Name: Lisolamento dei leucociti di Human Interface materno-fetale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Impara l'isolamento dei leucociti dalla decidua umana per studi di immunologia riproduttiva. Questo metodo combina dissociazione meccanica ed enzimatica con gradiente di densità per preservare i marcatori di superficie cellulari.

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Questo lavoro è stato supportato dal Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH / DHHS. Questo lavoro è stato supportato anche, in parte, dalla Wayne State University perinatale Iniziativa in materna, perinatale e la salute del bambino. Si ringrazia Maureen McGerty (Wayne State University) per la sua lettura critica del manoscritto.

Questo protocollo è appropriato per leucociti isolamento dai basalis decidua e parietalis decidua in preparazione per immunofenotipizzazione mediante citometria di flusso. Inoltre, le cellule isolate possono essere utilizzati per la separazione delle cellule, colture cellulari, isolamento dell&#39;RNA, e citologia. Prima di lavorare con i campioni di cui al presente protocollo, l&#39;approvazione etica umana deve essere ottenuto dal Research Comitato Etico Locale e Institutional Review Boards. La raccolta e l&#39;utilizzazione di campioni umani a fini di ricerca sono state approvate dai Institutional Review Board dell&#39;Istituto Nazionale Eunice Kennedy Shriver delle saluti infantili e dello sviluppo umano (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Dipartimento di Salute e Servizi Umani (DHHS , Bethesda, MD, USA) e Wayne State University (Detroit, MI, USA). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutte le donne incinte prima della raccolta di campioni di tessuto. NOTA: Mentre si lavora con sangue animale, cellule o di pericoloAgenti OU come indicato in questo protocollo, è fondamentale che una corretta biosicurezza e le azioni di sicurezza di laboratorio essere seguite. 1. La dissezione dei tessuti umani deciduali NOTA: La piastra basale è la base sottostante e attaccato alla placenta e rappresenta la superficie materno. Le membrane chorioamniotic comprendono sacco amniotico e il corion. La piastra basale comprende i basale decidua e il corion include i parietalis decidua (Figura 1). <ol><li> Decidua Basalis <ol><li> Sezionare un pezzo della piastra basale da un cotiledone della placenta (Figure 1A e 1B). </li><li> Mettere su un tagliere sterile con i villi placentari rivolti verso l&#39;alto. Il lato mostrando la villi della placenta è di solito rosso sanguinante con il tessuto peloso in apparenza. La piastra basale è liscia e pallida di colore rosso. </li><li> Utilizzare taglienti, forbici a punta fine e pinze per rimuovere il villtessuti e vasi sanguigni unità organizzative. Mantenere il tessuto imbevuto di 1x PBS (Ca 2+ - e Mg 2+ - libera) durante il processo (Figura 1C). Raccogliere 2-3 di questi pezzi e risciacquare accuratamente con 1x PBS per rimuovere il sangue (Figura 1D). </li></ol></li><li> Decidua parietalis <ol><li> Sezionare un pezzo di membrane chorioamniotic (circa 10 cm x 10 cm, Figura 1E). Mettere sul tabellone con il corion rivolto verso l&#39;alto. Il lato corionica contiene coaguli di sangue e di solito è giallo chiaro a colori. </li><li> Utilizzare pinze a punta fine per rimuovere il maggior numero di coaguli di sangue il più possibile (Figura 1E). Sciacquare la membrana in sterili 1x PBS per pulire il sangue in eccesso dalla membrana fino a quando la 1x PBS è pulita. </li><li> Utilizzare un raschietto cellulare usa e getta sterili per raschiare delicatamente lo strato deciduali dalla membrana. Applicare sterile 1x PBS sul membrane mentre il completamento di questo processo (Figura 1F). Raccogliere i tessuti deciduali e metterli in un tubo di plastica da 50 ml con sterile 1x PBS (Figura 1G). </li></ol></li></ol> 2. meccanica disaggregazione e digestione enzimatica <ol><li> Lavare il tessuto sezionato dai basale decidua (dal punto 1.1.3) o il parietalis decidua (dal punto 1.2.3) con sterile 1x PBS in un tubo di plastica da 50 ml. Raccogliere pellets tessuto mediante centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il surnatante che si trova sopra il precipitato di tessuto con attenzione senza disturbare il pellet. NOTA: A questo punto, il pellet sono molto allentati perché contengono globuli rossi. Se il volume del pellet è circa o inferiore a 3 ml, risospendere il pellet in 6 ml di soluzione di distacco cellulare pre-riscaldato a 37 ° C. Se il pellet è più grande di 3 ml di volume, aggiungere più soluzione distacco cellulare (aggiungere circa 2 volte °e volume dei campioni di tessuto). </li><li> Trasferire i tessuti omogeneizzati (basale decidua + soluzione o decidua distacco delle cellule parietalis + soluzione distacco cellulare) per un tubo C. </li><li> Posizionare il tubo C nel dissociatore automatica ed eseguire il programma