Name: Un metodo per Remotely Silencing Neural Activity in Roditore Durante Fasi discreti di apprendimento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Impara a silenziare l'attività neuronale in specifiche regioni cerebrali di roditori durante compiti di apprendimento e memoria. Questo metodo farmacogenetico consente di studiare i meccanismi neurali del comportamento.

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Ringraziamo di Robinson et al. 12 gli autori per il loro contributo il manoscritto da cui questo protocollo è parzialmente derivato.

L&#39;uso di animali sono approvati dalla Oberlin College Istituzionale Animal Care and Use Committee e sono conformi alla Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio 21. 1. Preparazione per Infusione virale Nota: Questo protocollo utilizza BSL-1 precauzioni. Quando si impiegano BSL-2 precauzioni, un camice da laboratorio e getta, guanti, copriscarpe, protezioni oculari e un respiratore per particolati (tipo N95) sono obbligatori. Tutte le persone manipolazione BSL-2 composti devono essere adatti testato per un respiratore per particolati da un&#39;agenzia sanitaria locale. Fare riferimento a Lowery &amp; Majewska (2010) 22 per ulteriori dettagli sulla movimentazione e lo stoccaggio di vettori virali. <ol><li> Al primo utilizzo, aliquota e conservare virus inutilizzata in 20 provette da microcentrifuga microlitri per evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti. </li><li> Preparare la superficie di lavoro, eliminando tutti gli oggetti inutili e sterilizzare la superficie con il 70% di etanolo. Preparare una 1Soluzione di candeggina 0% per la decontaminazione dei rifiuti AAV. Posizionare un bicchiere pieno di soluzione di candeggina e siringa sterile 10 microlitri sulla superficie di lavoro. Collocare la provetta con la AAV in un contenitore con ghiaccio tritato durante il set up. </li><li> Collocare la provetta con il virus in una morsa da banco standard. Caricare una siringa da 10 microlitri con almeno 4 ml di AAV. Fare attenzione a non piegare la punta della siringa contro il fondo della provetta durante il caricamento. Assicurarsi che non ci siano bolle d&#39;aria nei 4 ml di soluzione di AAV nella siringa. </li><li> Smaltire il tubo virus vuoto nel bicchiere contenente il 10% di candeggina. Conservare parti non utilizzate del virus, come specificato dal fornitore. </li><li> Aggiungere ulteriore 10% di candeggina al contenitore dei rifiuti, e lasciare i rifiuti a riposare per 30 minuti prima di smaltire i rifiuti liquidi decontaminato. </li><li> Smaltire tutti i dispositivi di protezione e rifiuti di plastica in un contenitore di rischio biologico, come indicato dalle linee guida istituzionali. Decontaminate qualsiasi apparecchiatura o superfici che è venuto in contatto con il virus utilizzando 10% di candeggina. </li></ol> 2. Chirurgia <ol><li> Preparare la zona chirurgica posizionando carta assorbente panchina sotto l&#39;apparato stereotassico e su uno spazio adiacente designato come area di gestione dei virus dedicata. <ol><li> Posizionare un contenitore per rifiuti candeggiante 10% nella zona di gestione dei virus dedicata prossimità dell&#39;apparecchiatura chirurgica. </li></ol></li><li> Indurre un livello costante di anestesia e preparare il ratto per un intervento chirurgico. <ol><li> Posizionare il ratto in una camera di induzione che contiene una miscela di gas isoflurano (nell&#39;intervallo da 1 a 3%) e l&#39;ossigeno (100% a circa 1 L / min) fino ad ottenere una perdita di coscienza e la mancanza di movimento intenzionale lordo. Mantenere l&#39;anestesia isoflurano durante tutta la procedura chirurgica. </li><li> Dopo 6 anestesia profonda è raggiunto, radere il ratto di tra gli occhi per un po &#39;dietro le orecchie. </li><li> Posizionare il topo nuovamente nella camera di induzione per unulteriore 1-3 min. </li><li> Assicurarsi che il sistema di anestesia isoflurano è collegato al naso cono della chirurgia stereotassica. Aprire il rubinetto sul tubo isoflurano per iniziare il flusso di isoflurano al stereotax. Mantenere la isoflurano e ossigeno ai livelli sopra indicati. </li><li> Posizionare il topo in un apparato stereotassico assicurando bocca sulla barra morso e fissare le barre orecchio. </li><li> Applicare occhio del lubrificante per gli occhi e betadine al sito chirurgico prima di incisione. </li></ol></li><li> Fare un 2,4 centimetri linea mediana incisione della pelle sulla superficie dorsale del cranio di partenza di circa due millimetri caudali per gli occhi. Ritrarre la pelle per esporre il cranio. Periodicamente instillare sterile allo 0,9% soluzione salina sterile ai margini del sito chirurgico per impedire tessuti da essiccazione. </li><li> Tessuto membranoso Cancellare dal cranio fino bregma e lambda sono chiaramente visibili. </li><li> Assicurarsi che il cranio è di livello misurando le coordinate dorso-ventrale abregma e al lambda. Regolare il dispositivo stereotassico di conseguenza fino a coordinate dorso-ventrale a bregma e lambda differiscono di non più di 0,04 mm. </li><li> A questo punto, ridurre il gas isoflurano tra 2 e 2,5%. </li><li> Riportare il trapano per bregma, riazzerare le coordinate e quindi spostare il trapano per la desiderata medio-laterale e antero-posteriore coordinate. </li><li> Praticare un foro nella parte coordinata con una punta 0,9 millimetri in quanto produce un foro adeguato per dimensioni una siringa per infusione 28 G. </li><li> Impostare la pompa di infusione per fornire virus ad una velocità di 0,2 ml / min. Inserire la siringa nel braccio infusione del dispositivo stereotassico e abbassare siringa nel desiderato coordinate. Somministrare