Name: Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Scopri come preparare doppi strati lipidici supportati e caratterizzarne le proprietà meccaniche con microscopia a forza atomica. Questo metodo consente imaging ad alta risoluzione e spettroscopia forza per studiare membrane biologiche.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Max Planck Society, il tedesco Cancer Research Center, l&#39;Università di Tubinga, e il Bundesministerium für Bildung und Forschung (concessione n. 0.312.040). Ringraziamo Eduard Hermann per averci aiutato ad automatizzare l&#39;analisi dei dati curva forza e il Dr. Jakob Suckale un&#39;attenta lettura di questo manoscritto.

1. Preparazione di doppi strati lipidici supportati (SLB) 11,12,21 <ol><li> Preparazione di lipidi miscela e multilamellari vescicole Sospensioni <ol><li> Preparare i seguenti buffer in anticipo. <ol><li> Preparare tampone PBS a concentrazioni di 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4, e 137 mM NaCl, pH 7,2. </li><li> Preparare SLB (bistrato lipidico supportato) tampone a concentrazioni di NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4. </li><li> Preparare una soluzione di 1 M CaCl 2. </li></ol></li><li> Sciogliere le seguenti lipidi in cloroformio a una concentrazione desiderata: ad esempio, di-oleoyl-fosfatidilcolina (DOPC) a 25 mg / ml, sfingomielina (SM) a 25 mg / ml e colesterolo (Chol) a 10 mg / ml. </li><li> Prendere 18,38 ml di DOPC, 17,10 ml di SM e 11.30 ml di Chol per ottenere una soluzione con 1 mg di lipidi totali in rapporto 2: 2: 1 DOPC: rapporto molare Chol: SM. Variare i volumi di conseguenza, basandosi sul concentrations dei lipidi preparate in 1.1.2. Tuttavia, mantenere il rapporto molare di 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, come cambiando il rapporto molare cambierà le caratteristiche di fase della membrana 25. </li><li> Mescolare la soluzione completamente nel vortex. Aggiungere un colorante fluorescente lipidico a 0,05 moli% se si desidera visualizzare il doppio strato con un microscopio a fluorescenza. Nota: La famiglia di dialkylcarbocyanines a catena lunga, come ha fatto, DII e DiO abbracciano una vasta gamma di lunghezze d&#39;onda e possono essere utilizzati in posizione ideale per etichettare membrane lipidiche. In alternativa, i lipidi fluorescente, come rodamina-fosfatidiletanolamina o BODIPY-colesterolo possono essere utilizzati. In ogni caso, la concentrazione del colorante deve essere ottimizzato in base all&#39;impostazione microscopia, tenendo presente che alte concentrazioni di fluoroforo legato al lipide possono modificare il comportamento lipidica 19. </li><li> Asciugare il cloroformio con N 2 gas (o qualsiasi gas inerte disponibili come Ar e He). </li><li> Ulteriore t seccoegli lipidico miscela sotto vuoto per almeno 1 ora. Nota: Se si conserva questa miscela lipidica, eliminare l&#39;aria con gas inerte (N 2, Ar o He) e conservare a -20 ° C. Aliquota lipidi-in-cloroformio in eccesso in piccole fiale marrone. Asciugarli in un modo simile come la miscela di lipidi, spostare l&#39;aria con gas inerte (N 2, Ar o He) e conservare a -20 ° C. </li><li> Sciogliere i lipidi essiccati in tampone PBS ad una concentrazione di 10 mg / ml. </li><li> Vortex la miscela vigorosamente per circa 20 secondi a 1 minuto per ottenere una sospensione torbida, contenente vescicole multilamellari. Assicurarsi che il non ci sono film lipidici sporgenti ai lati del flacone. </li><li> Distribuire la sospensione in 10 aliquote microlitri (1 mg di lipidi rende 10 aliquote). </li><li> Conservare a -20 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol></li><li> Preparazione di unilamellari vescicole Nota: I vari formati di vescicole unilamellari possono essere preparate con il metodo sonicazione o il metodo di estrusione. Sonicazione utilizza sound energia per agitare la miscela e separare gli strati della sospensione multilamellare. Questo è indicato da ripulire della sospensione nebuloso. Estrusione costringe le vescicole multilamellari passare attraverso un filtro a membrana con dimensione dei pori definito. <ol><li> Metodo Sonicazione <ol><li> Prendete i 10 ml di sospensioni lipidiche multilamellari e aggiungere 150 ml di tampone SLB. </li><li> Trasferire il composto in piccoli (2 ml) fiale di vetro ricoperti e sigillare con Parafilm. </li><li> Sonicare la miscela a temperatura ambiente in un bagno sonicatore per 10 minuti o fino a quando diventa chiaro per produrre piccole vescicole unilamellari (SUV, inferiore a 50 nm di diametro). </li></ol></li><li> Metodo di estrusione <ol><li> Prendete i 10 ml di sospensioni lipidiche multilamellari e aggiungere 150 ml di tampone SLB. </li><li> Trasferire la sospensione in un tubo criogenico. </li><li> Congelare la sospensione lipidica immergendo il tubo criogenico per alcuni secondi in azoto liquido. </li><li> Scongelare lasospensione lipidica immergendo il tubo criogenico in un bagno d&#39;acqua a temperatura ambiente oa 37 ° C per alcuni minuti. Ripetere le fasi gelività almeno 10 volte. </li><li> Per estrudere la sospensione lipidica, usare una membrana di policarbonato con dimensioni 200 nm pori (altre dimensioni dei pori sono disponibili come, 100 nm o 400 nm) e di un dispositivo di estrusione commerciale 26. Nota: Attualmente, ci sono due dispositivi estrusori disponibili in commercio: un estrusore manuale è disponibile per piccoli volumi (200 microlitri a pochi ml). In questo caso, il campione viene