corrispondente. NOTA: Il programma per i basale decidua corre per 17 secondi con 668 colpi totali per correre. Il programma per i parietalis decidua corre per 37 secondi con 235 colpi totali per correre. Questi programmi sono stati personalizzati per isolare leucociti dalle basale decidua oi parietalis decidua con una buona resa e la vitalità cellulare. </li><li> Dopo la disgregazione meccanica dei tessuti, digerire i tessuti con una soluzione distacco cellulare disponibile in commercio come accutase; (Un cocktail che contiene enzimi proteolitici e collagenolitica) per 45 min a 37 ° C con agitazione. </li></ol> 3. Isolamento di leucociti <ol><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 10 ml di PBS 1x al DigeBustione miscela e farla passare attraverso un colino cella di 100 micron in un tubo di plastica da 50 ml. A seconda della viscosità della miscela di digestione, uno potrebbe essere necessario utilizzare diversi filtri cellulari per una miscela. </li><li> Riempire il tubo con 1x PBS e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la PBS 1x sopra i pellet cellulari attentamente e risospendere il pellet con 5 ml di tampone FACS ghiacciato. NOTA: per studiare i polimorfonucleati e leucociti mononucleari insieme, andare al passo 6.1; per studiare i leucociti mononucleari, passare alla Fase 3.3. </li><li> Aggiungere 5 ml di 20% supporti gradiente di densità (1.077 + 0.001 g / ml) in una provetta di plastica da 15 ml e lentamente sovrapporre la sospensione cellulare in cima al supporto gradiente di densità. Mentre stratificazione del campione, è importante non mescolare i media gradiente di densità con la sospensione cellulare. </li><li> Centrifugare con un rotore oscillante a 500 xg per 30 min a 4 ° C, senza il freno. E &#39;molto importante disattivare il freno per evitare di mescolare le cellule e lOsing il gradiente. I leucociti si trovano nell&#39;interfaccia tra il supporto gradiente di densità e il buffer FACS. </li><li> Rimuovere lo strato superiore che contiene il buffer e cellule detriti FACS molto attentamente con una pipetta. La banda all&#39;interfaccia contiene le cellule mononucleate deciduali e una porzione di leucociti polimorfonucleati. </li><li> Trasferire le cellule all&#39;interfaccia completamente in un tubo di plastica da 15 ml. Aggiungere almeno 3 volte più volume di tampone FACS. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 5 minuti per pelletizzare cellule. Aspirare il surnatante e lavare le cellule con tampone FACS. Pelletizzare le cellule con un&#39;altra centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Per eseguire la coltura cellulare, vedere il passaggio 4. Per eseguire l&#39;ordinamento delle cellule, vedere il passaggio 5. Per effettuare immunofenotipizzazione, vedere il passaggio 6. </li></ol> 4. Le domande - Colture cellulari <ol><li> Risospendere le cellule a partire dal punto 3.7 in 1 ml di terreno di coltura RPMI 1640. Contare le cellule vitali using un contatore di cellule automatico o un emocitometro e una soluzione trypan blu 0,4%. </li><li> Aggiungere la quantità di terreno di coltura RPMI per effettuare una concentrazione cellulare di 1 x 10 6 cellule / ml. Le cellule sono ora pronti per la cultura. </li></ol> 5. Applicazioni - Isolamento dei macrofagi per colture cellulari primarie <ol><li> Per isolare cellule CD14 +, magneticamente etichettare le cellule dal punto 3.7 con microsfere CD14 (20 perline microlitri per 10 7 cellule), incubare per 15 min a 4 ° C, e CD14 + cellule separato da altri tipi di cellule, applicando un campo magnetico. Dopo 2 lavaggi con tampone e la rimozione del campo magnetico MACS, eluire le cellule CD14 + magneticamente a nuovo con tampone MACS. </li><li> Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in RPMI 1640. terreno di coltura le cellule sono pronte per la placcatura (Figura 2). </li></ol> 6. Applicazioni - immunofenotipizzazione <ol><li> Per utilizzare le cellule per immunophenotyping, risospendere le cellule a partire dal punto 3.7 in 1 ml di PBS 1x. Contare le cellule vitali mediante un contatore di cellule automatico o un emocitometro e una soluzione trypan blu 0,4%. </li><li> Etichettare le cellule con un colorante vitalità fissabile (Figura 3). Lavare le cellule due volte con tampone FACS e risospendere le cellule in tampone macchia. Incubare con un bloccante FcR per 15 minuti a 4 ° C. </li><li> Aggiungere anticorpi coniugati a fluorocromi extracellulari. Ad esempio, in questo protocollo, utilizzare anti-CD3, anticorpi anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 e anti-CD56 (Tabella 1). Incubare per 30 minuti a 4 ° C al buio. </li><li> Dopo 2 lavaggi con 1x PBS, le cellule saranno analizzate in 500 ml di buffer di macchia con un citofluorimetro. Una rappresentazione della strategia gating utilizzato per analizzare i leucociti sub-popolazioni presenti nei tessuti deciduali è mostrato in Figura 4. </li></ol>