la quantità desiderata di virus (gamma 0,1-0,8 ml). Ad esempio, consegnare 0,8 ml di AAV oltre 4 min. Nota: condurre studi pilota per determinare il volume di infusione ideale e la diffusione tipico del virus in ogni regione di interesse. <ol><li> Dopo la consegna di virus è complete lasciare la siringa in posizione per 10 minuti per evitare il riflusso nel tratto ago. Lentamente sollevare la siringa ad una velocità di circa 5 mm / min. Ripetere l&#39;operazione fino a quando tutte le coordinate sono stati infusi con AAV. </li></ol></li><li> Chiudere la ferita con punti chirurgici e rivestire la ferita con attualità pomata antibiotica. </li><li> Seguire le linee guida istituzionali per la gestione del dolore post-operatorio. </li><li> Posizionare il ratto in una gabbia con biancheria da letto, un coperchio e segnaletica adeguata e restituire il ratto alla stabulario. <ol><li> Se si lavora sotto BSL-2 precauzioni, raccogliere la biancheria per il periodo di tempo (in genere 48-72 ore) specificata da linee guida istituzionali. Mettere biancheria da letto in un contenitore per rifiuti biologici. </li><li> Smaltire tutti i materiali AAV-contaminate, come specificato dalle linee guida per la loro smaltimento sicuro. </li></ol></li></ol> 3. Apparecchiatura comportamentale Nota: L&#39;apparato sensoriale precondizionamento consiste di un condizionamento operante cham di serieber (12 &quot;L x 9.5&quot; W x 11.5 &quot;H) con un pavimento griglia in acciaio inox, 2 pareti laterali in plexiglass e 2 pareti metalliche. <ol><li> Montare una luce 2.8 W su una delle pareti di alluminio per servire come la luce casa e come stimolo visivo quando fé 2 Hz. Montare un altoparlante sulla camera di fornire gli stimoli uditivi (10 sec, 1500 Hz, 78 dB tono puro e un dB di rumore bianco 10 sec 78). <ol><li> Utilizzare una tramoggia alimentare di offrire 45 pellet cibo mg nella tazza cibo. All&#39;interno della coppa cibo, fotocellule a raggi infrarossi rilevano il tempo totale trascorso in coppa cibo prima, durante e dopo le presentazioni degli stimoli e ricompense alimentari. </li><li> Casa le camere in armadi di attenuazione del suono (22 &quot;L x 22&quot; x 16 &quot;D) attrezzati con ventilatori (~ 68 dB). </li><li> Utilizzare un computer PC con software Med Associates per il controllo della camera di operante e acquisire i dati. Durante le sessioni di condizionamento, raccogliere i dati sul tempo totale speso con la testa nella tazza cibo durante Presentazione dello stimolo luminoso (5 sec epoca) e durante la presentazione del premio cibo (5 sec epoca). Durante la sessione di test, raccogliere i dati sul tempo totale trascorso in coppa cibo in risposta alla presentazione di stimoli uditivi (10 sec epoca inizio quando gli stimoli uditivi sono terminati). </li></ol></li></ol> 4. Panoramica del Sensory precondizionamento Paradigm <ol><li> Dopo il recupero da un intervento chirurgico, a poco a poco cibo limitare i ratti al 85% del loro peso corporeo alimentazione gratuito. Consultare il personale veterinario per un adeguato paradigma restrizione alimentare. Nota: Il 3-fase di precondizionamento sensoriale paradigma è illustrato in figura 2. </li><li> Precondizionamento Sessions (Fase 1; giornalieri sessioni di formazione 64 min condotto su 4 giorni consecutivi): <ol><li> Ratti presenti con 12 studi mescolati che consistono di consegna di stimoli uditivi e visivi. Includere gli intervalli tra le prove che media 4,5 minuti (range 4,0-5,0 min) dopo ogni unpresentazione uditory. </li><li> Il 6 delle prove, presenti un tono (stimolo condizionato) per 10 sec, seguito immediatamente da una presentazione 5 secondi della luce stimoli lampeggiante. </li><li> Sulle altre 6 prove, presenterà il rumore bianco (stimolo spaiato) solo per 10 secondi. </li></ol></li><li> Sessioni di condizionamento (Fase 2; giornaliera allenamenti 64 min condotti in 5 giorni consecutivi): <ol><li> Ratti presenti con 8 prove che consistono di consegna dello stimolo visivo (la luce lampeggiante di stimolo) per 5 sec, immediatamente seguita da consegna di due palline di cibo 45 mg. Includere gli intervalli tra le prove che media 7 minuti (range 6,0-8,0 min) dopo ogni prova. Di tanto in tanto i ratti richiedono più di 5 sessioni di condizionamento per imparare l&#39;associazione cibi leggeri. </li></ol></li><li> Test di sessione (fase 3, una singola sessione 78 min): <ol><li> Presentare i ratti con 12 studi mescolati che consistono di consegna dei soli stimoli uditivi. Includere gli intervalli tra le prove che avecollera 4,5 minuti (range 4,0-5,0 min) dopo ogni presentazione uditiva. </li><li> Il 6 delle prove, presentare lo stimolo tono (lo stimolo condizionato) solo per 10 secondi. </li><li> Sulle altre 6 prove, presenterà il rumore bianco (lo stimolo spaiato) solo per 10 secondi. </li></ol></li><li> Controbilanciare gli stimoli completando lo studio con un secondo gruppo di ratti che ricevono il rumore bianco come stimolo precondizionato e il tono come stimolo spaiato. </li></ol> 5. farmacologica e comportamentale Procedura <ol><li> Accendere all&#39;apparato comportamentale e caricare il codice Med-PC per la sessione del comportamento appropriato. Wire e programmare l&#39;apparato comportamentale tale che i ventilatori che sono montati sul armadi suono attenuando accende quando l&#39;alimentazione è accesa. </li><li> Per preparare una soluzione 1 mg / ml di clozapina N-ossido (CNO), pesare 5,0 mg di CNO in un tubo da 15 ml e aggiungere 5 ml di acqua sterile o 5 ml di sterile 0,9% saline. Vortex fino a quando la soluzione è limpida. <ol><li> Se CNO non si dissolve in soluzione o se soluzioni più concentrate di CNO si desidera aggiungere