estruso attraverso la membrana spingendo manualmente la sospensione avanti e indietro tra due siringhe. A seconda del produttore, aliquote lipidi dovrebbero essere combinati per raggiungere volume minimo del set up. Per i volumi più grandi (fino a 50 ml) sono utilizzati dispositivi più sofisticati in cui la sospensione è forzato attraverso la membrana di policarbonato utilizzando gas compresso. Condizioni di impianto e di estrusione possono cambiare in base alla model. Consultare le istruzioni del produttore prima dell&#39;uso. Questo protocollo si riferisce al estrusore manuale per piccoli volumi. </li><li> Equilibrare l&#39;estrusore in acqua facendo passare l&#39;acqua attraverso l&#39;estrusore. Immergere la membrana in acqua. </li><li> Posizionare la membrana tra i due pistoni, montare il dispositivo ed equilibrare in tampone, facendo passare il buffer attraverso l&#39;estrusore, da una siringa all&#39;altra. Questa fase consente inoltre testare la permeabilità del sistema. Se perde, smontare e rimontare nuovamente cambiare la membrana. </li><li> Prendere la sospensione lipidica utilizzando una siringa dell&#39;estrusore (&#39;lato sporco&#39;). </li><li> Applicare la siringa contenente la sospensione lipidica su una camera e la siringa vuota sulla camera opposta. </li><li> Premere la siringa su una estremità. Far passare la soluzione attraverso la membrana e nella siringa avversaria. Questo è il passo 1 °. </li><li> Passare attraverso la membrana per un totale di 31 volte taliche la soluzione finisce sulla siringa opposta (&#39;lato pulito&#39;). Nota: Controllare la membrana dopo l&#39;estrusione. Se è stato rotto, allora il processo di estrusione, non ha avuto successo e deve essere ripetuto. </li><li> Svuotare la siringa in un piccolo tubo. Grandi vescicole unilamellari (Luvs) sono stabili per 1-2 giorni se conservato a 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Preparazione di Mica e vetrini <ol><li> Lavare coprioggetto prima in acqua e poi in etanolo. Aria secca. </li><li> Prendete dischi mica e staccare lo strato esterno con del nastro adesivo. </li><li> Fissare il disco mica sul vetrino. Colle ottici trasparenti sono ottimali in modo che si possa controllare i doppi strati con un microscopio a fluorescenza. </li><li> Fissare cilindri di plastica (diametro 2,5 centimetri esterno, due centimetri di diametro interno, e 0,5 cm di altezza) con ottica colla / grasso. Assicurarsi che tutto sia sigillata e che non vi siano perdite. Usare grasso quando vogliono riutilizzare i cilindri in quanto possono essere facilmente smontato dal the vetrino e lavato. Le dimensioni dei cilindri di plastica dipendono dalle dimensioni del supporto cantilever AFM e devono essere regolati di conseguenza. </li></ol></li><li> Deposizione di unilamellari vescicole su un solido appoggio <ol><li> Pipettare l&#39;intera soluzione liposomiale direttamente sulla mica. Aggiungere più di buffer SLB di raggiungere un volume di 300 ml. </li><li> Aggiungere 0,9 ml di soluzione 1 M di cloruro di calcio per raggiungere una concentrazione finale di 3 mM Ca 2+. </li><li> Incubare a 37 ° C per 2 minuti e poi a 65 ° C per almeno 10 min. Coprire sempre i doppi strati con tampone. Il contatto con le bolle d&#39;aria e aria la distruggerà. Durante l&#39;incubazione, aggiungere più tampone se necessario, soprattutto se incubando a temperature più elevate. Nota: le temperature di incubazione variano secondo le miscele di lipidi e le fasi necessarie. Occorre tempo di incubazione di almeno 10 minuti per formare bistrati supportati, ma potrebbe essere più lungo, a seconda della temperatura e della composizione. </li><li> Lavaggioil doppio strato con calda (65 ° C) del buffer SLB 15-20 volte per rimuovere calcio e vescicole non fuse. Prestare particolare attenzione durante le fasi di lavaggio per mantenere il doppio strato sotto buffer e pipetta delicatamente la soluzione di lavaggio per evitare di distruggere il doppio strato. </li><li> Raffreddare bistrati supportati a temperatura ambiente prima misure AFM. Ciò è necessario per formare le diverse fasi della membrana e ridurre la deriva termica dello strumento. </li></ol></li></ol> 2. Forza Atomica Microscopia Misure 11,12 <ol><li> Imaging Nota: eseguire a forza atomica immagini di microscopia in modalità contatto o in modalità tapping. Immagini supportati bistrati in soluzione; non consentono soluzione evapori completamente, come questo distruggerà i doppi strati. Come ci si potrebbe lavorare con tampone, osservare le precauzioni di sicurezza per fare in modo che ogni parte AFM è protetto da fuoriuscite di liquidi. <ol><li> Selezionare una mensola morbido (di seguito è consigliato di 0,2 N / m costante della molla) e montarlo in tegli AFM. La scelta di cantilever rigidità è più critica per la spettroscopia di forza (e se ne parlerà più avanti). </li><li> Montare il campione sul palco AFM e fare in modo che tutti i moduli di vibrazione-isolamento sono attivate. Attendere almeno 15 minuti per equilibrare e ridurre la dispersione termica del sistema. A seconda della AFM set-up, messa a punto e di imaging specifiche possono variare. Consultare manuale del costruttore. </li><li> Avvicinare il campione con la punta AFM fino contatto. </li><li> Poiché doppi strati lipidici sono solitamente 4 nm in altezza, utilizzare la Z-gamma dello strumento che darà il più alto z-risoluzione (ad esempio 1,5 micron). </li><li> Seleziona una regione per immagine. Per avere una