Gli autori non rivelano conflitti di interesse.

Caratterizzazione delle proprietà funzionali e fenotipiche di leucociti infiltranti all&#39;interfaccia materno-fetale umano è essenziale per la comprensione dei meccanismi immunitari che portano a disturbi della gravidanza. Diverse tecniche sono state descritte per isolare leucociti dall&#39;interfaccia materno-fetale durante la gravidanza umana 10,14,25,28,37,42,43. Tuttavia, ciascuna di queste tecniche è distinta, utilizza enzimi o combinazioni di enzimi diversi, richiede diversi tempi di dissociazione, no...

La gravidanza è caratterizzato da tre fasi distinte, immunologiche: 1) impianto e placentazione precoce associata ad una risposta pro-infiammatoria (cioè, l&#39;impianto assomiglia un &#39;ferita aperta&#39;); 2) il secondo trimestre e la maggior parte del terzo trimestre di gravidanza, quando omeostasi immunitaria è ottenuta attraverso uno stato prevalentemente antinfiammatoria all&#39;interfaccia materno-fetale; e 3) il parto, uno stato pro-infiammatorio 1-7. Le cellule immunitarie svolgono un ruolo importante nella regolazione della risposta infiammatoria all&#39;interfaccia materno-fetale in cui la loro abbondanza e il cambiamento di localizzazione durante la gravidanza 6-9. Negli esseri umani, l&#39;interfaccia materno-fetale rappresenta un&#39;area di contatto diretto tra materna (decidua) e fetale (corion o trofoblasto) tessuti. Questa interfaccia comprende: 1) la decidua parietalis che riveste la cavità uterina non coperto dalla placenta ed è in giustapposizioneal laeve corion; e 2) i basale decidua, che si trova nel piatto basale della placenta dove viene invasa da trophoblasts interstiziali 10 (Figura 1). L&#39;intimità di queste aree di contatto crea le condizioni per l&#39;esposizione fetale antigenica materno 11-13 sistema immunitario. Non sorprendentemente, leucociti comprendono fino al 30-40% delle cellule deciduali 8,9,14,15 in aggiunta alle cellule stromali tipici tipo e cellule ghiandolari 8,14,16. Il ruolo dei leucociti all&#39;interfaccia materno-fetale comprende più processi che includono la limitazione del trofoblasto dell&#39;invasione 17, rimodellamento delle arterie spirali 18,19, mantenimento della tolleranza materno 12,20, e l&#39;avvio del lavoro 21-26. Leucociti sia del adattativa e arti innate del sistema immunitario, cioè, le cellule T, macrofagi, neutrofili, cellule B, cellule dendritiche e cellule NK, sono state identificate nei tessuti deciduali, e loroproporzioni e lo stato di attivazione hanno dimostrato di variare spazialmente e temporalmente durante la gestazione 6-10,12,14,24,27-30. Perturbazioni nella popolazione e / o la funzione dei leucociti sono associati con aborto spontaneo 31, preeclampsia 32, ritardo di crescita intrauterino 32,33, e parto pretermine 7,24. Pertanto, lo studio delle caratteristiche fenotipiche e funzionali di leucociti all&#39;interfaccia materno-fetale umano faciliterà la delucidazione delle vie immunologiche disregolato nei disturbi della gravidanza. Uno degli strumenti più potenti utilizzati per determinare il fenotipo e proprietà funzionali dei leucociti è citometria a flusso, la tecnologia che consente l&#39;analisi quantitativa di più parametri contemporaneamente 34-36. Per analizzare leucociti mediante citometria di flusso, è richiesto l&#39;isolamento dei leucociti in una cella singola sospensione. Pertanto, un metodo per separare infiltrazione leukocytes dall&#39;interfaccia materno-fetale è necessario per studiare la loro fenotipiche e funzionali. Diversi metodi sono stati descritti per isolare leucociti dall&#39;interfaccia materno-fetale umano 10,14,25,27,37-39. Mentre alcuni si applicano disaggregazione meccanica 10,25,27,38, altri usano digestione enzimatica 37,40 per la dissociazione dei tessuti. Perché disaggregazione meccanica produce una resa inferiore e ridotto la vitalità 41, e la dissociazione enzimatica può influenzare la vitalità e superficie cellulare marcatore ritenzione 42, il metodo qui descritto combina dolce dissociazione meccanica con enzimatica pretrattamento per aumentare la resa dei leucociti isolati, senza compromettere la vitalità cellulare. Una simile combinazione di metodi è stato dimostrato per essere efficace nell&#39;isolamento dei leucociti dai tessuti deciduali all&#39;interfaccia materno-fetale 39. Pertanto, il protocollo qui descritto comporta mechadisaggregazione nica con un dissociatore tessuto automatico che aumenta la coerenza risparmiando tempo e fatica rispetto a macinazione tradizionale con bisturi contrapposti, lame di rasoio o forbici chirurgiche 10,28. L&#39;enzima scelto per la dissociazione dei tessuti era Accutase. A differenza di uso comune collagenasi 43, dispasi 44, e 45 tripsina, Accutase (una soluzione distacco cellulare) combina proteolitici generale e le attività che contribuiscono