un agente solubilizzante, come DMSO 23. In particolare, per preparare una soluzione di 1 mg / ml di CNO con 0,5% DMSO, peso 5,0 mg di CNO e aggiungere 25 ml di DMSO in una provetta da 15 ml. Flick delicatamente garantendo che il contenuto rimanga alla base del tubo. Quando la soluzione diventa chiara, aggiungere 5 ml di acqua sterile o 5 ml di soluzione sterile salina allo 0,9%. Ulteriori istruzioni per la preparazione di soluzioni di CNO sono disponibili nella pagina di risorsa DREADD wiki 25. </li><li> Preparare una nuova soluzione CNO ogni giorno che viene somministrato. </li></ol></li><li> Iniettare il CNO via intraperitoneale alla dose di 1 mg / kg a circa 30 minuti prima del test comportamentale. Ad esempio, iniettare un 200 g ratto con 0,2 ml di / soluzione CNO ml 1 mg. Il corso della dose e il tempo di somministrazione CNO sono stati selezionati sulla base delle relazioni precedentemente pubblicati 2,12.<ol><li> Iniettare CNO 30 minuti prima di ogni sessione di precondizionamento (fase 1; totale di 4 giorni di iniezioni), ma di amministrare il veicolo prima di tutte le sessioni del comportamento successive. </li></ol></li><li> Dopo 30 minuti, mettere i topi nelle camere di test comportamentali e avviare il codice di calcolo per la sessione del comportamento appropriato. </li><li> Al completamento del compito comportamentale, rimuovere immediatamente i ratti dalle camere e restituire i ratti alla colonia animale. </li></ol> 6. Analisi dei dati comportamentali Nota: La variabile dipendente per tutte le sessioni comportamentali è la quantità di tempo che la testa del ratto è all&#39;interno della tazza dell&#39;alimento rilevate tramite l&#39;interruzione delle fotocellule infrarossi nella tazza dell&#39;alimento. I dati (in secondi) sono raccolti e registrati dal software del computer. <ol><li> Non eseguire le analisi sui dati generati durante la fase di precondizionamento. </li><li> Per le sessioni di condizionamento: analizzare un reciproche rattibilità per imparare l&#39;associazione cibi leggeri confrontando comportamento tazza cibo durante la presentazione dello stimolo visivo attraverso le 5 sedute comportamentali. In particolare, il calcolo del tempo medio trascorso in coppa cibo durante la luce all&#39;epoca 5 sec per ciascuna delle 8 prove / sessione (cioè una media di 8 studi clinici che sono ogni 5 secondi di durata / rat). Confronta Controllo media e valori sperimentali per ognuna delle 5 sessioni giornaliere (vedi Figura 3A). <ol><li> Analizzare la motivazione dei ratti per procurarsi il cibo ricompensa confrontando comportamento tazza di cibo durante la consegna del premio cibo (5 sec epoca) attraverso le 5 sedute comportamentali che utilizzano lo stesso calcolo, come specificato per la luce all&#39;epoca 5 secondi sopra. Questi valori saranno più elevati di quelli acquisiti durante la presentazione dello stimolo visivo (vedere Figura 3B). </li></ol></li><li> Per la sessione di test: calcola un rapporto di discriminazione che descrive il comportamento coppa cibo dei ratti in risposta alle presentations di ogni stimolo uditivo. <ol><li> In particolare, per ogni ratto, dividere il tempo medio di permanenza nella tazza cibo dopo ciascuna di 6 presentazioni dello stimolo sensoriale precondizionato (cioè, il tono) per la somma del tempo medio di permanenza nella tazza cibo dopo ciascuna di 6 presentazioni della sensoriali stimolo precondizionato (cioè, lo stimolo tono) più la media del tempo totale trascorso nella tazza dell&#39;alimento segue ciascuna di 6 presentazioni dello stimolo spaiato (cioè, lo stimolo rumore bianco). Ogni epoca è di 10 secondi di durata. Nota: Un punteggio discriminazione di 0,5 o superiore dimostra che i topi hanno imparato le associazioni insite nel paradigma precondizionamento sensoriale. </li></ol></li></ol> 7. Verifica di AAV posizionamento e di espressione <ol><li> Anestetizzare e profumato ratti transcardiaca con paraformaldeide al 4%. Grazie all&#39;uso di etichette fluorescenti, non superare un tempo di post-fissazione 2 hr a minperdita sarà ottimizzata di antigenicità e per preservare il segnale fluorescente. </li><li> Disidratare cervelli perfusi trasferendoli in un vaso cerebrale contenente 30 ml di una soluzione di saccarosio al 20% in tampone fosfato isotonico (1x) per un minimo di 2 giorni o fino al cervello scende sul fondo del vaso cerebrale. </li><li> Utilizzare un microtomo scorrevole congelamento fare sezioni di cervello coronale (20-40 micron) durante l&#39;intera estensione rostrocaudale della regione di interesse. </li><li> Effettuare immunoistochimica diretto contro il recettore etichettato o la proteina reporter per accertare la posizione e l&#39;espressione del recettore progettista e / o giornalista 12. Un protocollo di colorazione immunoistochimica sono presenti sulla pagina di risorsa DREADD wiki 25. </li><li> Montare sezioni su vetrini SuperFrost-plus e coprioggetto utilizzando 100-200 ml di un mezzo di montaggio acquoso. </li><li> Eseguire microscopia a fluorescenza su tessuto cerebrale per verificare il posizionamento AAV e proteine ​​espressione 12,24.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo descrive come applicare un approccio farmacogenetica (DREADD) per studiare come una regione del cervello specifica contribuisce ad un più fasi compito di apprendimento complesso. Con la possibilità di disattivare temporaneamente e in remoto attività neurale in regioni cerebrali distinte attraverso fasi di apprendimento, questa combinazione di approcci fornisce una piattaforma per indagare su una vasta gamma di comportamenti, tra cui forme più sfumate o mascherate di apprendimento. Nell&#39;esempio desc...

