Name: Isolamento e propagazione di cellule tumorali circolanti da un mouse cancro modello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Scopri come isolare e propagare cellule tumorali circolanti da sangue intero di un modello murino di metastasi epatocellulare. Questa tecnica fornisce un modello riproducibile per applicazioni cliniche.

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Il lavoro nel laboratorio del Dr. Ogunwobi è supportato da una sovvenzione del Programma Centri di Ricerca nelle Istituzioni delle Minoranze dal National Institute on Minority Health and Health Disparities (MD007599) del National Institutes of Health. Il contenuto di questo manoscritto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del NIMHD o del NIH.

Etica Dichiarazione: Tutti gli studi su animali sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) di Hunter College della City University di New York. 1. Procedure di pre-esperimento <ol><li> All&#39;arrivo alla struttura animale, inizialmente ospitare 3 topi BALB / c ad una gabbia con un letto di top e trucioli di legno filtrata. Assicurarsi che i topi hanno libero accesso a cibo, Purina roditori chow, e acqua. Biancheria da letto e cibo devono essere cambiati due volte a settimana, mentre le gabbie devono essere puliti una volta a settimana. </li><li> Un&#39;anestesia generale in topi usando un vaporizzatore isoflurano con ossigeno ad un flusso costante di 1 L per min. Il sistema è autosufficiente e comprende un vaporizzatore di precisione. </li><li> Posizione animale in una scatola di plastica che ha il vaporizzatore precisione e gas / sistema anestetico ad esso collegato. Inizialmente impostare il vaporizzatore di 2,5 fino a quando animale è incosciente, a questo punto abbassare il vaporizzatore a 2. </li><li> A quel tempo, accendere illinea di valvole, sigillandolo alla casella e aprendo al cono. </li><li> Spostare l&#39;animale alla zona di preparazione, con l&#39;ogiva posizionato correttamente e collegato (per anestesia di mantenimento). </li><li> Preparare 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 cellule del mouse HCC per l&#39;impianto per il mouse. BNL 1ME A.7R.1 dovrebbero crescere in mezzo (10% FBS inattivato al calore, 1% di penicillina / streptomicina e 2 mM L-Glutammina) incubazione in un piatto di coltura cellulare a 37 ° C in un incubatore umidificato con aria e 5% CO 2. </li><li> Con una siringa con un ago G 20, impianto 100 pl di PBS contenente 5 x 10 6 Bnl 1ME A.7R.1 cellule di carcinoma epatocellulare topo in un lobo di fegato di topi BALB / c per produrre i tumori primari. Post-impianto, la casa dei topi BALB / c in una gabbia con gli stessi requisiti di case come pre-impianto. </li><li> Al punto finale sperimentale, evidenza clinica di carcinoma epatocellulare è osservabile come riduzione significativa condizione corporeapunteggio (solitamente rilevata dopo 4 settimane). A questo punto, vi è un rischio che i tumori primari hanno sviluppato nel fegato mentre i depositi metastatici sono formati nei polmoni. Successivamente, avviare il processo di isolamento e propagazione delle cellule tumorali circolanti. </li></ol> 2. Raccolta di sangue intero per far circolare tumore isolamento delle cellule NOTA: validato correttamente l&#39;area chirurgia e assicurarsi che sia privo di disordine. Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici o immergersi in una disinfettante secondo la raccomandazione del costruttore <ol><li> Sacrifice topi eutanasia umana a sperimentale end-point (evidenza clinica di sviluppo del tumore). Euthanization di topi dovrebbe coinvolgere CO 2 asfissia. Osservare i topi correttamente per confermare l&#39;anestesia è distribuito correttamente. Il biossido di carbonio dovrebbe essere rilasciato lentamente nella camera per un periodo di 5 - 10 min, causando arresto respiratorio. Seguire per dissanguamento intracardiaca e cervicoAl dislocazione. 