panoramica del doppio strato lipidico, a 50 micron x 50 micron o 25 micron x 25 micron regione sarà un buon punto di partenza per l&#39;immagine. Se appaiono le caratteristiche più piccole, immagine una lattina nelle aree più piccole (10 micron x 10 micron, o 2 micron x 2 micron). La scelta della zona di imaging dipende anche dalla r lavorareange dello scanner piezoelettrico. Si prega di consultare il manuale dello strumento per questo. </li><li> Come bistrati sono molto fragili, regolare il set point della punta AFM durante l&#39;imaging di mantenere la forza al minimo e corretta per deriva termica, restando a contatto con il campione. Nella modalità di contatto, ridurre al minimo il set point. In modalità toccando, massimizzare il set point. </li><li> Le immagini del processo di montaggio ogni linea di scansione per le funzioni di livellamento polinomi. Eseguire la rimozione delle linee per le scansioni che perdono contatto con la membrana utilizzando il software proprietario della società di produzione AFM. </li></ol></li><li> Spettroscopia Forza <ol><li> Calibrare il cantilever seguendo le istruzioni in base al protocollo del produttore. La calibrazione consente la conversione del segnale elettrico di fotodiodi a forza (Figura 1B). <ol><li> Calibrare la sensibilità della punta per misurare deflessione come movimento z-piezo (in unità di lunghezza) invece del segnale elettrico in volt. <br /&gt; Nota: AFM rileva variazioni della deflessione del cantilever utilizzando un laser riflessa sul retro del cantilever. Il laser raggiunge un fotodiodo in grado di rilevare la posizione spaziale del punto laser. Un cambiamento nella deflessione della cantilever come si piega a contatto con il campione viene rilevata da questo fotodiodo come &quot;deflessione verticale&quot;, e questo è in unità di tensione. Poiché il cantilever viene spostato dalla z-piezo, la deflessione verticale è legato al movimento in z-piezo. Il rapporto tra la deflessione verticale e z-movimento è chiamato sensibilità e converte la tensione a distanza. </li><li> Calcolare la costante della molla a sbalzo con il metodo frequenza del rumore termico, solitamente incorporato nel software AFM. In questo metodo, tracciare l&#39;ampiezza di vibrazione dal rumore rispetto alla frequenza di oscillazione, creando una trama densità spettrale di potenza. Questo grafico mostra un picco intorno alla frequenza di risonanza. La frequenza dove l&#39;i dell&#39;ampiezzas il più grande è la frequenza di risonanza. Montare una funzione Lorentziana intorno al picco di calcolare automaticamente la costante della molla dal software. Alcune risorse utili per la teoria del metodo rumore termico sono riportati nei riferimenti 27-30. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;imaging un&#39;area del doppio strato, selezionare una regione x 5 micron 5 micron nel doppio strato effettuare spettroscopia di forza. </li><li> Impostare la AFM modo che ci vuole forza curve di una griglia di quella regione 16 x 16. Ciò si traduce in 256 curve di forza per regione. Lo spazio tra i due punti adiacenti dovrebbe essere sufficiente ad evitare che l&#39;area membrana essendo controllato di un punto coinciderebbe con il punto successivo. Questo dipende dal raggio della punta. Una distanza 100 nm tra due punti sarebbe ideale. Dividere il 5 micron x 5 micron regione in 16 x 16 griglia. A seconda delle dimensioni della fase, si può selezionare una regione più piccolo o più grande, e quindi regolare la dimensione della griglia di conseguenza. </li><li> Set spostamento z-piezo per400 nm. Questo determina la portata massima di movimento del z-piezo. Esso dovrebbe essere abbastanza grande per assicurarsi che il cantilever sia completamente ritirata dal campione tra le misurazioni. </li><li> Impostare velocità di avvicinamento a 800 nm / sec e ritrarre la velocità a 200 nm / sec. Utilizzare una velocità di avvicinamento tra 400 a 6.000 nm / sec a seconda della composizione bistrato e fase lipidica da studiare 6,16. </li><li> Dopo aver impostato tutti i parametri, acquisire forza curve, premendo il tasto &quot;run&quot; del software AFM. </li><li> Salvare forza curve come forza contro le curve di altezza (una misura di movimento z-piezo). Ciò non tiene conto della curvatura del cantilever a contatto con il campione. Durante la fase di elaborazione dei dati, il software permette di AFM correzione per cantilever flessione per ottenere forza contro curve di separazione punta-campione (Figura 1C), che darà valori corretti per lo spessore doppio strato. I valori di correzione sono di solito incorporati nel CALIBRAZzione, che viene salvato ad ogni curva di forza. Calcolare separazione punta-campione sottraendo la deflessione verticale dal movimento piezo in un determinato punto. Nota: Il picco nella curva forza approccio (il valore della forza scende anche se il movimento cantilever è ancora sul ciclo di accostamento) è la forza innovativa della membrana, mentre la differenza tra la posizione di questo picco e la posizione del punto dove la forza comincia a sollevarsi fornisce nuovamente lo spessore della membrana. </li><li> Acquisire almeno 500 curve di forza per ogni condizione di ottenere buone statistiche. Tracciare un istogramma dei valori utilizzando programmi come origine o MatLab, e montare gli istogrammi di una distribuzione gaussiana per ottenere il picco e la larghezza della distribuzione. </li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