Una sfida emozionante nel campo delle neuroscienze del comportamento è quello di determinare i substrati neurali di comportamenti complessi. Un certo numero di tecniche come lesioni permanenti, inattivazione cervello temporaneo tramite impianti cannule e optogenetics sono stati impiegati per identificare i contributi di regioni cerebrali discreti per sottocomponenti di comportamenti complessi. Mentre questi approcci informano la nostra comprensione della specificità regionale durante l&#39;apprendimento, ogni tecnica non è senza limiti. In particolare, le lesioni permanenti sono tipicamente condotte prima della prova comportamentale, quindi sono presenti in tutta la durata del paradigma loro effetti. Studi Incannulazione che comportano la presentazione di un inattivatore neurali a breve termine (ad esempio, la tetrodotossina) in grado di produrre danni rilevanti al tessuto cerebrale e possono indurre lo stress in soggetti appena prima del test comportamentali. Inoltre, inattivazione tramite cannulazione è limitata alla regione di tessuto che circonda lapunta delle cannule. Infine, mentre optogenetics offre una gamma di flessibilità per il controllo temporale dell&#39;attività in regioni specifiche del cervello, è costo proibitivo e tecnicamente esigenti. Queste limitazioni possono essere superate con un approccio farmacogenetica (Designer-recettori-Esclusivamente-Activated-by-Designer-Farmaci, DREADDs) 1,2. È importante sottolineare che, mentre il concetto di farmacogenetica è sofisticata, l&#39;esecuzione della tecnica è semplice. Simili metodi chirurgici stereotassica tradizionali che prevedono l&#39;infusione di tossina (ad esempio, NMDA, ibotenico) in regioni cerebrali discrete, questa tecnica comporta infondendo un virus adeno-associato (AAV) che contiene un frammento di DNA per un recettore G-proteina inibitoria modificato accoppiato (hM4Di; il recettore designer) nella regione di interesse di roditori di laboratorio standard (vedi Figura 1). Il vettore virale contiene anche un reporter fluorescente (mcitrine). Una volta costituita inalle cellule, il recettore designer (e proteina reporter) sono massimamente espressi ~ 3 settimane post-infusione e possono essere selettivamente attivati ​​per 2-5 ore dalla somministrazione sistemica del farmaco progettista altrimenti biologicamente inerte, clozapina-N-ossido (CNO) 1 , 3. Poiché lo sperimentatore è dotato di preciso, ma a distanza di controllo temporale su attività neurale in specifiche regioni del cervello, farmacogenetica abbina particolarmente bene con paradigmi comportamentali che si svolgono in più fasi. In questo esempio, il contributo della corteccia retrosplenial (RSC) a stimolo-stimolo di apprendimento viene confrontato con il suo ruolo nell&#39;apprendimento pavloviano, ma questa combinazione di approcci ben si adatta a qualsiasi numero di domande che cercano di identificare come specifiche regioni del cervello contribuiscono a comportamento complesso. Inoltre, pur non descritto nel presente protocollo, approcci virali e transgeniche possono essere utilizzati per ottenere specifici tipi cellulari espressione DREADD 2. Come hos inerente a paradigmi comportamentali che coinvolgono farmacologici e / o di altri tipi di manipolazioni sperimentali, un attento esame del disegno sperimentale e la successiva analisi quantitativa è necessaria quando si impiega il metodo DREADD. Sperimentatori nuovi all&#39;approccio DREADD si riferiscono a una rassegna completa delle attuali tecnologie DREADD 2. Ogni giorno, gli organismi conoscere nuovi stimoli e gli eventi e le loro relazioni gli uni agli altri. Anche in un ambiente familiare, come la casa, uno è rapido per rilevare alterazioni nei rapporti tra stimoli perché questi cambiamenti possono essere predittivi di eventi significativi. Tale stimolo-stimolo (ad esempio, relazionale) apprendimento implica la congiunzione di stimoli multipli ed è stato tradizionalmente associato con l&#39;ippocampo, che risiede in posizione centrale all&#39;interno del lobo temporale mediale 4. Tuttavia, l&#39;ippocampo non esiste nè agire isolatamente; regioni corticali sia all&#39;interno e fuorilato del lobo temporale mediale fornire informazioni critiche sensoriali alla formazione dell&#39;ippocampo 5-7. Tradizionali studi lesioni permanenti forniscono prove del coinvolgimento di un certo numero di regioni corticali (ad esempio, le cortecce retrosplenial, postrhinal e entorinale) nell&#39;apprendimento ippocampo-dipendente, ma sono limitate nella loro capacità di discernere il ruolo di una regione particolare durante le fasi discrete di apprendimento 8-10. Il presente protocollo verifica l&#39;ipotesi che la RSC è necessaria per l&#39;apprendimento stimolo-stimolo silenziando RSC durante una singola fase di un 3-fase di precondizionamento sensoriale paradigma 11,12. Brevemente, ratti ricevono infusioni di un AAV che contiene il recettore progettista e ~ 3 settimane dopo sono somministrato il farmaco designer (CNO) 30 min prima dell&#39;inizio della prova comportamentale. Nel presente protocollo, i topi sperimentali ricevono CNO durante la prima fase di test (quando stimolo-stimolo learning si verifica) e ricevono veicolo durante i prossimi 2 fasi di test. Per controllare gli effetti involontari di CNO sul comportamento, infondere ratti con il recettore designer (hM4Di) e iniettare con veicolo al posto del CNO. Per tenere conto di effetti generali di infusione virale e l&#39;espressione del recettore, infondere un virus di controllo che non contiene il recettore designer e amministrare CNO. Un certo numero di differenti sierotipi di AAV sono usati per fornire materiale genetico. Le attuali linee guida NIH per la ricerca coinvolgimento ricombinante o molecole sintetiche sostiene che AAV (tutti i sierotipi) e costrutti AAV ricombinanti o sintetici, in cui il transgene non codifica sia un prodotto del gene potenzialmente cancerogeno o una molecola di tossina e sono prodotti in assenza di un virus helper, richiedono BSL-1 precauzioni (Gruppo Appendice B-1. rischio 1 (RG1) agenti) 13. Un numero di recensioni relative alla struttura AAV, l&#39;utilità e la sicurezza sono disponibili 14,15. In particolare, anche se, A causa delle preoccupazioni relative a possibili riproduttivi 16,17 e meccanismi potenziali cancerogeni 18-20 nei roditori, alcuni istituti richiedono l&#39;uso di BSL-2 precauzioni quando si lavora con AAV. Verificare il BSL appropriata prima dell&#39;uso attraverso la consultazione con i comitati di sorveglianza a singole istituzioni dove la ricerca sarà condotta, i Centers for Disease Control e le Linee Guida NIH per la ricerca che coinvolge DNA ricombinante Molecole 13 quando si utilizza vettori virali per la manipolazione genetica negli Stati Uniti. Protezione personale, formazione investigatore, vettore di contenimento, di decontaminazione, di smaltimento dei materiali decontaminati, e animali post-iniezione esigenze abitative sono specificati da queste linee guida. Inoltre, consultare e seguire appropriate Animal Care istituzionali e utilizzare le linee guida del comitato o orientamento equivalente di Vigilanza istituzionali per garantire la manipolazione, somministrazione e lo smaltimento di AAV.

