Isolamento e propagazione di cellule tumorali circolanti da un mouse cancro modello

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e propagare le cellule tumorali circolanti dal sangue intero di un modello di tumore murino singenico con metastasi di carcinoma epatocellulare. Ciò si ottiene centrifugando prima il sangue intero raccolto dai topi e isolando il buffy coat. Successivamente, i globuli rossi nel buffy coat vengono lisati e le cellule tumorali circolanti vengono raccolte in un pellet.

Le cellule vengono quindi lavate, sospese in un terreno di coltura completo e propagate in coltura cellulare. Le cellule tumorali in rapida crescita rimangono vitali attraverso numerosi passaggi e possono essere verificate utilizzando tecniche diagnostiche molecolari standard. L'importanza dell'isolamento delle cellule tumorali circolari con la nostra tecnica è che fornisce un modello riproducibile, che può essere ottimizzato per un potenziale utilizzo in ambito clinico.

A dimostrare la procedura con me sarà Michelle Nadu, una studentessa universitaria del nostro laboratorio per iniziare il raccolto. Sangue intero da un modello di tumore Ciea Kamau con metastasi da carcinoma epatocellulare come descritto in una centrifuga verticale J separata. Il sangue intero raccolto a 1, 167 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente.

Una volta separato in strati, rimuovere con cura lo strato superiore di plasma e trasferirlo in una provetta separata da 1,5 millilitri priva di rogen per ulteriori esperimenti, come la rilevazione di acidi nucleici liberi da cellule. Quindi, trasferisci lo strato di codice Buffy in una provetta separata da 1,5 millilitri priva di ROGEN in preparazione per la lisi dei globuli rossi. Questo è necessario per rimuovere i globuli rossi residui nello strato di Buffy coat prima dell'isolamento delle cellule tumorali circolanti.

Inizia preparando una soluzione da un litro di tampone per lisi dei globuli rossi con una concentrazione finale di 155 millimolari di cloruro di ammonio e 10 millimolari di triss. Regolare il pH della soluzione a 7,5. Prendilo a circa due o quattro millilitri di aliquota dal brodo, una miscela di tampone per lisi dei globuli rossi da un litro.

Quindi aggiungere un millilitro del tampone di lisi dei globuli rossi alla provetta contenente il buffy coat raccolto. Mescolare il contenuto del tubo capovolgendolo più volte. Quindi incubare la provetta per cinque minuti a temperatura ambiente sul banco.

Quindi centrifugare il contenuto miscelato per cinque minuti. A 1, 167 volte G dopo la centrifugazione, si otterrà un pellet biancastro. Scartare il supernat rossastro lentamente e con attenzione in candeggina al 10% senza interrompere il pellet.

Dopo aver scartato il surnatante, lavare il pellet biancastro in un millilitro di PBS. Quindi pellettare nuovamente le cellule e risospenderle in un terreno di coltura completo. Vedere le cellule risospese in un piatto di coltura cellulare e incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con aria e anidride carbonica al 5%.

Cambiare il terreno di coltura cellulare ogni due o tre giorni. Dopo cinque-sette giorni, le cellule tumorali circolanti avranno aderito al piatto di coltura cellulare e avranno iniziato a proliferare. Al fine di verificare che le cellule tumorali circolanti del carcinoma epatocellulare siano state correttamente isolate.

Eseguire la PCR per un segmento specifico del gene della beta globina di topo, come descritto e convalidato da Stu. Quindi immunocolorare le cellule con un anticorpo specifico per il marcatore specifico dell'epatocita. Proteina legante l'elemento reattivo ciclico A MP tre come tre utilizzando le tecniche standard mostrate qui sono immagini rappresentative di cellule tumorali circolanti da due topi separati.

In coltura da un modello murino singenico ortotopico di carcinoma epatocellulare. Le cellule tumorali metastasi aderiscono al piatto e proliferano rapidamente. Possono essere espansi oltre i 25 passaggi e resistono a cicli di gelo e disgelo ripetuti.

Quindi, dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e propagare le cellule tumorali circolari che sono vitali, nonché di caratterizzarle sia molecolarmente che funzionalmente.