Isolamento e propagazione di cellule tumorali circolanti da un mouse cancro modello
9 ottobre 2015
È stato dimostrato che le cellule tumorali circolanti (CTC) svolgono un ruolo importante nelle metastasi tumorali. Qui, viene descritto un metodo per l'isolamento e la propagazione di CTC dal sangue intero di un modello di tumore murino singenico di metastasi da carcinoma epatocellulare (HCC).
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e propagare le cellule tumorali circolanti dal sangue intero di un modello tumorale murino sinnogenico con metastasi da carcinoma epatocellulare. Questo viene ottenuto innanzitutto centrifugando il sangue intero raccolto dai topi e isolando il buffy coat. Successivamente, i globuli rossi presenti nel buffy coat vengono lisati e le cellule tumorali circolanti vengono raccolte in un pellet.
Le cellule vengono quindi lavate, sospese in un mezzo di coltura completo e propagate in coltura cellulare. Le cellule tumorali in rapida crescita rimangono vitali per numerose passaggi e possono essere verificate mediante tecniche diagnostiche molecolari standard. L'importanza dell'isolamento di cellule tumorali circolanti mediante la nostra tecnica consiste nel fornire un modello riproducibile, che può essere ottimizzato per un potenziale utilizzo in ambito clinico.
Insieme a me nella dimostrazione della procedura ci sarà Michelle Nadu, una studentessa universitaria del nostro laboratorio. Per iniziare il prelievo, sangue intero da un modello tumorale Ciea Kamau con metastasi da carcinoma epatocellulare, come descritto in un altro numero della J di centrifuga verticale. Il sangue intero raccolto a 1.167 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Dopo la separazione in strati, rimuovere con attenzione lo strato superiore di plasma e trasferirlo in una provetta separata da 1,5 millilitri priva di ROGEN per ulteriori esperimenti, come la rilevazione di acidi nucleici liberi da cellule. Successivamente, trasferire lo strato del buffy coat in una provetta separata da 1,5 millilitri priva di ROGEN, in preparazione alla lisi dei globuli rossi. Questo passaggio è necessario per rimuovere i globuli rossi residui nello strato del buffy coat prima dell'isolamento delle cellule tumorali circolanti.
Iniziare preparando una soluzione di un litro di tampone per la lisi dei globuli rossi con una concentrazione finale di 155 millimolare di cloruro di ammonio e 10 millimolare di triss. Regolare il pH della soluzione a 7,5. Prelevare un'aliquote di circa due-quattro millilitri dalla soluzione madre, ovvero un litro di miscela di tampone per la lisi dei globuli rossi.
Quindi aggiungere un millilitro del tampone di lisi dei globuli rossi al tubo contenente il buffy coat raccolto. Mescolare il contenuto del tubo capovolgendolo più volte. Quindi incubare il tubo per cinque minuti a temperatura ambiente sul banco di lavoro.
Successivamente, centrifugare il contenuto miscelato per cinque minuti a 1.167 ×g. Dopo la centrifugazione, si otterrà un pellet biancastro. Scartare con attenzione e lentamente il soprannatante rossastro in una soluzione di ipoclorito al 10% senza disturbare il pellet.
Dopo aver scartato il soprannatante, lavare il pellet biancastro in un millilitro di PBS. Successivamente, ricentrifugare le cellule e risospendere il pellet nel mezzo di coltura completo. Seminare le cellule risospese in una piastra per colture cellulari e incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con aria e anidride carbonica al 5%.
Cambiare il mezzo di coltura cellulare ogni due o tre giorni. Dopo cinque a sette giorni, le cellule tumorali circolanti si saranno attaccate alla piastra di coltura e avranno iniziato a proliferare. Al fine di verificare che le cellule tumorali circolanti del carcinoma epatocellulare siano state correttamente isolate.
Eseguire la PCR per un segmento specifico del gene della beta globina del topo, come descritto e validato da Stu. Quindi immunomarcare le cellule con un anticorpo specifico per il marcatore specifico degli epatociti. Proteina legante l'elemento responsivo all'AMP ciclico tre come tre, utilizzando tecniche standard; le immagini qui mostrate sono rappresentative di cellule tumorali circolanti provenienti da due topi distinti.
In coltura da un modello murino sinnogenico ortotopico di carcinoma epatocellulare. Le cellule tumorali metastatiche aderiscono alla piastra e si proliferano rapidamente. Possono essere espanse oltre il 25° passaggio e resistono a ripetuti cicli di congelamento e scongelamento.
Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare e propagare cellule tumorali circolanti vitali, nonché di come caratterizzarle sia a livello molecolare che funzionale.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per isolare e propagare cellule tumorali circolanti (CTC) dal sangue intero di un modello murino sinnogenico di metastasi del carcinoma epatocellulare (HCC). La tecnica mira a fornire un modello riproducibile per potenziali applicazioni cliniche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Oncoologia
- Biologia cellulare
- Ricerca sulle metastasi
Sfondo
- Le cellule tumorali circolanti (CTC) sono cruciali nella metastasi tumorale.
- L'isolamento delle CTC può contribuire a comprendere la progressione del cancro.
- I metodi attuali per l'isolamento delle CTC potrebbero mancare di riproducibilità.
- Questo studio presenta un approccio innovativo mediante l'uso di un modello murino.
Scopo dello studio
- Isolare in modo efficace le CTC dal sangue intero.
- Propagare le CTC per ulteriori ricerche.
- Stabilire un modello che possa essere ottimizzato per l'uso clinico.
Metodi Utilizzati
- Centrifugazione del sangue intero per isolare il buffy coat.
- Lisi dei globuli rossi per raccogliere le CTC in un pellet.
- Lavaggio e sospensione delle cellule in mezzo di coltura completo.
- Propagazione delle cellule in coltura cellulare per la valutazione della vitalità.
Risultati principali
- Le CTC rimangono vitali attraverso più passaggi.
- Tecniche diagnostiche molecolari standard possono verificare le cellule.
- Il metodo fornisce un modello riproducibile per la ricerca.
- Potenziale di ottimizzazione in ambito clinico.
Conclusioni
- La tecnica di isolamento è efficace per le CTC provenienti da modelli di carcinoma epatocellulare.
- I risultati supportano ulteriori ricerche sulle metastasi tumorali.
- Questo metodo potrebbe migliorare le applicazioni cliniche per il trattamento del cancro.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento e la propagazione di cellule tumorali circolanti (CTC) dal sangue intero permette un monitoraggio non invasivo della dinamica tumorale e del potenziale metastatico in modelli preclinici. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi fornendo una fonte rinnovabile di cellule tumorali vitali per studi meccanicistici e lo sviluppo di saggi. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nella fase iniziale della scoperta consentendo la caratterizzazione funzionale delle CTC in condizioni di coltura controllate.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante CTC ottenute da un modello di metastasi di carcinoma epatocellulare sostenico.
- Valore operativo: Fornisce un sistema riproducibile per la validazione funzionale di bersagli e la chiarificazione di vie di segnalazione.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico consentendo la caratterizzazione molecolare e funzionale delle CTC isolate.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce CTC propagate adatte alla preparazione di sistemi biologici validati per analisi di screening successive.
- Valore operativo: Garantisce la standardizzazione dei saggi mediante una viabilità e proliferazione cellulare costante attraverso diversi passaggi.
- Valore scientifico: Permette misurazioni quantitative di variabili dipendenti, come i tassi di proliferazione e l'espressione di marcatori, per la valutazione di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la rilevanza per la malattia utilizzando CTC da un modello murino sinnogenico ortotopico di metastasi del carcinoma epatocellulare.
- Valore operativo: Supporta la continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica mediante colture di CTC espandibili.
- Valore scientifico: Facilita studi di allineamento dei biomarcatori mediante marcatori specifici per il carcinoma epatocellulare verificati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione precoce del bersaglio all'identificazione del composto promettente, fornendo colture di CTC caratterizzate per saggi funzionali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la riduzione del rischio biologico attraverso la conferma molecolare dell'identità delle CTC.
- Screening: Fornisce popolazioni cellulari pronte per saggi, riproducibili, con metriche quantitative di crescita per lo screening di composti.
- Analisi: Genera risultati misurabili come adesione, proliferazione ed espressione di marcatori per l'analisi comparativa delle condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta al lavoro preclinico mediante linee di CTC che mantengono caratteristiche specifiche del carcinoma epatocellulare (HCC).
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di coltura cellulare riutilizzabile, applicabile in più cicli di studio e campagne di test di composti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva attraverso la validazione molecolare e funzionale delle CTC propagate.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante protocolli definiti di isolamento e coltura.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo riducendo l'ambiguità meccanicistica nei modelli di metastasi.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio basata su dati funzionali derivati da CTC.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in colture cellulari, ematologia e tecniche di biologia molecolare.
- È dipendente da attrezzature per la centrifugazione, tamponi di lisi e infrastrutture sterili per colture.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro per un'isolazione consistente del buffy coat e della lisi dei globuli rossi.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si applica il metodo a diversi modelli di tumore o specie.
- È limitato dalla necessità di passaggi di verifica molecolare per confermare l'identità delle CTC dopo l'isolamento.