SLB composti DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) sono formati sulla mica dopo vescicole adsorbimento e rottura indotta da cloruro di calcio. Questa composizione lipidica separato in L d e L o fasi. La fase L o si arricchisce in sfingomielina e colesterolo ed è meno fluido / più viscoso (Figura 1A) che l&#39;L d di fase 11. La separazione di L o di fase L d manifesta come strutture circolari elevata sopra la circostante (Figura 1B,...

Atomic Force Microscopy (AFM) genera un&#39;immagine di una superficie di scansione attraverso l&#39;area del campione utilizzando una mensola con una punta molto affilata 1. Il movimento del cantilever sonda la topologia superficiale del campione. AFM è stato ampiamente applicato alle molecole biologiche - come proteine, DNA e membrane, grazie alla sua versatilità nell&#39;analisi campioni fissati in aria o stato quasi native nel liquido 2-5. Oltre alla sua capacità di imaging ad alta risoluzione in nanometri, il cantilever AFM agisce come una molla per sondare forze di interazione (adesione e repulsione) e le proprietà meccaniche del campione di 5,6. Questo è noto come spettroscopia di forza. In questa modalità, la prima sonda si avvicina al campione e esercita una forza su di esso, allora viene retratto fino perde contatto con il campione (Figura 1A). Le curve generate mostrano forza in funzione della distanza del cantilever sia per l&#39;applicazionescarafaggio e retrazione. Diversi proprietà incluso il modulo elastico per misurare la rigidità di un materiale, e le forze di adesione possono essere derivati. Bistrati lipidici supportati sono membrane biologiche modello situata sulla sommità di un supporto solido - solitamente mica, vetro borosilicato, silice fusa, o ossidato silicio 7. Sono preparati utilizzando varie tecniche come vescicole deposizione, metodo Langmuir-Blodgett e spin-coating 8,9. L&#39;imaging AFM è stato utilizzato per seguire la formazione di questi bistrati supportati 10, e sonda diverse strutture formate da membrane di diverse composizioni 11-15. Esecuzione di spettroscopia di forza su bistrati risultati supportati in un picco nella curva approccio. Questo picco indica la forza necessaria per perforare il doppio strato, e si chiama forza rivoluzionaria. Lo spessore doppio strato può essere misurata utilizzando la curva della forza 6. La forza innovativa tipica di bistratirange compreso tra 1-50 nN 6. Queste proprietà dipendono imballaggio lipidi (liquido o gel fase) e la struttura (acil lunghezza della catena e il grado di insaturazione) e modificata da agenti membrana attiva 16. La teoria dietro la rottura è stato spiegato il 17 ed altri parametri sperimentali come cantilever morbidezza, il raggio e la velocità di punta approccio influenzare anche la forza rivoluzionaria 15,16,18. Spettroscopia di forza è stato utilizzato per analizzare le proprietà di diverse fasi lipidiche 11,19, composizione-dipendente cambiamenti 12,20, così come gli effetti di altre biomolecole, quali peptidi, sulla stabilità della membrana 21. L&#39;orientamento piatta di bistrati supportati è vantaggioso per combinare AFM con altri metodi come la risonanza plasmonica superficiale 22 e microscopia a fluorescenza 11,19 per meglio caratterizzare struttura e le proprietà delle membrane. Questo video proto dettagliatacol lo scopo di preparare i doppi strati lipidici supportati con vescicole deposizione e analizzarli con AFM e spettroscopia di forza. Mentre vescicole di varie dimensioni possono essere usati per preparare bistrati, questo protocollo si concentra sulle piccole e grandi vescicole unilamellari. Bistrati supportati quella fase separano in liquido ordinato (L o) e disordinati (L d) fasi liquide sono state caratterizzate 11,15. La membrana è composta di-oleoyl-fosfatidilcolina (DOPC), sfingomielina (SM) e colesterolo (Chol) a 2: 2: 1 ratio. Questi modelli di composizione delle zattere lipidiche, che sono proposti a comportarsi come piattaforme importanti per il traffico di proteine ​​e di smistamento, segnalazione cellulare e altri processi cellulari 23,24.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850375P</td><td>Viene fornito sotto forma di polvere liofilizzata in fiale sigillate. Sciogliere tutta la polvere in cloroformio al momento dell'apertura. Conservare in eccesso sotto forma di film lipidici essiccati, in atmosfera inerte, a -20&nbsp; &deg;C. Visita <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; view=articolo& id=1679& Itemid=398">qui</a> per ulteriori informazioni sullo stoccaggio e la movimentazione.</td></tr><tr><td>Sfingomielina (cervello, suino)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>860062P</td><td>Viene fornito sotto forma di polvere liofilizzata in grandi contenitori di plastica sigillati. Sciogliere una punta di spatola di polvere in polvere nel cloroformio al momento dell'apertura. Conservare in eccesso sotto forma di film lipidici essiccati, in atmosfera inerte, a -20&nbsp; &deg;C. Visita <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; view=articolo& id=1679& Itemid=398">qui</a> per ulteriori informazioni sullo stoccaggio e la movimentazione.</td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>700000P</td><td>Viene fornito come polvere liofilizzata in grandi contenitori di plastica sigillati. Sciogliere una punta di spatola di polvere in polvere nel cloroformio al momento dell'apertura. Conservare in eccesso sotto forma di film lipidici essiccati, in atmosfera inerte, a -20&nbsp; &deg;C. Visita <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; view=articolo& id=1679& Itemid=398">qui</a> per ulteriori informazioni sullo stoccaggio e la movimentazione.</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl), 99,8%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl), 88%</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Idrogenofosfato di sodio (Na2HPO4), >99%</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Diidrogenofosfato di potassio (KH2PO4), 99%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato (CaCl2), grado di biologia molecolare</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, grado di biologia molecolare</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti, 24&nbsp; x&nbsp; 60&nbsp; mm, 1&nbsp; mm di spessore</td><td>Duran Group</td><td>2355036</td><td></td></tr><tr><td>punzone e matrice Set</td> prodotti <td>di marca di precisione, Inc</td><td>40105</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo ottico</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA 88</td><td>Adesivo liquido che si indurisce quando viene polimerizzato sotto la luce UV a lunga lunghezza d'onda.</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Mica blocca</td><td>NSC Mica Exports Ltd.</td><td></td><td>Si tratta di pezzi di mica di almeno 1 pollice quadrato di area e spessore che varia da 0,006 pollici a 0,016 pollici. Vengono tagliati a una dimensione specifica dall'azienda per la spedizione. Piccoli dischi di mica possono essere perforati dai blocchi di mica utilizzando il set di punzoni e matrici. Maneggiare sempre la mica con guanti o pinzette.</td></tr><tr><td>Attrezzature da laboratorio Grasso</td><td>Piralide Chemie AG</td><td>Glisseal N</td><td></td></tr><tr><td>Estrusore di liposomi</td><td>Avestin</td><td>LiposoFast-Basic</td><td>In alternativa si possono anche guardare le offerte di Northern Lipids, Inc.</td></tr><tr><td>Nastro adesivo</td><td>3M</td><td>Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1 pollice)</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore da bagno</td><td>Bandelin Sonorex Digitec</td><td>DT-31</td><td>Nessun riscaldamento, Frequenza: 35 kHz, Uscita di picco ultrasonica: 160 W, Potenza HF: 40 W. (<a href="http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf">Scheda tecnica</a>)</td></tr><tr><td>Nitruro di silicio AFM Cantilever&nbsp;</td><td>Sonde Bruker AFM</td><td>DNP-10</td><td>Ogni cantilever ha quattro punte e il loro raggio nominale della punta è di 20 nm (con un massimo possibile a 60&nbsp; nm). In base alle specifiche, utilizziamo la punta D con frequenza di risonanza di 18 kHz e costante nominale della molla di 0,06 N/m.</td></tr><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>JPK Nanowizard II montato su Zeiss Axiovert 200</td><td></td></tr></tbody></table>