al collagenolitica efficiente dissociazione ma delicato 46,47. Dopo la dissociazione, i leucociti sono arricchiti dalla popolazione totale delle cellule deciduali di gradiente di densità centrifugazione. Vari mezzi gradiente di densità sono stati precedentemente utilizzati, il più comune dei quali sono Percoll (una sospensione di particelle di silice colloidale) 48 e Ficoll (un polimero di saccarosio con un elevato peso molecolare sintetica) 49. L&#39;efficienza superiore di isolamento dal polimero saccarosio è stata previously mostrato 50, e il protocollo descritto qui ulteriormente dimostra che questo supporto gradiente di densità produce una sufficientemente elevata purezza dei leucociti mononucleari. Pertanto, il protocollo qui descritto combina la disaggregazione tessuto meccanico con dissociatore automatica tessuto, la digestione enzimatica con una soluzione distacco cellulare, e la separazione dei leucociti con un supporto gradiente di densità (1.077 + 0.001 g / ml) per isolare leucociti da tessuti deciduali umani. Questo protocollo è stato dimostrato per preservare antigeni di superficie cellulare con la vitalità cellulare. I leucociti isolati possono essere utilizzati per molteplici applicazioni che includono immunofenotipizzazione con citometria di flusso e studi funzionali in vitro.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Dissection</td></tr><tr><td>Strumenti di dissezione sterili: forbici chirurgiche, pinze e pinzette a punta fine&nbsp;</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>1X soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>(1X PBS)</td></tr><tr><td>Piastre di Petri grandi e piccole</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dissociation</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td>(soluzione di distacco cellulare)</td></tr><tr><td>Provette coniche sterili da 2 ml con chiusura di sicurezza</td><td>Qualsiasi </td><td></td><td></td>Vendor</tr><tr><td>50 ml Provette da centrifuga coniche</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; filtri cellulari</td><td>m FALCON/Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Provette in polistirene a fondo tondo da 5 ml</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Culture</td></tr><tr><td>RPMI terreno di coltura 1640&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089(</td><td>1X) (10% FBS e 1% P/S)</td></tr><tr><td>Vetrini per camera in plastica</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Thermo Scientific Corporation</td><td>HEPA Classe 100</td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td>Fisher Scientific ISOTEMP</td><td>110</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di cellule</td><td>Nexelcom</td><td>Cellometro Auto2000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>Olympus CKX41</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Separation</td></tr><tr><td>MS colonne</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Separatore cellulare</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu; m filtri di pre-separazione</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-40</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml provette coniche con chiusura di sicurezza</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS tampone&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0,5% di albumina sierica bovina, 2 mM EDTA e 1X PBS)</td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>FcR Blocking</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901(</td><td>Fc Block)</td></tr><tr><td>Anticorpi anti-antigene della superficie cellulare umana&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>(Tabella 1)</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD colorante di vitalità</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>tampone Lyse/Fix&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>346202</td><td></td></tr><tr><td>tampone FACS&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0,1% BSA, 0,05% azoturo di sodio e 1X PBS, pH=7,4)</td></tr><tr><td>Tampone di colorazione&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano 0,4%Life</td> <td>Technologies</td><td>15250-011</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Terreni a gradiente di densità del 20% (1,077 + 0,001 g/ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Strumenti aggiuntivi</td></tr><tr><td>Incubatore con agitatore</td><td>Thermo Scientific</td><td>MAXQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td>BD Biosciences Centrifuga</td><td>LSR-Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>SpinChron DLX</td><td></td></tr><tr><td>Sistema per vuoto</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissociatore automatico dei tessuti&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>dissociatore</td><td></td> gentleMACS</tr></tbody></table>