5 </li><li> Utilizzare un ago 25 G attaccato ad una siringa da 1 ml per la raccolta di sangue intero. Heparanize la siringa con 0,01 ml di eparina. Puntura immediatamente la pelle con l&#39;ago inferiore al xyphisternum a circa 45 °. Avanzare lentamente l&#39;ago per perforare il cuore, e quindi abbassare l&#39;angolo dell&#39;ago. Costantemente tenere l&#39;ago e la siringa sul posto, e tirare fuori 500 ml - 1000 ml di sangue intero dal cuore. </li><li> Rimuovere la siringa e l&#39;ago e trasferire il sangue in una provetta apirogena 1,5 ml di pre-etichettati. Centrifugare il sangue intero raccolto in 1,5 ml provetta apirogena a 1.167 g per 5 min. NOTA: La centrifugazione separa il campione di sangue intero in tre strati: lo strato inferiore o ematocrito costituito da globuli rossi, un sottile strato intermedio di buffy coat, e uno strato superiore di plasma. </li><li> Rimuovere il plasma accuratamente pipettando e raccolta in una provetta da 1,5 ml apirogena esente separato per Further esperimenti come il rilevamento degli acidi nucleici cell-free 7. </li><li> Per l&#39;isolamento di cellule tumorali circolanti (CTC), raccogliere il buffy coat in un tubo di 1,5 ml apirogena separata in preparazione dei globuli rossi (RBC) lisi. Ciò è necessario rimuovere RBC residue nello strato buffy coat. </li></ol> 3. Ricetta per globuli rossi (RBC) Lysis Buffer <ol><li> Fare una soluzione 1 L di tampone di lisi RBC. </li><li> Fare un 500 ml di cloruro di ammonio e 500 ml di Tris. Quindi mescolare per creare una soluzione 1 L di tampone di lisi degli eritrociti con una concentrazione finale di 155 mM di cloruro di ammonio e 10 mM di Tris. </li><li> Buffer la soluzione a pH 7,5. Conservare il tampone di lisi RBC a 2-8 ° C, e portare a RT immediatamente prima dell&#39;uso. </li></ol> 4. RBC Lisi di Buffy Coat <ol><li> Aggiungere 1 ml di tampone di lisi RBC al tubo di 1,5 ml apirogena sterile contenente il buffy coat raccolto. </li><li> Mescolare il contenuto della provetta dainvertendo più volte. Incubare si mescola della provetta per 5 minuti a RT in panchina. Centrifugare il contenuto misti per 5 min a 1167 x g. </li><li> Dopo centrifugazione, si otterrà un pellet biancastra. Scartare il surnatante rossastro lentamente e con attenzione in candeggina al 10%, senza alcuna interruzione al pellet. Se il pellet non è biancastra, rifare i passaggi 3,1-3,5. Aumentando il tempo di incubazione in tampone di lisi RBC a 10 - 15 min può anche essere utile. </li><li> Gettare i rifiuti biologici, una volta la decontaminazione dei rifiuti biologici nel 10% di candeggina è completo dopo 24 ore. </li></ol> 5. Propagazione in coltura cellulare NOTA: Le cellule tumorali sono in genere in rapida crescita delle cellule dei globuli bianchi che sono abbondanti nel mix originale di cellule seminate nel piatto. A seguito di ripetute cambio di medium, e successive passaggi di CTC, tutti i globuli bianchi vengono rimossi e una popolazione relativamente puro di CTC rimane. <ol><li> Doposcartando il supernatante in 10% di candeggina, lavare il pellet biancastra in 1 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), almeno una volta, e risospendere in mezzo di coltura completo per la propagazione in coltura cellulare. </li><li> Dopo lavaggio è completato, aggiungere 1 ml di mezzo completo di coltura A.7R.1 BNL 1ME (10% FBS inattivato al calore, 1% di penicillina / streptomicina e 2 mM L-Glutammina) al pellet e risospendere il pellet nel mezzo di coltura. </li><li> Seme il mix risospeso di cellule in un piatto di coltura cellulare. Incubare il piatto di coltura cellulare a 37 ° C in un incubatore umidificato con aria e 5% di CO 2. </li><li> Modificare il mezzo di coltura cellulare ogni due o tre giorni. Dopo cinque a sette giorni, CTC avrà aderito al piatto di coltura cellulare e ha iniziato a proliferare. Queste cellule rimangono vitali oltre 25 passaggi e dopo congelamento e scongelamento ripetuti cicli di 5. </li></ol> 6. Verifica di carcinoma epatocellulare circolazione Tumor Cell Line <ol><li> Eseguire apolymerase reazione a catena (PCR) basata su metodo, di amplificare un solo segmento di DNA specifico del gene β-globina topo per confermare che il romanzo ha stabilito linee cellulari CTC sono cellule di topo, come la linea di BNL impiantato 1ME A.7R.1 HCC originale. Metodo è stato originariamente descritto e validato da Steube et al. 5,8 </li><li> Eseguire immunostaining per la specifica per epatociti marcatore cAMP elemento sensibile binding protein 3-simile 3 (CREB3L3) utilizzando un anticorpo specifico. Ciò conferma che il romanzo CTC stabiliti sono infatti epatociti come la impiantato linea cellulare BNL 1ME A.7R.1 originale. 5 </li></ol>