<table><tbody><tr><td>Maschio, ratti Long Evans, 55-60 giorni di età</td><td>Hilltop Lab Animals Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine</td><td>Virus Vector Core</td><td></td><td>Attenzione: questo è un composto BSL-1</td></tr><tr><td>rAAV8/hSyn-GFP</td><td>Virus Vector Core</td><td></td><td>Attenzione: questo è un composto BSL-1</td></tr><tr><td>clozapina-N-ossido</td><td>R& D Systems</td><td>4936-10</td><td>Coperchio</td></tr> per <tr><td>gabbia per ratti (policarbonato)</td><td>Design alternativo&nbsp;</td><td>FT 8XL-PC</td><td>Utilizzato per coprire le gabbie degli animali 48-72 ore dopo l'infusione</td></tr> Carta <tr><td>da filtro (ricambio)</td><td>Design alternativo</td><td>FP-R-1018XAD</td><td>Carta da filtro che si abbina ai coperchi delle gabbie</td></tr><tr><td>Morsa da tavolo</td><td>JETS</td><td>2201-265</td><td>Per contenere provette per microcentrifuga contenenti AAV nel cofano</td></tr><tr><td>Sacchetti per la spazzatura a rischio biologico</td><td>Graffette</td><td>113444</td><td>Fodere per rischi biologici Medline Pattumiera</td></tr><tr><td>a rischio biologico</td><td></td><td></td> Amazon.com <td>United Solutions 34 galloni rettangolare con ruote</td></tr><tr><td>maniglia Isoflurane, 100 ml</td><td>Patterson Veterinary Supply Inc.</td><td>07-890-8540</td><td>Anestetico</td></tr><tr><td>Doppio stereotassico per piccoli animali con console di lettura del display digitale</td><td>David Kopf</td><td>Modello 942</td><td>Attrezzature chirurgiche</td></tr><tr><td>Barre auricolari non rotte, set di 2 (ratto)</td><td>David Kopf</td><td>Modello 955</td><td>Attrezzatura chirurgica</td></tr><tr><td>Maschera per anestesia (ratto)</td><td>David Kopf</td><td>Modello 906</td><td>Attrezzatura chirurgica</td></tr><tr><td>Il trapano stereotassico ad alta velocità include il controller del motore da tavolo, il pedale, il manipolo, il supporto del manipolo stereotassico</td><td>David Kopf</td><td>Modello 1474</td><td>Attrezzature chirurgiche</td></tr><tr><td>Frese per microdrill, 0,9 mm</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>19007-09</td><td>Fornitura chirurgica</td></tr><tr><td>Pompa a siringa automatizzata con controller micro4</td><td>David Kopf</td><td>Modello UMP3-1</td><td>Attrezzatura chirurgica</td></tr><tr><td>Lama in ceramica staccabile per animali kit clipper</td><td>Ahdis</td><td>21420</td><td>Fornitura chirurgica</td></tr><tr><td>Betadine detergente per la pelle</td><td>Perdue Products L.P</td><td>67618-149-04</td><td>Fornitura chirurgica</td></tr><tr><td>Triplo unguento antiobiotico Medline</td><td>Supply</td><td>53329-087-01</td><td>Fornitura chirurgica</td></tr><tr><td>Puralube unguento</td><td>veterinario Solo fornitura veterinaria</td><td>17033-211-38</td><td>Fornitura chirurgica</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td> <td>Dino-liteAD7013MTL</td><td>Un'alternativa al tradizionale cannocchiale di dissezione</td></tr><tr><td>Supporto rigido da tavolo Dino-lite</td><td>Microscopio</td><td>MS36B</td><td>Attrezzatura chirurgica</td></tr><tr><td>28 G 10 &mu; l siringa</td><td>Hamilton</td><td>80308-701SN</td><td>Attrezzatura chirurgica</td></tr><tr><td>Cabina acustica extra alta in MDF</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-018MD</td><td>22' L x 22" A x 16" P</td></tr><tr><td>Camera di prova modulare extra alta</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-007</td><td>Attrezzatura comportamentale</td></tr><tr><td>Pavimento a griglia in acciaio inossidabile</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-005</td><td>Attrezzatura</td></tr> <tr><td>comportamentaleLuce domestica</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-215M</td><td>Utilizzato come luce domestica e luce di stimolo</td></tr><tr><td>Distributore di pellet modulare</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-203M-45</td><td>Attrezzatura comportamentale</td></tr><tr><td>Recipiente per pellet, tipo a tazza</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-200R1M</td><td>Apparecchiatura comportamentale</td></tr><tr><td>Rilevatore di ingresso nella testa per ratto</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-254-CB</td><td>Attrezzatura comportamentale</td></tr><tr><td>Pellet alimentari di precisione senza polvere, 45 mg</td><td>Bio-Serv</td><td>F0165</td><td>Alimentazione comportamentale</td></tr><tr><td>Altoparlante a gabbia per camera di ratto</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-224AM</td><td>Apparecchiature comportamentali</td></tr><tr><td>Generatore audio programmabile</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ANL-926</td><td>Apparecchiature comportamentali</td></tr><tr><td>Smart ctrl 8 ingressi/16 uscite</td><td>Med Associates, Inc</td><td>DIG-716P2</td><td>Apparecchiature comportamentali</td></tr><tr><td>Armadio da tavolo di grandi dimensioni e alimentatore</td><td>Med Associates, Inc</td><td>SG-6510D</td><td>Apparecchiature comportamentali</td></tr><tr><td>Pacchetto di interfaccia PCI</td><td>Med Associates, Inc</td><td>DIG-700P2-R2</td><td>Apparecchiature comportamentali</td></tr><tr><td>MED Intel core computer pkg con monitor X Pro da 19"</td><td>Med Associates, Inc</td><td>COM-103V</td><td>Apparecchiature comportamentali</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (granulare), 1 kg</td><td>Microsopia elettronica Scienze</td><td>19210</td><td>Pericolo: cancerogeno, pesare nel cappuccio</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di coniglio (HA-Tag)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>3724S</td><td>Reagente istologico</td></tr><tr><td>XP Anticorpo monoclonale di coniglio (GFP)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>2956S</td><td>Reagente istologico</td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4412S</td><td>Forniture istologiche</td></tr><tr><td>Superfrost plus vetrini</td><td>VWR international</td><td>483111-703</td><td>Forniture per istologia</td></tr></tbody></table>