atomic force microscopy imaging e spettroscopia forza supportati doppi strati lipidici

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

La microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica di imaging versatile e ad alta risoluzione che consente la visualizzazione delle membrane biologiche. Ha un ingrandimento sufficiente per esaminare le sottostrutture della membrana e persino le singole molecole. L'AFM può fungere da sonda di forza per misurare le interazioni e le proprietà meccaniche delle membrane. I doppi strati lipidici supportati sono convenzionalmente utilizzati come modelli di membrana negli studi AFM. In questo protocollo, dimostriamo come preparare i doppi strati supportati e caratterizzare la loro struttura e le proprietà meccaniche utilizzando l'AFM. Questi includono lo spessore del doppio strato e la forza di sfondamento. 
Le informazioni fornite dall'imaging AFM e dalla spettroscopia di forza aiutano a definire le proprietà meccaniche e chimiche delle membrane. Queste proprietà svolgono un ruolo importante nei processi cellulari come il mantenimento dell'emostasi cellulare dallo stress ambientale, l'unione delle proteine di membrana e la stabilizzazione dei complessi proteici.

Doppi strati lipidici supportati composto da DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) sono state visualizzate con AFM (Figura 2 AC). A causa della composizione lipidica, sono stati osservati SM / Chol-ricchi L DOPC ricchi fasi L d oe. Il profilo altezza da immagini AFM può fornire importanti informazioni sulla struttura della membrana. Osservando il profilo altezza, lo spessore doppio strato può essere misurato in presenza di difetti nella membrana (Figura 2B), ovvero la differenza di altezz...

Descriviamo un protocollo per la preparazione di doppi strati lipidici supportati e la sua caratterizzazione utilizzando la microscopia a forza atomica e la spettroscopia a forza.

Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di acquisire immagini e analizzare le proprietà fisiche di membrane con separazione di fase mediante microscopia a forza atomica. Questo risultato si ottiene innanzitutto mescolando dilio, fosfatidilcolina, fgo, mielina e colesterolo in un rapporto di due a due a uno per formare una miscela lipidica con separazione di fase. Successivamente, i bilayer lipidici supportati vengono preparati depositando la sospensione di liposomi su una superficie in MICA mediante microscopia a forza atomica.Successivamente viene eseguita la scansione della superficie del doppio strato, producendo un'immagine topografica in cui possono essere misurate caratteristiche strutturali come l'altezza. In seguito, viene effettuata una spettroscopia a forza su aree specifiche del doppio strato per analizzare le proprietà fisiche del bilayer, in particolare la forza di penetrazione e lo spessore della membrana. Alla fine, i risultati mostrano differenze nelle proprietà tra diverse fasi lipidiche in base a immagini di microscopia a forza e curve di forza.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia a fluorescenza, è l'aumento della risoluzione e la possibilità di esaminare ulteriori proprietà mediante un microscopio a forza (FM) sul campione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biofisica, come la struttura delle membrane biologiche e delle proteine incorporate in tali membrane. Inoltre, possiamo anche analizzare le proprietà fisiche della membrana e monitorare come variazioni nella composizione o l'aggiunta di agenti attivi sulla membrana possano modificare tali proprietà.Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà a causa della natura fragile del campione. Ciò ha implicazioni sulla preparazione del campione, sulla scelta della manipolazione delle leve e sulle condizioni di imaging e spettroscopia in FM. Iniziare sciogliendo DOPC, spino, mielina e colesterolo nel cloroformio alle concentrazioni desiderate. Quindi combinare 18,38 microlitri di DOPC, 17,1 microlitri di mielina e 11,3 microlitri di colesterolo per ottenere una soluzione contenente un milligrammo di lipidi totali e un rapporto molare rispettivamente di due a due a uno.Mescolare una soluzione mediante vortex, asciugare la miscela utilizzando un gas inerte come l'azoto, quindi proseguire l'essiccazione sotto vuoto per almeno un'ora. Successivamente, sciogliere i lipidi essiccati in 100 microlitri di PBS fino a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro. Eseguire il vortex della miscela energeticamente per circa un minuto.Per ottenere una sospensione torbida contenente vescicole multilamellari. Assicurarsi che nessun film lipidico rimanga attaccato alle pareti del vial. Prelevare 10 microlitri della sospensione lipidica multilamellare e aggiungere 150 microlitri di tampone per bicouche lipidiche supportate.Quindi mescolare una soluzione e trasferirla in una piccola provetta di vetro da due millilitri con tappo, sigillarla con pellicola parafilm e sottoporla a sonicazione. Sonicare la miscela a temperatura ambiente in un bagno sonico per 10 minuti. Durante questo periodo, la soluzione dovrebbe diventare limpida e produrre piccole vescicole uni o con un diametro di circa 50 nanometri.Lavare le lamelle di vetro in acqua, seguito da etanolo, quindi lasciarle asciugare all'aria. Successivamente, prendere i dischi di MICA e rimuovere lo strato esterno utilizzando nastro adesivo. Fissare il disco di MICA a una lamella mediante una goccia di colla trasparente otticamente trasparente.Quindi, fissare dei cilindri di plastica alla MICA utilizzando grasso da vuoto, assicurandosi che non vi siano perdite. Pipettare direttamente l'intera soluzione di liposomi sulla mica e aggiungere ulteriori 140 microlitri di tampone per bicouche lipidiche supportate per raggiungere un volume totale di 300 microlitri. Successivamente, aggiungere 0,9 microlitri di soluzione di cloruro di calcio uno molare per ottenere una concentrazione finale di tre millimolare di calcio, incubare i campioni per due minuti a 37 gradi Celsius e quindi per almeno 10 minuti a 65 gradi Celsius; in questa fase, preriscaldare anche il tampone per bicouche lipidiche supportate a 65 gradi Celsius.Aggiungere tampone se necessario per assicurarsi che il campione non si secchi. Coprire la camera del campione con un vetrino coprioggetto per mantenere il campione idratato. Quindi risciacquare delicatamente il campione con il tampone pre-riscaldato per il layer lipidico 10-15 volte per rimuovere il calcio e le vescicole non fuse.Prestare particolare attenzione durante i passaggi di lavaggio per evitare che il bicammino si secchi dopo i lavaggi. Raffreddare i bicammini supportati