<ol><li>Ashworth, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+of+cancer+in+which+cells+similar+to+those+in+the+tumors+were+seen+in+the+blood+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death.</a> Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).</li>
<li>van de Stolpe, A., den Toonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cells%3A+What+Is+in+It+for+the+Patient%3F+A+Vision+towards+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future.</a> Cancers. 6, 1195-1207 (2014).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture%2C+release+and+culture+of+circulating+tumor+cells+from+pancreatic+cancer+patients+using+an+enhanced+mixing+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip.</a> Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).</li>
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<li>Cheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent%2C+biocompatible+nanostructured+surfaces+for+cancer+cell+capture+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture.</a> International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).</li>
<li>Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).</li>
<li>Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+verification+of+rodent+cell+lines+by+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction.</a> Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).</li>
<li>Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+micrometastases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinical+oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer micrometastases.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 6, 339-351 (2009).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).</li>
<li>Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).</li>
<li>De Giorgi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+and+bone+metastases+as+detected+by+FDG-PET%2FCT+in+patients+with+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+oncology+%3A+official+journal+of+the+European+Society+for+Medical+Oncology+%2F+ESMO%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).</li>
<li>Eloubeidi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+ultrasound-guided+fine+needle+aspiration+biopsy+of+patients+with+suspected+pancreatic+cancer%3A+diagnostic+accuracy+and+acute+and+30-day+complications%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications.</a> The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).</li>
<li>O'Toole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+complications+of+EUS-guided+fine-needle+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+endoscopy%22%5BJournal%5D)">Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration.</a> Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

In questo studio, è stato descritto come isolare e propagare le CTC dal sangue intero di un topo singenico con HCC. L'obiettivo di questo lavoro è quello di migliorare gli studi in corso sui meccanismi delle metastasi tumorali. 
Un fattore che contribuisce alla prognosi infausta di molti tumori è la mancanza di una diagnosi tempestiva e la conseguente diffusione diffusa della neoplasia3. Le CTC originano da tumori primari e si diffondono attraverso il flusso sanguigno a organi dista...

