Un metodo per Remotely Silencing Neural Activity in Roditore Durante Fasi discreti di apprendimento

L'obiettivo di questa procedura è quello di silenziare temporaneamente e a distanza l'attività neuronale in regioni cerebrali discrete mentre gli animali sono impegnati in compiti di apprendimento e memoria. Ciò si ottiene caricando prima l'a a V che contiene un recettore di progettazione e un reporter in una siringa per infusione. Il secondo passo è quello di infondere una a V nella regione di interesse nel cervello del ratto.

Successivamente, il farmaco biologicamente inerte clozapina e ossido viene preparato e iniettato sistemicamente nel ratto. Il passo finale consiste nel condurre test comportamentali utilizzando un paradigma di precondizionamento sensoriale. In definitiva, la microscopia a immunofluorescenza sul tessuto cerebrale di ratto viene utilizzata per verificare il posizionamento del recettore designer.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze comportamentali, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la regolazione della motivazione, dell'attenzione, dell'apprendimento e della memoria Assicurarsi che tutte le precauzioni istituzionali per lavorare con i virus adeno-associati siano seguite in tutto il virus utilizzato in questo video è classificato come composto di livello uno di biosicurezza. Preparare una soluzione di candeggina al 10%. La decontaminazione di un luogo di scarico, una bega contenente una soluzione di candeggina e una siringa sterile da 10 microlitri.

Nell'area di lavoro, posizionare la provetta per microcentrifuga contenente un'aliquota di a a V in una morsa da banco standard Load, una siringa da 10 microlitri con almeno quattro microlitri di a v. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nei quattro microlitri di una soluzione a v. Nella siringa, gettare la provetta vuota del virus nel becher contenente il 10% di candeggina.

Aggiungere altro 10% di candeggina al contenitore dei rifiuti e lasciare riposare i rifiuti per 30 minuti prima di smaltire i rifiuti liquidi decontaminati come specificato dalle linee guida istituzionali. Preparare l'area chirurgica posizionando della carta assorbente da banco sotto l'apparato stereotassico e su uno spazio adiacente designato come area dedicata alla manipolazione dei virus. Dopo aver indotto l'anestesia era del 3% di isof, fluoro e ossigeno a una velocità di un litro al minuto.

Rasare il pelo tra gli occhi fino a leggermente dietro le orecchie. Dopo la rasatura, rimettere il ratto nella camera di induzione per tre minuti con il ratto fissato in un apparato stereotassico. Coprire gli occhi con un unguento per oftalmi e preparare il sito di incisione pulendo con Betadine.

Dopo aver praticato un'incisione della linea mediana di 2,4 centimetri della pelle, sovrastante il cranio, a partire da circa due millimetri di cordale fino agli occhi, ritrarre la pelle per esporre il cranio e quindi eliminare il tessuto membranoso dal cranio fino a quando bgma e lambda sono chiaramente visibili. Dopo esserti assicurato che il cranio sia piatto, posiziona il trapano su bgma, azzera le coordinate, quindi sposta il trapano sulle coordinate mediali, laterali e posteriori anteriori desiderate. Praticare un foro utilizzando una punta da trapano da 0,9, 0,7 o 0,5 millimetri.

Impostare la pompa per infusione in modo che emetta il virus a una velocità di 0,2 microlitri al minuto. La siringa nel braccio di infusione del dispositivo stereotassico e abbassare la siringa alla coordinata desiderata. Utilizzare la pompa per erogare la quantità desiderata di virus al termine della somministrazione dei virus.

Lasciare la siringa in posizione per 10 minuti per evitare il riflusso nell'ago tracciato, sollevare lentamente la siringa a una velocità di circa cinque millimetri al minuto. Quindi passa alla coordinata successiva e ripeti la procedura fino a quando tutte le coordinate non sono state infuse con a a v. Dopo aver chiuso la ferita e aver fornito l'analgesia postoperatoria secondo il protocollo approvato, posizionare il ratto in una gabbia pulita con lettiera, coperchio e segnaletica adeguata.