a temperatura ambiente. Prima delle misurazioni al microscopio a forza atomica, preparare il microscopio a forza atomica o un FM per eseguire l'immagine dei bicammini lipidici in soluzione.Utilizzando la modalità a contatto secondo le specifiche del produttore, aggiungere tampone al campione per mantenerlo immerso nel tampone durante tutto l'esperimento. Montare il campione sullo stadio di AFM e assicurarsi che tutti i moduli di isolamento dalle vibrazioni siano accesi. Attendere almeno 15 minuti per consentire al sistema di raggiungere l'equilibrio e ridurre la deriva termica.Successivamente, avvicinarsi al campione in modalità contatto utilizzando una punta a mensola FM morbida fino a quando non viene stabilito il contatto. Poiché i bicchieri lipidici sono molto fragili, ridurre al minimo il punto di regolazione della punta AFM durante l'acquisizione in modalità contatto, in modo da mantenere la forza al minimo e correggere la deriva termica pur conservando il contatto con il campione. Al termine dell'acquisizione, elaborare le immagini adattando ogni linea di scansione a funzioni polinomiali di livellamento.Eseguire la rimozione delle linee per le scansioni che perdono il contatto con la membrana. Utilizzando il software proprietario della società produttrice dell'AFM, calibrare la mensola seguendo il protocollo del produttore al fine di determinare la corretta conversione del segnale elettrico in una misura di forza. Dopo aver acquisito un'immagine di un'area del bistrato, selezionare una regione di cinque micron per cinque micron all'interno del bistrato per eseguire la spettroscopia di forza.Configurare gli AFM in modo che acquisiscano curve di forza in una griglia 16 per 16 di quella regione, ottenendo 256 curve di forza per regione. Successivamente, impostare lo spostamento del piatto Z a 400 nanometri. Questo determina il massimo intervallo di movimento del piatto z e garantisce che la cantilever si ritragga completamente dal campione tra una misurazione e l'altra.Impostare successivamente la velocità di avvicinamento a 800 nanometri al secondo e la velocità di ritrazione a 200 nanometri al secondo. Impostare inoltre la forza massima target per ogni curva di forza, in questo caso 12 nanoNewton. Dopo aver configurato tutti i parametri, acquisire le curve di forza premendo il pulsante di esecuzione del software A FM.Acquisire almeno 500 curve di forza per ogni condizione per garantire una buona statistica, tracciare un istogramma dei valori e quindi adattare gli istogrammi a una distribuzione gaussiana per ottenere il picco e la larghezza della distribuzione. A causa della composizione lipidica utilizzata in questo studio, si formano due principali regioni della membrana. Esiste una regione liquida ordinata composta da fing, mielina e colesterolo, e una regione liquida disordinata composta principalmente da DOPC.Il profilo di altezza ottenuto dall'immagine in AFM può fornire informazioni importanti sulla struttura della membrana analizzando il profilo di altezza. Lo spessore del doppio strato può essere misurato sfruttando la presenza di difetti nella membrana. La mappa di altezza può inoltre essere utilizzata per misurare la differenza di altezza tra le fasi ordinate e disordinate.Le curve di forza ottenute dalla modalità di spettroscopia di forza vengono utilizzate per misurare la forza di rottura individuando il valore di forza al picco della curva di forza, come mostrato qui. Inoltre, lo spessore della membrana può essere ricavato sottraendo il valore di distanza corrispondente al picco della curva di forza dal valore di distanza a cui la curva di forza inizia nuovamente a salire. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere costante la soluzione di stratificazione B e di monitorare costantemente l'assemblaggio FM per correggere gli effetti alla deriva termica e all'accumulo di D sulla punta, seguendo questa procedura.Altri metodi come la microscopia confocale a fluorescenza possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio sulle dinamiche della membrana. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare bilayer sostenuti e utilizzare un microscopio a forza (FM) per acquisire immagini e studiare le proprietà fisiche di questi bilayer.

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In questo video, dimostriamo le interazioni proteina-fosfoinositide in un modello microfluidico utilizzando il saggio di modulazione del pH, utilizzando un colorante fluorescente sensibile al pH etichettato con il lipide fosfatidiletanolammina di un doppio strato lipidico supportato, chiamato piattaforma microfluidica. Le modulazioni del pH dopo il legame delle proteine con i fosfolipidi causano l'estinzione della fluorescenza.