La comunità di ricerca sul cancro è a conoscenza dell'esistenza di cellule tumorali circolanti (CTC) da quando è stata osservata per la prima volta da Thomas Ashworth nel 18691. Da allora, le CTC hanno dimostrato di essere importanti nelle metastasi tumorali e nella progressione della malattia2-5. Oggi, i tumori solidi sono una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Le CTC sono cellule rare che originano da tumori primari e viaggiano attraverso il flusso sanguigno verso diversi organi, di cui solo una piccola frazione si sviluppa in metastasi2-5. In particolare, esiste una correlazione positiva tra le dimensioni del tumore e il numero CTC3,4. 
Una comprensione della biologia CTC può contribuire alla ricerca di una terapia mirata. Inoltre, i CTC possono avere applicazioni diagnostiche. Per ottenere queste potenziali applicazioni cliniche, è necessario superare alcune sfide attuali nello studio delle CTC. Una sfida è legata al fatto che le CTC possono essere presenti come singole cellule o come cluster e possono anche essere in grado di modificare il loro fenotipo in risposta al microambiente del sangue2. Inoltre, il rilevamento può essere molto impegnativo, in parte, a causa del basso numero di CTC (da poche a centinaia per millilitro) tra un miliardo di cellule ematologiche per millilitro nel sangue6. Tuttavia, negli ultimi anni, la ricerca sulle potenziali applicazioni cliniche delle CTC nei tumori degli organi solidi si è intensificata.
Nonostante questi sforzi, le sfide per studiare e comprendere il ruolo delle CTC persistono a causa della rarità delle CTC e dell'inadeguatezza degli strumenti tecnologici attualmente disponibili. Nonostante queste sfide, l'enorme potenziale per le applicazioni cliniche continua ad essere un incentivo a perseguire la ricerca sul ruolo delle CTC nelle metastasi del cancro.
Recentemente siamo riusciti a isolare e propagare in coltura cellulare CTC da un modello murino singenico ortotopico di metastasi 5 del carcinoma epatocellulare(HCC). Lo scopo del presente articolo è quello di descrivere in dettaglio tutti gli aspetti della metodologia di successo. L'importanza di questa metodologia risiede nel fatto che questo approccio può essere modificato al fine di isolare e propagare con successo in coltura CTC umane, aumentando così la possibilità di studi in vitro di biologia delle CTC. 
Ci sono molteplici potenziali applicazioni cliniche per l'uso delle CTC. Le CTC possono essere utili per la prognosi, il monitoraggio della risposta, lo screening, il monitoraggio dinamico delle alterazioni molecolari del tumore e la terapia personalizzata4. Pertanto, una migliore comprensione della biologia delle CTC ha un alto potenziale di impatto clinico.

<table><tbody><tr><td>Eparina Sale Sodico 1 g</td><td>VWR</td><td>89508-852</td><td></td></tr><tr><td>BTX Tubo Micro 1,5 ml Trasparente NS</td><td>VWR</td><td>89511-254</td><td>1,5 ml&nbsp; apirogeno Eppendorf</td></tr><tr><td>Tubes Ago Sterile Disp BD 25 G x 1 in</td><td>VWR</td><td>BD305125</td><td>25 G Ago</td></tr><tr><td>Slp Tip SRNG 1 ml 200 ciascuno per confezione</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td>1 ml di punta per siringa</td></tr><tr><td>Siringa 1 ml leur lok Pk 100</td><td>VWR</td><td>BD309628</td><td>siringa da 1 ml</td></tr><tr><td>VWR Pinze Tessuto 6</td><td>VWR</td><td>82027-446</td><td>Pinze</td></tr><tr><td>Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100</td><td>VWR</td><td>25608-924</td><td>Cyromold</td></tr><tr><td>Cryo-oct compund 4 oz</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Oct compound</td></tr><tr><td>VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td>Vetrini</td></tr><tr><td>VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>48-382-128</td><td>Vetro di copertura</td></tr><tr><td>VWR Slide Box True North Fm Pu</td><td>VWR</td><td>89140-278</td><td>Slide Box</td></tr><tr><td>Super HT PAP Pen</td><td>VWR</td><td>89427-058</td><td>PAP pen</td></tr><tr><td>Water RNASe and DNAse free 2 L</td><td>VWR</td><td>101454-204</td><td>Tampone acqua privo di nucleasi</td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure Grade 500 g</td><td>VWR</td><td>97061-796</td><td>Tris Buffer</td></tr><tr><td>Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg</td><td>VWR</td><td>97062-048</td><td>Tampone per cloruro di ammonio</td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale per falco 60 x 15 mm</td><td>Piatto per coltura tissutale</td>in polistirene <td>VWR</td><td>353002</td></tr><tr><td>Candeggina germicida Clorox, normale</td><td>VWR</td><td>89501-620</td><td>Candeggina Clorox</td></tr><tr><td>PBS, 1x (soluzione salina tamponata con fosfato) senza calcio e magnesio (500 ml)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21-040-CV</td><td>PBS, 1x</td></tr><tr><td>DMEM, 1x&nbsp; con 4,5 g/L di glucosio & L-glutammina senza piruvato di sodio</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>10-017-CV</td><td>DMEM 1x terreno per cellule BNL 1ME A.7R.1</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>35-010-CV</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina soluzione, 100x</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>30-002-Cl</td><td>Penicillina Streptomicina</td></tr><tr><td>Sorvall Biofuge pico</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>75002411</td><td>Centrifuga 13.000 giri/min</td></tr></tbody></table>

