rcHRP-II in soluzione erano 54.8 nm e 12,8 nM rispettivamente. Utilizzando tecniche biolayer interferometria, il K D di Ir1 legame BNT-II immobilizzato su una superficie di Ni (II) NTA è risultato essere 2,05 mM (Figura 3). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig4.jpg" /> Figura 3: tempo reale Kinetic Analisi Ir1 con BNT-II Biolayer interferometria per analisi cinetica di varie concentrazioni di Ir1 vincolanti per BNT-II sulla superficie di un sensore di vetro (II) NTA Ni.. Dopo equilibrare i sensori in KB (regione A), i sensori sono caricati con 0,5 mM BNT-II (Region B). Una volta che il peptide è caricato sui sensori, una linea di base è stabilito (Region C) prima di misurare l&#39;associazione Ir1 al BNT-II (Regione D). Dopoun periodo di associazione, i sensori sono posti di nuovo in KB per misurare la dissociazione (Regione E). L&#39;intero processo di analisi cinetica richiede meno di 30 min. Durante la transizione da un saggio basato soluzione su una piattaforma particella magnetica, la complessità della particella nel sistema doveva essere preso in considerazione. Si sapeva da precedenti lavori, che queste particelle si legano in modo efficiente il pf malaria biomarcatore HRP-II. 24 tavole Fluorescent Black funzionato bene per il saggio soluzione descritto sopra, ma piatti bianchi erano più adatto per la piattaforma on-particelle di rilevamento, come si è visto in Figura 4A. In una piastra bianca, la luce viene riflessa nel campione, consentendo così di migliorare assorbanza per il Ir1 legata alla superficie della particella. Nel test on-particella, il limite di rilevazione di rcHRP-II è stato determinato in 14,5 nM (Figura 4B). Il limite di rilevazione per rcHRP-II in soluzione e-tallone erano statiscamente la stessa sulla base di un t-test non appaiati (p = 0,731). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> Figura 4:. On-bead Rilevamento BNT-II e HRP-II (A) tra il segnale rilevato dal Ir1 vincolato al BNT-II sulla superficie di 50 micron Ni particelle di agarosio (II) NTA magnetici in un nero 96- pozzetti (linea continua) rispetto ad una piastra a 96 pozzetti bianco (linea tratteggiata). Le particelle erano eccitati con 365 nm di luce, e l&#39;emissione è stata misurata a 510 nm. (B) Titolazione di rcHRP-II immobilizzato sulle particelle magnetiche e rilevato utilizzando Ir1. Limite di rilevazione è stato calcolato come value di x quando y = 3σ vuoto. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" /> Figura 5: Rappresentazione schematica del rilevamento in tallone di rcHRP-II con Ir1 schema generale di HRP-II legame alla superficie di Ni (II) NTA particelle e marcato con Ir1.. Le particelle vengono incubati con una ricca peptide istidina per 15 min. Dopo questo periodo di incubazione, le particelle vengono lavate con HBST utilizzando un magnete, per tirare le particelle dalla soluzione. Infine, le particelle di peptide legato vengono incubate con Ir1 per 1 ora prima di leggere l&#39;emissione a 510 nm dopo l&#39;eccitazione con luce 365 nm.

I reagenti di rilevamento robusti sono sempre più necessari per lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici per la malaria. È stata progettata una sonda all'iridio (III) che emette un segnale luminescente di lunga durata in presenza di un biomarcatore proteico malarico ricco di istidina. La rilevazione della proteina, sia in soluzione che immobilizzata su una particella magnetica, offre flessibilità nell'applicazione.