Saggio di modulazione del pH su doppi strati lipidici supportati per rilevare le interazioni proteina-fosfoinositide

Vi presentiamo un metodo di preparazione mica supportato doppi strati lipidici per microscopia ad alta risoluzione. Mica è trasparente e piatto su scala atomica, ma raramente usata nell'imaging a causa della difficoltà di manipolazione; nostra preparazione comporta anche deposizione del foglio di mica, e riduce il materiale utilizzato nella preparazione bistrato.

Preparazione di Mica supportati doppi strati lipidici per alta risoluzione microscopia ottica Imaging

Viene presentato un protocollo per accoppiare covalentemente una grande varietà di singole molecole su una punta AFM. Vengono fornite procedure ed esempi per determinare la forza di adesione e l'energia libera di queste molecole su supporti solidi e bio-interfacce.

Indagare singola molecola di adesione da Atomic Spectroscopy Forza

Presentiamo un protocollo sperimentale per formare un doppio strato lipidico supportato su substrati solidi senza utilizzare vescicole lipidiche. Si dimostra un metodo di uno stadio per formare un doppio strato lipidico di diossido di silicio e oro così come membrane supportate con dominio colesterolo arricchita per varie applicazioni biologiche.

Biomembrane Fabrication dal solvente assistita doppio strato lipidico (SALB) Metodo

Qui sono mostrati la preparazione di doppi strati lipidici planari supportati da vetro funzionalizzati con proteine, la determinazione della mobilità proteica all'interno e la misurazione delle densità proteiche. Viene delineata una tabella di marcia per la costruzione di un microscopio a riflessione interna totale a rumore ridotto, che consente di visualizzare fluorocromi residenti a doppio strato con un'elevata risoluzione spaziotemporale.

Singola molecola microscopia a fluorescenza su Planar bilayers supportati

Qui, vi presentiamo un protocollo per rilevare, eventi di fusione singoli SNARE-mediata tra liposomi e bistrati supportati in canali microfluidica utilizzando TIRFM polarizzata, con sensibilità singola molecola e ~ 15 risoluzione temporale msec. Lipidi e il rilascio del carico solubili possono essere rilevati simultaneamente. dimensioni liposomi, diffusività dei lipidi, e poro di fusione proprietà sono misurate.

Fusion SNARE-mediata del singolo proteoliposomi con bilayers Tethered supportati in una cella di flusso Microfluidic monitorati da polarizzata microscopia TIRF

Vi presentiamo un metodo per ottenere immagini a risoluzione sub-nanometrica con (modalità tapping) modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in un liquido. Il metodo è dimostrata su microscopi commerciali a forza atomica. Spieghiamo la logica alla base delle nostre scelte di parametri e di suggerire strategie per l'ottimizzazione risoluzione.

Sub-nanometrica Resolution Imaging con modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in Liquid

Questo documento descrive i protocolli per la preparazione dei campioni, la riduzione dei dati e l'analisi dei dati negli studi NSE (Neutron Spin Echo) delle membrane lipidiche. L'etichettatura giudiziosa dei lipidi al deuterio consente l'accesso a diverse dinamiche di membrana su scale di lunghezza e tempo mesoscopiche, su cui si verificano processi biologici vitali.

Spettroscopia eco-spin neutronica come sonda unica per la dinamica della membrana lipidica e le interazioni membrana-proteina

Questo protocollo descrive la formazione di vescicole unilipidiche e multilipidiche, doppi strati lipidici supportati e doppi strati lipidici sospesi. Questi modelli in vitro possono essere adattati per incorporare una varietà di tipi di lipidi e possono essere utilizzati per studiare varie interazioni molecolari e macromolecole.

Assemblaggio di modelli di doppio strato lipidico supportati e sospesi per lo studio delle interazioni molecolari

La quantificazione dell'area di contatto e della forza applicata dalla punta di una sonda a forza atomica (AFM) su una superficie del campione consente la determinazione delle proprietà meccaniche su scala nanometrica. Vengono discusse le migliori pratiche per implementare la nanoindentazione basata su sbalzo AFM in aria o fluido su campioni morbidi e duri per misurare il modulo elastico o altre proprietà nanomeccaniche.

Microscopia a forza atomica Nanoindentazione basata su sbalzo: misure di proprietà meccaniche su scala nanometrica in aria e fluido

Viene presentato un protocollo sperimentale per assemblare, stimolare elettricamente e analizzare i bilayer di interfaccia gocce dopate con gramicidina A. Le relazioni struttura-funzione lipido-proteina sono quantificate misurando le variazioni nell'area della membrana, nel flusso ionico e nella conduttanza a canale singolo, e collegando queste risposte a cambiamenti simili alla plasticità nella conduzione ionica in un modello di membrana ispirato alle sinapsi elettriche.

Caratterizzazione della struttura e funzione della membrana lipido-proteina utilizzando i bistrati dell'interfaccia delle gocce

Scopri come preparare doppi strati lipidici supportati e caratterizzarne le proprietà meccaniche con microscopia a forza atomica. Questo metodo consente imaging ad alta risoluzione e spettroscopia forza per studiare membrane biologiche.

Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici

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