un metodo per remotely silencing neural activity in roditore durante fasi discreti di apprendimento

A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

Questo protocollo descrive come disattivare temporaneamente e in remoto l&#39;attività neuronale in regioni cerebrali discrete mentre gli animali sono impegnati in compiti di apprendimento e memoria. L&#39;approccio combina farmacogenetica (Designer-recettori-Esclusivamente-Activated-by-Designer-droga) con un paradigma comportamentale (precondizionamento sensoriale) che è stato progettato per distinguere tra le diverse forme di apprendimento. In particolare, la consegna virale-mediata è usato per esprimere un recettore G-proteina inibitrice geneticamente modificata accoppiata (Progettazione Receptor) in una regione del cervello discreta nei roditori. Tre settimane più tardi, quando i livelli di espressione del recettore del progettista sono alti, un agente farmacologico (Designer Drug) viene somministrato per via sistemica 30 minuti prima di una sessione specifica del comportamento. Il farmaco ha affinità per il recettore progettista e pertanto provoca l&#39;inibizione di neuroni che esprimono il recettore progettista, ma è altrimenti biologicamente inerte. La regione del cervello rimane a tacere per 2-5 ore (Depending dalla dose e via di somministrazione). Al termine del paradigma comportamentale, tessuto cerebrale viene valutata per il corretto posizionamento e l&#39;espressione del recettore. Questo approccio è particolarmente utile per determinare il contributo di regioni cerebrali singoli componenti specifici di comportamento e può essere utilizzato in qualsiasi numero di paradigmi comportamentali.

Risultati comportamentali Al termine dell&#39;esperimento, l&#39;efficacia della inattivazione temporanea regione specifica deve essere valutata quantitativamente e qualitativamente. Il presente esempio riguarda un paradigma 3 fasi comportamentale (precondizionamento sensoriale), in cui è stato somministrato CNO attenuare attività neurale nel RSC durante le sessioni di precondizionamento per verificare l&#39;ipotesi che la RSC è necessario per la formazione di associazioni tra stimoli neutro <s...

Questo protocollo descrive come silenziare temporaneamente e a distanza l'attività neuronale in regioni cerebrali discrete mentre i ratti sono impegnati in compiti di apprendimento e memoria. L'approccio combina la farmacogenetica (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) con un paradigma comportamentale (precondizionamento sensoriale) progettato per distinguere tra diverse componenti dell'apprendimento.

Un metodo per Remotely Silencing Neural Activity in Roditore Durante Fasi discreti di apprendimento

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and ...