isolamento e propagazione di cellule tumorali circolanti da un mouse cancro modello

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Le metastasi tumorali sono la principale causa di decessi associati al cancro. Studi recenti hanno dimostrato che le cellule tumorali circolanti (CTC) sono importanti nelle metastasi del cancro. Infatti, il numero di CTC è correlato alle dimensioni del tumore. Qui, viene fornita una descrizione dettagliata di una metodologia per l'isolamento e la propagazione di CTC da un modello murino singenico di carcinoma epatocellulare (HCC) che consente l'analisi a valle di meccanismi molecolari potenzialmente importanti delle metastasi del tumore d'organo solido. Questo metodo è efficiente e riproducibile. È una tecnica non invasiva e, quindi, ha il potenziale per sostituire la biopsia invasiva dei tessuti dell'uomo che può essere associata a complicanze. Pertanto, il metodo qui discusso consente l'isolamento e la propagazione delle CTC da campioni di sangue intero in modo che possano essere esaminate e caratterizzate. Ciò ha il potenziale per l'adattamento futuro per applicazioni cliniche come la diagnosi e la terapia mirata personalizzata.

La metodologia qui descritta ha dimostrato che CTC possono essere isolati. I topi sono stati umanamente eutanasia alla sperimentale punto finale. Il processo ha coinvolto anidride carbonica per asfissia, dissanguamento intra-cardiaca, e dislocazione cervicale. Uno schema di passi principali della procedura sono illustrati in Figura 2. Campioni di sangue intero prelevato da dissanguamento intra-cardiaca sono stati elaborati usando il protocollo descritto sopra. Dopo di che, la centrifuga...

È stato dimostrato che le cellule tumorali circolanti (CTC) svolgono un ruolo importante nelle metastasi tumorali. Qui, viene descritto un metodo per l'isolamento e la propagazione di CTC dal sangue intero di un modello di tumore murino singenico di metastasi da carcinoma epatocellulare (HCC).

Isolamento e propagazione di cellule tumorali circolanti da un mouse cancro modello