l&#39;isolamento dei leucociti di human interface materno-fetale

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Gravidanza è caratterizzata dalla infiltrazione di leucociti nei tessuti riproduttivi e all&#39;interfaccia materno-fetale (basalis decidua e decidua parietalis). Questa interfaccia è il sito anatomico di contatto tra materna e tessuti fetali; Pertanto, è un sito immunologica di azione durante la gravidanza. Leucociti infiltranti all&#39;interfaccia materno-fetale svolgono un ruolo centrale in impianto, manutenzione di gravidanza, e la tempistica di consegna. Pertanto, caratterizzazioni fenotipiche e funzionali di questi leucociti forniranno informazioni sui meccanismi che portano a disturbi della gravidanza. Diversi protocolli sono stati descritti per isolare leucociti infiltranti dai basalis decidua e parietalis decidua; Tuttavia, la mancanza di uniformità nei reagenti, enzimi, e tempi di incubazione rende difficile confrontare questi risultati. Descritto qui è un nuovo approccio che combina l&#39;uso di dolci diss meccanici ed enzimaticitecniche ociation per preservare la vitalità e l&#39;integrità dei marcatori extracellulari e intracellulari nei leucociti isolati dai tessuti umani all&#39;interfaccia materno-fetale. A parte immunofenotipizzazione, coltura cellulare, e lo smistamento delle cellule, le future applicazioni di questo protocollo sono numerose e varie. Seguendo questo protocollo, i leucociti isolati possono essere utilizzati per determinare la metilazione del DNA, l&#39;espressione di geni bersaglio, in funzionalità vitro leucociti (cioè, fagocitosi, citotossicità, la proliferazione delle cellule T, e plasticità, ecc), e la produzione di specie reattive dell&#39;ossigeno all&#39;interfaccia materno-fetale. Inoltre, utilizzando il protocollo descritto, questo laboratorio è stato in grado di descrivere nuove e rare leucociti all&#39;interfaccia materno-fetale.