Lo scopo di questa procedura è quello di silenziare temporaneamente e in modo remoto l'attività neuronale in regioni cerebrali discrete mentre gli animali sono impegnati in compiti di apprendimento e memoria. Questo viene ottenuto innanzitutto caricando un a a V che contiene un recettore sintetico e un marcatore in una siringa per infusione. Il secondo passaggio consiste nell'infondere un a a V nella regione di interesse nel cervello del ratto.Successivamente, il farmaco progettato biologicamente inerte clozapina e ossido viene preparato e iniettato per via sistemica nel ratto. Il passaggio finale consiste nell'eseguire un test comportamentale utilizzando un paradigma di condizionamento sensoriale preliminare. Infine, viene utilizzata la microscopia a immunofluorescenza sul tessuto cerebrale del ratto per verificare il posizionamento del recettore progettato.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze comportamentali, tra cui ma non limitatamente alla regolazione della motivazione, dell'attenzione e dell'apprendimento e della memoria. Assicurarsi che tutte le precauzioni istituzionali per la manipolazione dei virus adeno-associati siano seguite durante l'intero procedimento; il virus utilizzato in questo video è classificato come un composto di livello di sicurezza biologica uno. Preparare una soluzione di candeggina al 10%. Per la decontaminazione dei rifiuti di a v, predisporre un contenitore contenente soluzione di candeggina e una siringa sterile da 10 microlitri.Nell'area di lavoro, posizionare il tubo da microcentrifuga contenente un'aliquote di a a V in una morsa da banco standard. Caricare una siringa da 10 microlitri con almeno quattro microlitri di a A v. Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria nella soluzione di quattro microlitri di a a v. Dopo aver utilizzato la siringa, smaltire il tubo vuoto del virus nel becher contenente candeggina al 10%.Aggiungere ulteriore candeggiante al 10% al contenitore dei rifiuti e lasciare agire il materiale per 30 minuti prima di smaltire il liquido disinfettato secondo le indicazioni stabilite dall'istituto. Preparare l'area chirurgica posizionando carta assorbente sotto l'apparato stereotassico e in una zona adiacente designata come area dedicata alla manipolazione del virus. Dopo aver indotto l'anestesia con isoflurano al 3% in ossigeno a un flusso di un litro al minuto.Rasare il pelo dalla zona tra gli occhi leggermente dietro le orecchie. Dopo la rasatura, riportare il ratto nella camera di induzione per tre minuti con il ratto fissato in un apparato stereotassico. Coprire gli occhi con un unguento oftalmico e preparare il sito dell'incisione pulendolo con Betadine.Dopo aver praticato un'incisione mediana di 2,4 centimetri del tessuto cutaneo sovrastante il cranio, a partire da circa due millimetri in senso caudale rispetto agli occhi, ritrarre la cute per esporre il cranio e quindi rimuovere il tessuto membranoso dal cranio finché bgma e lambda non risultino chiaramente visibili. Dopo aver verificato che il cranio sia piano, posizionare il trapano su bgma, azzerare le coordinate e quindi spostare il trapano alle coordinate desiderate in senso mediale, laterale e antero-posteriore. Praticare un foro utilizzando una punta da trapano da 0,9, 0,7 o 0,5 millimetri.Impostare la pompa di infusione per somministrare il virus a un ritmo di 0,2 microlitri al minuto. Inserire la siringa nel braccio di infusione del dispositivo stereotassico e abbassare la siringa fino alla coordinata desiderata. Utilizzare la pompa per somministrare la quantità desiderata di virus dopo il completamento della somministrazione dei virus.Lasciare la siringa in posizione per 10 minuti per prevenire il reflusso nell'ago; sollevare lentamente la siringa a una velocità di circa cinque millimetri al minuto. Successivamente, passare alla coordinata successiva e ripetere la procedura fino a quando tutte le coordinate sono state infuse con a v. Dopo la chiusura della ferita e la somministrazione di analgesia postoperatoria secondo il protocollo approvato, posizionare il ratto in una gabbia pulita con lettiera, un coperchio e la segnaletica appropriata.Quando il ratto si è completamente ripreso dall'anestesia, riportarlo nella stanza di alloggio. Attendere almeno tre settimane prima di iniziare i test comportamentali, per garantire un'espressione adeguata del recettore progettato. Questa figura mostra le tre fasi del paradigma di precondizionamento sensoriale: la fase di precondizionamento, la fase di condizionamento e la fase di test.Il farmaco progettato, clozapina-N-ossido o CNO, viene utilizzato per inibire l'attività neuronale attivando il recettore progettato. Il CNO può essere iniettato prima di qualsiasi fase della sperimentazione. In questo caso, il CNO viene iniettato 30 minuti prima di ciascuna sessione di precondizionamento. Dopo aver preparato una soluzione fresca di un milligrammo per millilitro di clozapina-N-ossido, seguendo le istruzioni riportate nella parte scritta del protocollo, iniettare il CNO per via intraperitoneale a una dose di un milligrammo per chilogrammo, 30 minuti prima del test comportamentale.Avviare il codice informatico per la sessione comportamentale appropriata. Dopo che sono trascorsi 30 minuti, posizionare i ratti nelle camere di prova e iniziare la prima delle 4 sessioni di precondizionamento della durata di 64 minuti presentando ai ratti 12 prove intercalate che consistono nella somministrazione di stimoli uditivi e visivi. In sei delle prove, presentare un tono, lo stimolo precondizionante, per 10 secondi, seguito immediatamente da una presentazione di cinque secondi dello stimolo luminoso lampeggiante nelle altre sei prove.Presentare il rumore bianco, lo stimolo non ancora presentato, da solo per 10 secondi. Al termine della fase di precondizionamento, iniziare le sessioni di condizionamento, che verranno effettuate per cinque giorni consecutivi. Sottoporre i ratti a otto prove costituite dalla presentazione dello stimolo visivo, la luce lampeggiante per cinque secondi, seguita immediatamente dalla somministrazione di 2 pellet alimentari da 45 milligrammi.In questo momento includere intervalli inter-trial che superano i sette minuti una volta completate le sessioni di condizionamento. Eseguire l'unica sessione di prova della durata di 78 minuti presentando ai ratti 12 prove intercalate, costituite dalla presentazione dello stimolo uditivo in assenza di altri stimoli. In sei delle prove.Presentare lo stimolo tonale, lo stimolo di precondizionamento da solo per 10 secondi. Negli altri sei tentativi, presentare il rumore bianco, lo stimolo non accoppiato da solo per 10 secondi. Al termine del compito comportamentale, rimuovere immediatamente i ratti dalle camere e riportarli nella colonia animale.Analizzare i dati della fase di condizionamento e della fase di test seguendo le istruzioni dettagliate nella parte scritta del protocollo. Dopo aver eseguito l'immunohistochimica diretta contro il marcatore etichettato o la proteina reporter, esaminare le sezioni colorate mediante microscopia per accertare la localizzazione e l'espressione del recettore progettato e/o del reporter. Come previsto, sia i ratti di controllo che quelli sperimentali hanno imparato in modo simile l'associazione pavloviana tra lo stimolo luminoso intermittente e il cibo durante le sessioni di condizionamento.Nelle sessioni, entrambi i gruppi erano motivati a ottenere una ricompensa alimentare durante la sessione di condizionamento. Al contrario, durante la sessione di test critica, i ratti sperimentali non riuscivano a discriminare tra gli stimoli uditivi precondizionati e quelli non associati, mentre i ratti di controllo mostravano un comportamento maggiore verso la coppetta del cibo in risposta alla presentazione dello stimolo precondizionato. Pertanto, solo i ratti di controllo, e non quelli sperimentali, mostrarono l'effetto di precondizionamento sensoriale.Questa immagine mostra la verifica istologica della posizione di un'infusione a.v. nella regione di interesse nel cervello del roditore dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare i contributi di specifiche regioni cerebrali e/o tipi cellulari a comportamenti complessi in vivo.