Iridium (III) luminescente sonda per il rilevamento della proteina malarica Biomarker istidina Rich Protein-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare la presenza di un biomarcatore proteico ricco di istidina in un campione, utilizzando una sonda di iridio fosforescente. Questo risultato si ottiene innanzitutto sintetizzando il complesso di iridio ciclometilato. Dopo una rapida scissione del ponte cloruro del complesso dimero progenitore, il complesso di iridio ciclometilato può essere isolato e purificato per essere impiegato nel saggio.Il secondo passaggio consiste nel validare le interazioni della sonda con vari aminoacidi per garantirne la specificità. Nel caso dell'istamina da sola, il segnale fosforescente si attiva solo in presenza di istamina ed è osservato mediante spettroscopia di luminescenza. Successivamente, a titolo dimostrativo, la sonda all'iridio viene titolata con un peptide che imita il biomarcatore della malaria, la proteina ricca di istidina due, per determinare i limiti di rilevamento in soluzione.Inoltre, la cinetica dell'interazione tra la sonda e il peptide viene chiarita mediante interferometria a strato biologico. L'ultimo passaggio consiste nell'immobilizzare la proteina ricombinante ricca di istidina sulla superficie di particelle magnetiche di Ni-NTA e valutare il limite di rilevamento della proteina utilizzando la sonda. Infine, si utilizzano luminescenza e spettroscopia per dimostrare come le proteine possano essere rilevate sulla superficie di un supporto solido mediante una nuova classe di sonde fosforescenti a iridio.I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'etichettatura con proteine fluorescenti e i saggi immunoistochimici sono che la sonda è robusta. Presenta una cinetica di associazione rapida e non è soggetta a fotodegradazione. Inoltre, questa tecnica non richiede tempi prolungati come quelli necessari per i saggi immunoistochimici.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi dell'infezione da malaria? Questo è dovuto all'elevato contenuto di istidina della proteina biomarcatore per l'infezione da plasmodio SRO chiamata proteina ricca di istidina due. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo notato che era stato pubblicato un articolo che utilizzava una sonda di iridio ciclometallata per colorare cellule vive.In questo articolo, hanno affermato che la sonda è entrata nella cellula vivente ed ha illuminato i nuclei legandosi alle proteine ricche di istone. Data la natura del biomarcatore mal, la proteina ricca di istone due, abbiamo deciso di utilizzare questa sonda per rilevare la nostra proteina di interesse. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale a causa della complessità del saggio e dei numerosi passaggi di lavaggio e trasferimento necessari per rilevare questa proteina bersaglio sulla particella. Per iniziare, si pesano 53,6 milligrammi del dimero di iridio genitore e si sciolgono in cinque millilitri di cloruro di metilene.Aggiungere questa soluzione a un pallone da 50 millilitri dotato di una barretta magnetica a stella. Quindi pesare 26,2 milligrammi di FL d'argento e scioglierli in cinque millilitri di metanolo. Aggiungere il FL d'argento disciolto alla soluzione madre del dimero di iridio e agitare per un'ora.Dopo un'ora dovrebbe formarsi una sospensione di colore crema; filtrare la sospensione attraverso gel di silice in un pallone. Trasferire il prodotto filtrato in un vial DRAM da 25 per 95 millimetri ed evaporare il solvente residuo mediante evaporazione rotante per cinque-dieci minuti. Una volta rimosso la maggior parte del solvente, verificare che nel vial rimanga un residuo oleoso di colore giallo.A questo residuo, aggiungere un millilitro di metanolo per solubilizzare il prodotto. Lasciare riposare per uno o due giorni fino a ottenere un solido giallo e caratterizzare il prodotto come descritto nel protocollo del testo per studiare le interazioni della sonda all'iridio con vari aminoacidi. Pipettare 100 microlitri di ciascuna soluzione di aminoacido in una piastra nera a 96 pozzetti.Aggiungere 100 microlitri di soluzione salina tamponata o HBS alla piastra come bianco. Quindi aggiungere 2,5 microlitri della soluzione preparata del sonda di iridio a due millimolari a ciascun campione e agitare la piastra su un agitatore per piastre per 10 minuti. Dopo 10 minuti, acquisire gli spettri di emissione dei campioni utilizzando un lettore per piastre a 96 pozzetti.A tale scopo, posizionare la piastra nello strumento e aprire il software del lettore di piastre per impostare un nuovo esperimento. Successivamente, trasferire i campioni in una piastra trasparente da 96 pozzetti ed eseguire l'immagine dell'emissione utilizzando un transilluminatore UV per effettuare la titolazione della sonda all'iridio con il peptide ramificato che imita il biomarcatore della malaria, la proteina ricca di istidina due BNT due. Preparare innanzitutto una soluzione madre da un millimolare di BNT due in HBS.Quindi diluire in modo seriale la soluzione BN T due come descritto nel protocollo testuale. Aggiungere 100 microlitri di ogni diluizione in triplice replicato, utilizzando HBS come bianco, nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti; per ogni campione, aggiungere 2,5 microlitri di sonda all'iridio a due millimolare. Agitare la piastra per 10 minuti su un agitatore per piastre; dopo l'agitazione, leggere l'intensità di emissione a 510 nanometri utilizzando un lettore per piastre a 96 pozzetti.Infine, trasferire i campioni in una piastra trasparente a 96 pozzetti ed eseguire l'immagine della titolazione utilizzando un transilluminatore UV per effettuare un'analisi cinetica in tempo reale mediante interferometria a biocouche. Inizialmente, aggiungere 200 microlitri di tampone cinetico in otto pozzetti della prima colonna di una piastra nera a 96 pozzetti. Dopo aver inserito la piastra nel supporto di sensori in plastica, trasferire con attenzione otto biosensori al nichel nella prima colonna del supporto in plastica, in modo che le punte siano sospese nei pozzetti contenenti tampone.Quindi fissare il supporto in plastica sul lato sinistro dello strumento di interferometria a una nuova piastra nera da 96 pozzetti, pipettando 200 microlitri di KB in tutti e otto i pozzetti delle colonne uno e tre della stessa piastra, e 200 microlitri della soluzione di BNT due 0,5 micromolare nei pozzetti della colonna due. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di ciascuna diluizione della sonda all'iridio nella colonna quattro, utilizzando KB come bianco nel pozzetto A4. Aggiungere le diluizioni in modo che la concentrazione della sonda all'iridio aumenti progressivamente lungo la colonna.Posizionare questa piastra nello strumento a destra della piastra contenente i sensori pre-umidificati nel software di interferometria a biocapanna. Impostare un esperimento cinetico di base definendo il saggio della piastra e le punte dei sensori per definire la piastra, fare clic con il tasto destro del mouse su una colonna dello schermo e scegliere la definizione appropriata. Per i pozzetti, selezionare il tampone.Per le colonne uno e tre, caricare per la colonna due e per il campione. Per la colonna quattro, definire il saggio nella scheda successiva cliccando prima su aggiungi equilibrio. Caricamento di 60 secondi e 120 secondi.Associazione 120 secondi e dissociazione 300 secondi. Selezionare il passaggio di equilibrio e fare doppio clic sulla colonna uno. Successivamente, fare lo stesso per il caricamento sulla colonna due, la linea di base sulla colonna tre, l'associazione sulla colonna quattro e la dissociazione sulla colonna tre.Infine, selezionare i sensori al nichel NTA. Verificare che l'esperimento sia descritto correttamente. Inserire un nome file.Assicurarsi che l'opzione "ritarda esperimento" sia selezionata e premere "vai". Al termine della corsa cinetica, elaborare i dati nel software di elaborazione fornito per eseguire il rilevamento su bead di BNT due e HRP ricombinante due con la sonda all'iridio. Preparare delle diluizioni seriali di BNT due e HRP ricombinante due come descritto nel protocollo testuale.Quindi pipettare 100 microlitri di ciascuna diluizione in triplice replicato in una piastra bianca da 96 pozzetti, disponendo le diluizioni in ordine di concentrazione crescente lungo una colonna. Aggiungere 10 microlitri di particelle magnetiche al nickel NTA 50 micron in ciascun pozzetto. Tenere presente che le particelle magnetiche devono rimanere sospese durante la pipettatura. Se iniziano a sedimentare, risospendere mediante pipetta o vortex. Successivamente, posizionare la piastra su un agitatore per piastre e incubare i campioni con le particelle per 15 minuti. Trascorso questo periodo di incubazione, posizionare la piastra su un magnete per piastre da 96 pozzetti e attendere 30 secondi affinché le particelle siano attratte fuori soluzione.Utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere il campione originale e scartarlo come rifiuto dopo aver prelevato la piastra dal magnete, aggiungendo 200 microlitri di HBS con tween o HBST in ogni pozzetto. Con la pipetta multicanale, aspirare e dispensare il buffer su e giù per diverse volte per lavare le particelle magnetiche. Rimettere la piastra sul magnete e attendere 30 secondi affinché le particelle si separino dalla soluzione.Utilizzando la pipetta multicanale, aspirare i 200 microlitri di tampone ed eliminarli come rifiuto. Rimuovere la piastra dal magnete prima di ripetere i passaggi di lavaggio per due volte, per un totale di tre lavaggi delle particelle. Quindi aggiungere 100 microlitri di HBST in ogni pozzetto contenente le particelle magnetiche, seguiti da 2,5 microlitri della soluzione del sonda all'iridio 2 millimolare.Incubare le particelle con la sonda all'iridio su un agitatore per piastre per un'ora. Dopo un'ora, leggere l'intensità di emissione a 510 nanometri utilizzando un lettore per piastre a 96 pozzetti.Dopo la sintesi e la caratterizzazione della sonda ciclometallata al iridio, vengono testati diversi aminoacidi per verificarne la reattività con il complesso. Solo l'istidina induce una risposta del segnale in unità di fluorescenza relativa durante la titolazione della sonda. In presenza di due peptidi contenenti istamina in soluzione, si osserva una risposta dipendente dalla concentrazione.Questa risposta può essere osservata qui sotto luce UV a banda larga. La interferometria a biolivello per l'analisi cinetica di diverse concentrazioni della sonda all'iridio che si lega al BNT due sulla superficie di un nickel. Un sensore in vetro NT.A rivela che la sonda all'iridio possiede affinità nell'ordine dei micromoli, nei confronti dei peptidi contenenti istidina.Il limite di rilevamento per la proteina ricca di istidina, utilizzando la sonda, era simile quando la proteina era immobilizzata sulla superficie di una particella magnetica. Come in soluzione, questa marcatura della proteina può essere visualizzata sulla superficie delle particelle stesse, una volta acquisita la tecnica. Questa tecnica può essere eseguita in due ore se svolta correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di prestare attenzione durante i passaggi di lavaggio e trasferimento con le particelle a cui sono legate le proteine magnetiche. Rimuovere le proteine non legate è fondamentale per una corretta rilevazione della P-F-H-R-P due immobilizzata, progettando un elemento di riconoscimento molecolare in grado di bersagliare specificamente la proteina legata attraverso interazioni antigene-anticorpo. L'utilizzo continuativo della sonda robusta a base di iridio permetterà una rilevazione più sensibile e specifica delle proteine legate sulla superficie delle particelle, dopo il suo sviluppo.Questa tecnica potrebbe essere utilizzata per aprire la strada ai ricercatori nel campo della diagnostica, consentendo di esplorare l'impiego di reagenti robusti non solo per il rilevamento della malaria, ma anche per altre malattie infettive.