. La dissezione dei tessuti umani all&#39;interfaccia materno-fetale (basalis decidua e decidua parietalis) è mostrato in Figura 1 Questa procedura prevede la dissezione della piastra basale, che comprende le basale decidua (Figura 1A - D). Il basalis decidua è ottenuto rimuovendo villi placentare (lato fetale) dalla piastra basale (Figura 1C). Il parietalis decidua viene raccolto raschiando delicatamente la membrana corionica (Figura 1E</strong...

Qui descritto è un protocollo per isolare e studiare ulteriormente i leucociti infiltranti della decidua basalis e della decidua parietalis - l'interfaccia materno-fetale umana. Questo protocollo mantiene l'integrità dei marcatori della superficie cellulare e produce un numero sufficiente di cellule vitali per le applicazioni a valle, come dimostrato dall'analisi della citometria a flusso.

L&#39;isolamento dei leucociti di Human Interface materno-fetale

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i leucociti dalla decidua umana, dal baus e dalla decidua paral. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando i tessuti deciduali umani dalla placenta. Successivamente, il tessuto deciduali viene dissociato mediante disaggregazione meccanica e digestione enzimatica.Successivamente, la sospensione cellulare viene filtrata utilizzando un filtro cellulare da 100 micrometri, lavato con un XPBS e centrifugato a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per ottenere un pellet cellulare. Infine, la sospensione cellulare viene caricata sulla sommità della soluzione a gradiente di densità e centrifugata, raccogliendo l'interfaccia contenente i leucociti. Alla fine, i leucociti isolati possono essere utilizzati per immunofenotipizzazione, colture cellulari e studi funzionali.Il vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la dissociazione meccanica o la digestione enzimatica, consiste nel combinare la desegregazione meccanica del tessuto con un associatore tissutale automatico e la digestione tematica con Accutase e l'isolamento dei leucociti mediante un gradiente di densità. È stato dimostrato che questo protocollo preserva gli antigeni di superficie cellulare mantenendo la vitalità cellulare, e le sue implicazioni si estendono alla comprensione delle proprietà funzionali e fenotipiche dei leucociti infiltranti all'interfaccia materno-fetale, correlate alla patogenesi delle complicanze prenatali. La raccolta e l'utilizzo di campioni umani a fini di ricerca sono stati approvati dai comitati etici dell'Eunice Kennedy Shriver, National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services e della Wayne State University.È stato ottenuto il consenso informato scritto da tutte le donne in gravidanza prima della raccolta dei campioni di tessuto. Per iniziare, il discepolo basale isola un frammento della piastra basale da un lobo placentare. Posizionarlo su un tagliere sterile con il versante placentario, che apparirà di colore rosso sangue e con aspetto peloso, rivolto verso l'alto.La piastra basale è liscia e di colore rosso chiaro; mantenendo il tessuto immerso in XPBS, utilizzare forbici e pinzette con punta fine e affilata per rimuovere il tessuto villiforme e i vasi sanguigni. Raccogliere due o tre frammenti e utilizzare PBS per lavarli accuratamente al fine di rimuovere il sangue. Per isolare il decidua parale, dissezionare un quadrato di 10 centimetri per 10 centimetri.Posizionarlo sulla piastra con il corione, che contiene coaguli di sangue ed è solitamente di colore giallo chiaro, rivolto verso l'alto. Successivamente, utilizzare pinzette a punta fine per rimuovere il maggior numero possibile di coaguli di sangue. Quindi, con PBS sterile 1x, sciacquare la membrana finché il PBS non diventa limpido.Utilizzando un raschietto sterile monouso e aggiungendo PBS sulla membrana, staccare delicatamente lo strato deciduale. Raccogliere i tessuti deciduali e collocarli in un tubo di plastica da 50 millilitri contenente PBS sterile per disgregare meccanicamente la decidua Bali o la deci paral. Iniziare utilizzando PBS sterile 1X per lavare il tessuto in un tubo da 50 millilitri.Quindi centrifugare il tessuto a 300 G e a temperatura ambiente per cinque minuti. Aspirare con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet. Successivamente, dopo