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e propagare le cellule tumorali circolanti dal sangue intero di un modello tumorale murino sinnogenico con metastasi da carcinoma epatocellulare. Questo viene ottenuto innanzitutto centrifugando il sangue intero raccolto dai topi e isolando il buffy coat. Successivamente, i globuli rossi presenti nel buffy coat vengono lisati e le cellule tumorali circolanti vengono raccolte in un pellet.Le cellule vengono quindi lavate, sospese in un mezzo di coltura completo e propagate in coltura cellulare. Le cellule tumorali in rapida crescita rimangono vitali per numerose passaggi e possono essere verificate mediante tecniche diagnostiche molecolari standard. L'importanza dell'isolamento di cellule tumorali circolanti mediante la nostra tecnica consiste nel fornire un modello riproducibile, che può essere ottimizzato per un potenziale utilizzo in ambito clinico.Insieme a me nella dimostrazione della procedura ci sarà Michelle Nadu, una studentessa universitaria del nostro laboratorio. Per iniziare il prelievo, sangue intero da un modello tumorale Ciea Kamau con metastasi da carcinoma epatocellulare, come descritto in un altro numero della J di centrifuga verticale. Il sangue intero raccolto a 1.167 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente.Dopo la separazione in strati, rimuovere con attenzione lo strato superiore di plasma e trasferirlo in una provetta separata da 1,5 millilitri priva di ROGEN per ulteriori esperimenti, come la rilevazione di acidi nucleici liberi da cellule. Successivamente, trasferire lo strato del buffy coat in una provetta separata da 1,5 millilitri priva di ROGEN, in preparazione alla lisi dei globuli rossi. Questo passaggio è necessario per rimuovere i globuli rossi residui nello strato del buffy coat prima dell'isolamento delle cellule tumorali circolanti.Iniziare preparando una soluzione di un litro di tampone per la lisi dei globuli rossi con una concentrazione finale di 155 millimolare di cloruro di ammonio e 10 millimolare di triss. Regolare il pH della soluzione a 7,5. Prelevare un'aliquote di circa due-quattro millilitri dalla soluzione madre, ovvero un litro di miscela di tampone per la lisi dei globuli rossi.Quindi aggiungere un millilitro del tampone di lisi dei globuli rossi al tubo contenente il buffy coat raccolto. Mescolare il contenuto del tubo capovolgendolo più volte. Quindi incubare il tubo per cinque minuti a temperatura ambiente sul banco di lavoro.Successivamente, centrifugare il contenuto miscelato per cinque minuti a 1.167 ×g. Dopo la centrifugazione, si otterrà un pellet biancastro. Scartare con attenzione e lentamente il soprannatante rossastro in una soluzione di ipoclorito al 10% senza disturbare il pellet.Dopo aver scartato il soprannatante, lavare il pellet biancastro in un millilitro di PBS. Successivamente, ricentrifugare le cellule e risospendere il pellet nel mezzo di coltura completo. Seminare le cellule risospese in una piastra per colture cellulari e incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con aria e anidride carbonica al 5%.Cambiare il mezzo di coltura cellulare ogni due o tre giorni. Dopo cinque a sette giorni, le cellule tumorali circolanti si saranno attaccate alla piastra di coltura e avranno iniziato a proliferare. Al fine di verificare che le cellule tumorali circolanti del carcinoma epatocellulare siano state correttamente isolate.Eseguire la PCR per un segmento specifico del gene della beta globina del topo, come descritto e validato da Stu. Quindi immunomarcare le cellule con un anticorpo specifico per il marcatore specifico degli epatociti. Proteina legante l'elemento responsivo all'AMP ciclico tre come tre, utilizzando tecniche standard; le immagini qui mostrate sono rappresentative di cellule tumorali circolanti provenienti da due topi distinti.In coltura da un modello murino sinnogenico ortotopico di carcinoma epatocellulare. Le cellule tumorali metastatiche aderiscono alla piastra e si proliferano rapidamente. Possono essere espanse oltre il 25° passaggio e resistono a ripetuti cicli di congelamento e scongelamento.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare e propagare cellule tumorali circolanti vitali, nonché di come caratterizzarle sia a livello molecolare che funzionale.

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Medicina

Il video descrive la tecnica per l'iniezione intracecale di cellule cancerose per sviluppare un modello murino ortotopico con tumori altamente uniformi. Pertanto, il modello murino ortotopico consente una simulazione realistica delle metastasi, fornendo uno strumento prezioso per studiare i cambiamenti fenotipici durante la crescita e la disseminazione del tumore.

Iniezione intracecale di cellule tumorali: una tecnica per fornire cellule tumorali per stabilire un modello murino di cancro colorettale ortotopico

Questo video descrive un protocollo dettagliato per isolare le cellule tumorali circolanti dal campione di sangue intero di un modello murino di tumore colorettale soppresso. Queste CTC isolate possono essere coltivate e utilizzate per l'analisi a valle prevista.

Isolamento CTC da un campione di sangue intero: un metodo per ottenere CTC da un modello di cancro colorettale murino

La diffusione metastatica del cancro è la principale causa di decessi correlati al cancro. Forniamo una descrizione approfondita della nostra metodologia chirurgia sopravvivenza per stabilire un modello di sistema ortotopico singenici mouse "paziente-tipo" per lo studio dei meccanismi di metastatizzazione dei tumori di organi solidi.