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Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

Qui vi presentiamo un protocollo per analizzare le interazioni RNA / proteine. Il saggio spostamento mobilità elettroforetica (EMSA) si basa sulla migrazione differenziale di complessi RNA / proteine ​​e RNA libero durante elettroforesi su gel nativo. Utilizzando una sonda RNA radioattivo, RNA complessi / proteici possono essere visualizzati mediante autoradiografia.

Electrophoretic Maiusc Mobility Assay (EMSA) per lo studio delle interazioni RNA-proteina: La IRE / IRP Esempio

Mentre l'analisi alta risoluzione fusione offre la capacità di distinguere tra polimorfismi a singolo nucleotide in una popolazione eterogenea, allele mutante pregiudizi amplificazione può aumentare la sua capacità di individuare alleli presenti a relativamente basse percentuali all'interno di un campione. Questo protocollo descrive miglioramenti che migliorano la sensibilità dell'analisi fusione alta risoluzione.

I metodi per aumentare la sensibilità di High Resolution Melting polimorfismo a singolo nucleotide genotipizzazione a malaria

Qui descriviamo una procedura che permette un'analisi dettagliata dell'attivazione dipendente dalla fosforilazione del fattore di trascrizione IRF3. Ciò si ottiene attraverso la combinazione di una SDS-PAGE ad alta risoluzione e di una PAGE nativa accoppiata a immunoblot utilizzando più anticorpi fosfospecifici.

A High Resolution metodo per monitorare l&#39;attivazione fosforilazione-dipendente di IRF3

Qui, presentiamo un protocollo per la rilevazione e la quantificazione del Plasmodium falciparum in acquosi globuli rossi infetti utilizzando un spettrometro a infrarossi riflessione totale attenuata e analisi multivariata dei dati.

Rilevazione e quantificazione del Plasmodium falciparum in acquoso globuli rossi da attenuato spettroscopia infrarossa totale riflessione e l'analisi multivariata dei dati

L'elettrochemiluminescenza immunoassay (ECLIA) è un nuovo approccio per il rilevamento quantitativo delle varianti della proteina MeCP2 endogene ed esogenamente applicate su un'ampia gamma di lavoro. Qui, viene descritto il protocollo per il MeCP2-ECLIA in un formato 96-well.

Un saggio basato sull'elettrochemiluminescenza per le varianti proteiche MeCP2

Qui presentiamo un protocollo per il rilevamento ottico ad alta risoluzione di informazioni chimiche intorno a dispositivi medici impiantati con imaging chimico a luminescenza eccitata a raggi X (XELCI). Questa nuova tecnica di imaging è stata sviluppata nel nostro laboratorio che consente di studiare la biochimica delle infezioni associate agli impianti.

Imaging chimico ad alta risoluzione spaziale delle infezioni associate all'impianto con luminescenza eccitata a raggi X Imaging chimico attraverso il tessuto

Il presente protocollo descrive un'operazione di imaging a fluorescenza NIR-II dettagliata e in tempo reale di un topo utilizzando un dispositivo di imaging ottico NIR-II.

Una sonda di fluorescenza NIR-II luminosa per l'imaging vascolare e tumorale

Scopri la sintesi di una sonda fosforescente all'iridio per rilevare il biomarcatore della malaria istidina-rich protein 2. Questo metodo offre rilevamento robusto e cinetica rapida per diagnosi affidabili.

Iridium (III) luminescente sonda per il rilevamento della proteina malarica Biomarker istidina Rich Protein-II

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