L'isolamento dei leucociti di tessuti murini all'interfaccia materno-fetale

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i leucociti infiltranti all'interfaccia materno-fetale murina. Questo viene ottenuto innanzitutto prelevando l'utero, la placenta e l'eua. I tessuti vengono frammentati mediante dissociazione meccanica in una soluzione enzimatica, seguita da una digestione enzimatica successiva.

La sospensione cellulare risultante viene quindi filtrata e lavata, momento in cui le cellule immunitarie di interesse vengono separate dai detriti cellulari, come le cellule non vitali, mediante un gradiente di siero bovino fetale. Infine, i leucociti isolati possono essere utilizzati per immunofenotipizzazione, colture cellulari o il sorting cellulare. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando stavamo cercando di stabilire un protocollo per l'isolamento di leucociti dall'interfaccia materno-fetale, rendendoci conto che i metodi pubblicati non facilitavano l'isolamento delle cellule immunitarie rare che sono di nostro interesse.

Una dimostrazione. La procedura sarà eseguita da Mile El Sanchez Rodriguez Marcina Hernandez, che sono collaboratori di ricerca del mio laboratorio. Per raccogliere i tessuti dell'interfaccia materno-fetale, iniziare utilizzando un paio di forbici chirurgiche sterili per rimuovere completamente la porzione addominale inferiore della pelle e del tessuto muscolare. Successivamente, utilizzare una pinza per spostare da parte tutti gli altri organi finché non siano visibili l'utero e le ovaie. Quindi, spostare l'utero all'esterno della cavità peritoneale.

Individuare le ovaie in posizione distale rispetto al tubo cervicouterino (UCT) e alla giunzione uterotubarica di ciascun corno uterino. Successivamente, effettuare un'incisione alla giunzione uterotubarica per separare i corni dal mesentere contenente i vasi uterini. Escindere a livello del collo dell'utero per staccare i corni uterini dalla cavità peritoneale.

Quindi utilizzare forbici chirurgiche per praticare un'incisione tra la cervice e il segmento inferiore delle corna, lasciando una porzione della cervice attaccata per evitare di aprire la corno uterina. Immergere le corna e la cervice in una grande piastra di Petri riempita con 10-15 millilitri di PBS per idratare i siti di impianto. Rimuovere eventuali depositi di grasso dai tessuti.

Quindi tenere i corni in posizione con la pinzetta. Eseguire un taglio trasversale attraverso una regione interimplantatoria per rimuovere uno dei siti di impianto dall'utero. Ora mantenere il sito in posizione ed effettuare una piccola incisione nella parete uterina adiacente ai tessuti placentari e residui.

Tagliare lungo il perimetro della placenta e della decidua fino a quando i tessuti non si separano sia dalla parete uterina che dalla membrana corionica. Trasferire quindi la placenta e i tessuti deciduali ad essa associati in una nuova capsula di Petri contenente da tre a cinque millilitri di PBS. Trasferire il feto in un'altra capsula di Petri con PBS e utilizzare pinzette a punta fine per rimuovere delicatamente il tessuto deciduale di colore bianco-grigiastro dalla superficie placentare.

Avendo cura di mantenere l'integrità dei tessuti placentari e della membrana corionallantoidea (ECI). Suddividere i tessuti placentari e della ECI in due piastre di Petri etichettate singolarmente e riempite con PBS. Successivamente, utilizzare pinzette a punta fine per rimuovere delicatamente la parete uterina della membrana corionallantoidea e posizionare questi tessuti uterini in una nuova piastra di Petri contenente PBS, al fine di dissociare meccanicamente i tessuti.

Successivamente, trasferire due campioni di 100-150 milligrammi di tessuti uterini e placentari in provette coniche da due millilitri etichettate singolarmente. Aggiungere 500 microlitri di soluzione enzimatica fredda 1 a ciascuna provetta. Quindi utilizzare forbici sterili per dissociare meccanicamente ciascun tessuto per non più di due minuti, fino a ottenere sospensioni.

Sviluppano un aspetto lattiginoso. Aggiungere ulteriori 500 microlitri di soluzione enzimatica fredda, uno per ogni provetta, e posizionare le provette sul ghiaccio. Successivamente, incubare tutti i tessuti a 37 gradi Celsius con un'agitazione orbitale delicata a 80 giri al minuto, ponendo le provette sul ghiaccio dopo 30-35 minuti per arrestare la digestione.

Ora filtrare ogni omogeneizzato tissutale attraverso un filtro da 100 micron in provette coniche da 50 millilitri etichettate singolarmente e lavare ogni provetta da due millilitri e il filtro da due a tre volte con 20 millilitri di PBS per raccogliere tutte le cellule. Una volta filtrate tutte le cellule, centrifugare e aspirare con attenzione il SUPERNATANTE senza disturbare il pellet. Risospendere delicatamente i leucociti e le cellule stromali isolati in un millilitro di mezzo di coltura RPMI, evitando di vorticosare.

Quindi, per ogni tessuto, aggiungere 500 microlitri di siero fetale bovino in un tubo di polistirene da cinque millilitri e sovrapporre lentamente la sospensione cellulare al siero. Infine, una volta sovrapposte tutte le cellule, centrifugare le cellule senza frenata e aspirare il soprannatante senza toccare il pellet cellulare. In queste immagini, la morfologia dei macrofagi positivi per F4/80 isolati dai tessuti deciduali e uterini.

A 16,5 giorni post coito sono mostrate cellule provenienti da tessuti dell'interfaccia materna e fetale. Presentano una vitalità superiore al 70% dopo l'isolamento mediante questo metodo e contengono popolazioni di neutrofili, macrofagi, cellule T, cellule NK e cellule dendritiche, con una elevata proporzione di macrofagi che coesprimono sottopopolazioni leucocitarie CD11c isolate dai tessuti all'interfaccia materno-fetale. Sono inoltre presenti cellule B e cellule T positive per CD4, cellule T positive per CD8 e cellule T positive per CD3 e negative per CD4 e CD8, che sono anch'esse isolate, come osservato in questo diagramma di densità.

Ok, durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere i tessuti e il cocktail enzimatico sul ghiaccio, impostare la temperatura corretta nell'incubatore e di non manipolare eccessivamente i tessuti durante la digestione, seguendo questa procedura. Possono essere eseguiti altri metodi come immunofenotipizzazione, coltura cellulare, sorting cellulare e isolamento di D-N-A-R-N-A. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare i leucociti infiltranti all'interfaccia materno-fetale, nell'utero e nella placenta.