Quando il topo si è completamente ripreso dall'anestesia, rimettilo nella stanza dell'alloggio. Attendere tre o più settimane prima di iniziare i test comportamentali per garantire un'adeguata espressione del recettore di design. Questa figura mostra le tre fasi del paradigma di precondizionamento sensoriale, la fase di precondizionamento, la fase di condizionamento e la fase di test.

Il farmaco di design, clozapina e ossido o CNO viene utilizzato per silenziare l'attività neurale Attivando il recettore di progettazione, il CNO può essere iniettato prima di qualsiasi fase di test. Qui, il CNO viene iniettato 30 minuti prima di ciascuna delle sessioni di precondizionamento. Dopo aver preparato una soluzione fresca di clozapina e ossido da un milligrammo per millilitro, secondo le istruzioni nella parte scritta del protocollo, iniettare il CNO per via intraperitoneale alla dose di un milligrammo per chilogrammo 30 minuti prima del test comportamentale.

Avviare il codice del computer per la sessione comportamentale appropriata. Trascorsi 30 minuti, posizionare i ratti nelle camere di prova e iniziare la prima delle 4 sessioni di precondizionamento di 64 minuti presentando ai ratti 12 prove mescolate che consistono nell'erogazione di stimoli uditivi e visivi. In sei delle prove viene presentato un tono dello stimolo di precondizione per 10 secondi, seguito immediatamente da una presentazione di cinque secondi dello stimolo luminoso lampeggiante nelle altre sei prove.

Presenta il rumore bianco, lo stimolo non trasmesso da solo per 10 secondi. Dopo aver completato la fase di precondizionamento, inizia le sessioni di condizionamento, che si svolgeranno per cinque giorni consecutivi. Presentare ai ratti otto prove che consistono nell'erogazione dello stimolo visivo, la luce lampeggiante per cinque secondi seguita immediatamente dall'erogazione di 2 pellet di cibo da 45 milligrammi.

Questo tempo include intervalli tra le prove che durano sette minuti al termine delle sessioni di condizionamento. Eseguire la singola sessione di test di 78 minuti presentando ai ratti 12 prove intermiste che consistono nella somministrazione dei soli stimoli uditivi. In sei delle prove.

Presentare lo stimolo del tono, lo stimolo di precondizione da solo, per 10 secondi. Nelle altre sei prove, presenta il rumore bianco, lo stimolo spaiato da solo per 10 secondi. Al termine del compito comportamentale, rimuovi immediatamente i ratti dalle camere e riportali nella colonia animale.

Analizzare i dati della fase di condizionamento e test secondo le istruzioni dettagliate nella parte scritta del protocollo. Dopo aver eseguito l'immunoistochimica diretta contro il reporter marcato o la proteina reporter, esaminare le sezioni di colorazione al microscopio per accertare la posizione e l'espressione del recettore progettista e/o del reporter come previsto controllo e i ratti sperimentali hanno appreso in modo simile l'associazione pavloviana tra lo stimolo della luce lampeggiante e il cibo. Durante le sessioni di condizionamento.

Durante le sessioni, entrambi i gruppi erano anche motivati a ottenere una ricompensa alimentare durante la sessione di condizionamento. Al contrario, durante la sessione di test critico, i ratti sperimentali non sono riusciti a discriminare tra gli stimoli uditivi precondizionati e quelli non ventilati, mentre i ratti di controllo mostrano un maggiore comportamento della tazza del cibo in risposta alle presentazioni dello stimolo precondizionato. Pertanto, i ratti di controllo, ma non quelli sperimentali, hanno mostrato l'effetto di precondizionamento sensoriale.

Questa immagine mostra la verifica istologica della posizione di un'infusione di a v nella regione di interesse nel cervello del roditore dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare i contributi di specifiche regioni cerebrali e/o tipi di cellule al comportamento complesso in vivo.