A &quot;paziente-Like&quot; ortotopico Singenico modello murino della carcinoma epatocellulare Metastasi

Segnaliamo un metodo affidabile per isolare e coltivare cellule endoteliali primarie specifiche per il tumore da modelli murini geneticamente modificati.

Isolamento e cultura espansione delle cellule endoteliali tumore-specifici

Questo manoscritto descrive in dettaglio un metodo utilizzato per generare xenotrapianti derivati da pazienti affetti da cancro alla prostata (PDX) da cellule tumorali circolanti (CTC). La generazione di modelli PDX da CTC fornisce un modello sperimentale alternativo per studiare il cancro alla prostata; il tumore più comunemente diagnosticato e una frequente causa di morte per cancro negli uomini.

Generazione di cancro alla prostata del paziente Derivato modelli di xenotrapianto di cellule tumorali circolanti

Descriviamo la creazione di tumori colorettali ortotopici attraverso l'iniezione di cellule tumorali o organoidi nel cecum dei topi e il successivo isolamento di cellule tumorali circolanti (CTC) da questo modello.

Isolamento delle cellule tumorali circolanti in un modello di topo ortotopico del tumore del colon-retto

Un modello animale è necessario per decifrare il ruolo di fare circolare le cellule del tumore (CTCs) nel promuovere la colonizzazione del polmone durante la metastasi del cancro. Qui, abbiamo stabilito ed effettuato con successo un in vivo analisi specificamente prova il requisito dell'Assemblea polimerici fibronectina (polyFN) su CTCs per colonizzazione del polmone.

L'istituzione di un'analisi di colonizzazione del polmone per la visualizzazione di cellule del tumore nei tessuti polmonari di circolazione

Qui, presentiamo un flusso di lavoro integrato per identificare le caratteristiche fenotipiche e molecolari che caratterizzano le cellule tumorali circolanti (CTC). Combiniamo l'immunocolorazione dal vivo e la micromanipolazione robotica di CTC singoli e cluster con tecniche a singola cellula per l'analisi a valle e la valutazione dell'abilità di metastasi-semina.

Micromanipolazione delle cellule tumorali circolanti per l'analisi molecolare a valle e la valutazione del potenziale metastatico

Questo protocollo descrive un metodo riproducibile per l'isolamento delle cellule primarie del thabdomyosarcoma del topo, la formazione e il trattamento della tumorsfera e il trapianto di allotrapianto a partire dalle colture di cellule di tumori.

Derivazione della sfera di tumore e trattamento da cellule tumorali primarie isolate da Rhabdomyosarcomas del topo

La coltura di CTC consente una caratterizzazione funzionale più profonda del cancro, attraverso l'analisi dell'espressione di marcatori specifici e la valutazione della resistenza ai farmaci e della capacità di colonizzare il fegato tra le altre possibilità. Nel complesso, la cultura CTC potrebbe essere uno strumento clinico promettente per la medicina personalizzata per migliorare l'esito del paziente.

Linee cellulari tumorali circolanti: uno strumento innovativo per la ricerca fondamentale e traslazionale

La traduzione dei risultati della microscopia intravitale è messa a dura prova dalla sua penetrazione a bassa profondità nei tessuti. Qui descriviamo un modello murino a camera a finestra dorsale che consente la co-registrazione della microscopia intravitale e delle modalità di imaging clinicamente applicabili (ad es. TC, MRI) per la correlazione spaziale diretta, semplificando potenzialmente la traduzione clinica dei risultati della microscopia intravitale.

Un modello murino tumorale della camera della finestra delle pliche cutanee dorsali per la microscopia intravitale combinata e la risonanza magnetica nella ricerca traslazionale sul cancro

Scopri come isolare e propagare cellule tumorali circolanti da sangue intero di un modello murino di metastasi epatocellulare. Questa tecnica fornisce un modello riproducibile per applicazioni cliniche.

Isolamento e propagazione di cellule tumorali circolanti da un mouse cancro modello

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