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Behavior

Comportamento

In questo rapporto, presentiamo un sistema completamente automatico ed estremamente versatile in grado di testare contemporaneamente multi-cognitive comportamenti e registrare le attività neuronali per i roditori.

Un sistema completamente automatizzato ed altamente versatile per test multi-funzioni cognitive e di registrare le attività neuronali in roditori

Posiziona un cucciolo neonatale anestetizzato su un termoforo.Disinfettare il cuoio capelluto con etanolo.Riempire una siringa con una soluzione virale contenente virus adeno-associati che trasportano il gene per un recettore inibitorio attivato da farmaci e un colorante tracciante.Allineare la punta della siringa con la testa del cucciolo e iniettare lentamente il virus nel cervello per una distribuzione uniforme.Lascia che il cucciolo si riprenda.Durante l'incubazione, le particelle virali...

Silenziamento chemiogenetico dell'attività neuronale in un topo neonatale

Fonte: Lai, J., et al. Registrazione elettrofisiologica simultanea e microiniezioni di agenti inibitori nel cervello dei roditori. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra una tecnica basata su microiniezione per la registrazione e l'inibizione neuronale simultanea nel collicolo superiore del ratto. La procedura prevede il targeting stereotassico, la perforazione del cranio e l'inserimento di un iniettore, che rilascia un neurotrasmettitore inibitorio durante la registrazione dell'attività...

Inibizione dell'attività neuronale e sua rilevazione mediante elettrofisiologia in un ratto

Viene proposto un protocollo completamente automatizzato per roditori condizionamento operante. Il protocollo si basa su un preciso controllo temporale degli eventi comportamentali per indagare in che misura influenza il controllo dell'attività sottostante neurale integrazione sensomotoria e di controllo cognitivo esperimenti.

Un completamente automatizzata Roditore condizionata Protocollo per Sensomotoria Integrazione e esperimenti di controllo cognitive

Imparare nuove associazioni stimolo-risposta coinvolge una vasta gamma di processi neurali che sono in ultima analisi riflettono nel cambiare uscita picco dei singoli neuroni. Qui si descrive un protocollo comportamentale che consenta la registrazione continua di attività singolo neurone mentre gli animali acquisiscono, spegnere, e riacquistano una risposta condizionata all'interno di una singola sessione sperimentale.

Registrazione di potenziali d&#39;azione singoli neuroni &#39;di muoversi liberamente Piccioni attraverso tre fasi di apprendimento

Qui, realizziamo una pipetta di vetro con una doppia funzione: inibizione delle strutture cerebrali profonde mediante microiniezioni di farmaci e monitoraggio in tempo reale dei loro effetti attraverso registrazioni elettrofisiologiche simultanee.

Registrazione simultanea elettrofisiologici e micro-iniezioni di agenti inibitori nel cervello del roditore

Shuttle-box apprendimento evitamento è ben consolidata in neuroscienze comportamentali. Questo protocollo descrive come navetta-box di apprendimento nei roditori può essere combinata con microstimolazione site-specific elettrica intracorticale (ICMS) e croniche simultanea nelle registrazioni vivo come strumento per studiare molteplici aspetti dell'apprendimento e della percezione.

Combinato Shuttle-Box Training con elettrofisiologiche Cortex registrazione e stimolazione come strumento per studiare percezione e apprendimento

La stimolazione del nervo vago (VNS) è emerso come uno strumento per indurre mirato plasticità sinaptica nel proencefalo di modificare una serie di comportamenti. Questo protocollo descrive come implementare VNS per facilitare il consolidamento della memoria paura dell'estinzione.

Stimolazione del nervo vago come strumento per indurre plasticità Percorsi rilevanti per l&#39;apprendimento Extinction

Presentiamo metodi per la costruzione di elettrodi per registrare simultaneamente l'attività neurale extracellulare e rilasciare più sostanze neuroattive in prossimità dei siti di registrazione nei topi svegli. Questa tecnica consente l'analisi dettagliata di input sinaptici locali putativi al neurone di interesse.

Extracellulare La registrazione di un neurone attività combinata con Microiontophoretic applicazione di sostanze neuroattivi nei topi Awake

La progettazione e l'assemblaggio di microdrive per registrazioni elettrofisiologiche in vivo di segnali cerebrali dal mouse è descritto. Allegando fasci microelettrodi a vettori guidabili robuste, queste tecniche consentono registrazioni neuronali a lungo termine e stabile. Il design leggero permette illimitato prestazioni comportamentali da parte dell'animale dopo l'impianto in auto.

Costruzione di matrici Microdrive per cronici Recordings neurali in topi Comportarsi Awake

Impara a silenziare l'attività neuronale in specifiche regioni cerebrali di roditori durante compiti di apprendimento e memoria. Questo metodo farmacogenetico consente di studiare i meccanismi neurali del comportamento.

Un metodo per Remotely Silencing Neural Activity in Roditore Durante Fasi discreti di apprendimento

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