aver risospeso il tessuto e la soluzione di distacco secondo il protocollo indicato nel testo, trasferire i tessuti omogeneizzati in una provetta C.Posizionare il tubo nell&#39;apparecchio di dissociazione automatica ed eseguire il programma corrispondente dopo la dissociazione con una soluzione commerciale per il distacco cellulare, come Accutase, sui tessuti. Incubare a 37 gradi Celsius con agitazione delicata per 45 minuti per digerire il campione. Al termine dell&#39;incubazione, aggiungere 10 millilitri di PBS alla miscela digerita e filtrarla attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri in un tubo da 50 millilitri. A seconda della viscosità, potrebbero essere necessari diversi filtri per filtrare una singola digestione.Usare PBS per riempire il tubo e centrifugare a 300 ×g e a temperatura ambiente per cinque minuti. Rimuovere con attenzione il sopranatante S e utilizzare cinque millilitri di tampone Ficoll ghiacciato per risospendere il pellet cellulare. Per studiare i leucociti mononucleati, aggiungere cinque millilitri di mezzo a gradiente di densità al 20% in un tubo di plastica da 15 millilitri.Quindi, sovrapporre lentamente la sospensione cellulare in alto, avendo cura di non far mescolare gli strati, utilizzando una centrifuga con rotore a cestello a 500 G a quattro gradi Celsius e senza freno per 30 minuti; i leucociti si troveranno all'interfaccia tra il mezzo a gradiente di densità e il tampone fax. Successivamente, prelevare con attenzione il livello superiore che contiene il tampone fax e i detriti cellulari. L'interfaccia contiene le cellule mononucleate residue e una parte dei leucociti polimorfonucleati.Trasferire questo strato in un nuovo tubo da 15 millilitri. Aggiungere al tubo almeno tre volumi di buffer fax, quindi centrifugare a 300 ×g per cinque minuti. Per raccogliere le cellule, aspirare il soprannatante S e lavare le cellule con buffer fax una seconda volta prima di procedere con la coltura cellulare.Ordinamento e immunofenotipizzazione secondo il protocollo descritto nel testo; questa figura mostra la morfologia dei macrofagi isolati dalla decidua parietale in una gravidanza a termine, ottenuti mediante separazione cellulare magnetica. I macrofagi isolati mantengono la capacità di rilasciare citochine dopo tre giorni di coltura. Il rendimento di cellule vitali isolate dalla decidua, baus e decidua paral è stato determinato dopo separazione mediante gradiente di densità.Utilizzando un marcatore di vitalità fissabile come mostrato qui, era superiore al 90% per ogni popolazione di cellule deciduali. Qui è mostrata la strategia di selezione per l'analisi dei leucociti polimorfonucleati e mononucleati all'interno della selezione visibile, inclusi linfociti T, neutrofili, macrofagi, cellule NK, linfociti T NK e linfociti B. A termine della gravidanza, questa figura mostra neutrofili, macrofagi, linfociti T e linfociti B ottenuti da cellule residue isolate da una gravidanza a termine.Infine, in questo insieme di grafici sono rappresentati i linfociti NK, NKT e T provenienti dalle cellule residue isolate da una gravidanza a termine. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di pulire accuratamente il tessuto, di evitare contaminazioni ematiche e di tenere sotto controllo il tessuto e il cocktail enzimatico durante tutta la procedura.

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Immunology and Infection

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Isolamento di Brain-infiltrazione Leucociti

Qui si descrive un protocollo per isolare sottoinsiemi di precursore cellule B dal sangue del cordone ombelicale. Una sufficiente quantità e qualità di acidi nucleici può essere estratto dalle cellule e utilizzati in saggi successivi utilizzando DNA o RNA.

Isolamento di precursori delle cellule B di sottoinsiemi di sangue del cordone ombelicale

Qui descritto è un protocollo per isolare e analizzare i leucociti infiltranti dei tessuti all'interfaccia materno-fetale (utero, decidua e placenta) dei topi. Questo protocollo mantiene l'integrità della maggior parte dei marcatori di superficie cellulare e produce un numero sufficiente di cellule vitali per le applicazioni a valle, tra cui l'analisi della citometria a flusso.

L&#39;isolamento dei leucociti di tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale

Qui descriviamo i metodi per la dissezione dei tessuti fetali e materni da placenta umana termine, seguito da isolamento e l'espansione delle cellule stromali / staminali mesenchimali (MSC) da questi tessuti.

Isolamento e l&#39;espansione delle staminali mesenchimali stromali derivate / cellule da placenta umana Tissue

Un metodo semplice per stabilire placentare primaria umana (villi) e colture d'organo deciduali è descritto. Villi e deciduali colture d'organo sono strumenti preziosi per lo studio patogenesi all'interfaccia materno-fetale umano. È dimostrata l'infezione con il batterio intracellulare facoltativi Listeria monocytogenes.

Culture placentare e deciduale organo umano allo Studio infezioni all&#39;interfaccia materno-fetale

Qui, presentiamo un protocollo per la dissezione di cordone umano ombelicale (UC) e il campione placenta fetale in cavo rivestimento (CL), gelatina di Wharton (WJ), cavo-placenta giunzione (CPJ), e placenta fetale (FP) per l'isolamento e caratterizzazione di cellule stromali mesenchimali (MSC) utilizzando la tecnica di espianto.

Isolamento e caratterizzazione di cellule mesenchimali stromali dal Cordone ombelicale e placenta fetale

Questo protocollo viene illustrato un metodo per l'isolamento di cellule deciduali umane primarie raccolti da membrane fetali di placente di termine che possono essere utilizzate per una varietà di applicazioni (cioè immunocitochimica, citometria a flusso, ecc.) con l'obiettivo per studiare il ruolo delle diverse popolazioni cellulari in complicazioni di gravidanza.

Isolamento di cellule deciduali umane primarie dalle membrane fetali del termine intempestivo della placenta

Il latte materno trasmette il virus dell'immunodeficienza umana (HIV), anche se solo il 15% dei neonati allattati al seno da madri affette da HIV si infetta. I neonati allattati al seno ingeriscono 105x 108 leucociti materni al giorno, anche se queste cellule sono poco studiate. Qui descriviamo l'isolamento del latte materno leucociti e un'analisi della loro capacità fagocitica.

Isolamento dei leucociti dal latte materno umano per l'uso in un saggio di fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi sui bersagli HIV

Questo è un metodo per isolare le cellule linfoidi uterine da topi sia gravidi che non gravidi. Questo metodo può essere utilizzato per molteplici applicazioni a valle come la fenotipizzazione FACS, lo smistamento cellulare, i saggi funzionali, l'RNA-seq e la proteomica. Il protocollo qui dimostra come fenotipizzare le cellule linfoidi innate uterine del gruppo 1 mediante citometria a flusso.

Isolamento delle cellule linfoidi innate uterine per l'analisi mediante citometria a flusso

Questo protocollo descrive in dettaglio l'isolamento di popolazioni vive immunitarie e non immuni dal polmone di topo allo stato stazionario e in seguito all'infezione influenzale. Fornisce inoltre strategie di gating per l'identificazione di sottogruppi di cellule epiteliali e mieloidi.

Isolamento di popolazioni di cellule mieloidi ed epiteliali vive dal polmone di topo

Questo protocollo consente la purificazione, la caratterizzazione e la coltura dei trofoblasti extravillosi primari HLA-G+ (EVT) dalla decidua basali e dalla membrana corionica delle placente a termine umane. Le colture primarie di EVT mantengono la vitalità per 96 ore, permettendo la co-coltura con cellule immunitarie materne abbinate a campioni e la successiva analisi citometrica e molecolare del flusso delle loro interazioni.

Purificazione di trofoblasti extravillosi HLA-G+ da tessuti placentari a termine umani per fenotipizzazione e analisi funzionale

Impara l'isolamento dei leucociti dalla decidua umana per studi di immunologia riproduttiva. Questo metodo combina dissociazione meccanica ed enzimatica con gradiente di densità per preservare i marcatori di superficie cellulari.

L'isolamento dei leucociti di Human Interface materno-fetale

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