Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di visualizzare e sondare le proprietà fisiche delle membrane di separazione di fase utilizzando la microscopia a forza atomica. Ciò si ottiene mescolando prima dilio, fosfatidilcolina, fgo, mielina e colesterolo in un rapporto di due a due a uno per formare una miscela lipidica di separazione di fase. Successivamente, i doppi strati lipidici supportati vengono preparati depositando la sospensione liposomica in una superficie di MICA utilizzando la microscopia a forza atomica.

La superficie del doppio strato viene quindi scansionata, producendo un'immagine topografica in cui è possibile misurare le caratteristiche strutturali come l'altezza. La spettroscopia di forza successiva viene eseguita su aree specifiche del doppio strato per sondare le proprietà fisiche del doppio strato, in particolare la forza di rottura e lo spessore della membrana. In definitiva, i risultati mostrano differenze nelle proprietà tra le diverse fasi lipidiche sulla base di immagini FM e curve di forza.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia a fluorescenza, è l'aumento della risoluzione e delle proprietà aggiuntive che un FM può sondare sul campione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biofisica, come la struttura delle membrane biologiche e le proteine incorporate su tali membrane. Inoltre, possiamo anche esaminare le proprietà fisiche della membrana e monitorare come i cambiamenti nella composizione o l'aggiunta di agenti attivi di membrana potrebbero modificare queste proprietà.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della natura fragile del campione. Ciò ha implicazioni sulla preparazione del campione, sulla manipolazione, sulla scelta dei cantilever e sulle condizioni di imaging e spettroscopia FM Iniziare sciogliendo DOPC, spino, mielina e colesterolo in cloroformio alle concentrazioni desiderate. Quindi combina 18,38 microlitri di DOPC, 17,1 microlitri di mielina e 11,3 microlitri di colesterolo per ottenere una soluzione con un milligrammo di lipidi totali e un rapporto molare di due a due a uno, rispettivamente.

Mescolare una soluzione per vortice, asciugare la miscela utilizzando un gas inerte come l'azoto, quindi asciugarla ulteriormente sotto vuoto per almeno un'ora. Successivamente, sciogliere i lipidi essiccati in 100 microlitri di PBS a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro. Agitare per amalgamare energicamente per circa un minuto.

Per ottenere una sospensione torbida contenente vescicole multi laminari. Assicurarsi che non rimangano pellicole lipidiche attaccate ai lati del flaconcino. Prelevare 10 microlitri di sospensione lipidica multilaminare e aggiungere 150 microlitri di tampone lipidico a doppio strato supportato.

Quindi mescolare una soluzione e trasferirla in una piccola fiala di vetro da due millilitri con tappo e sigillarla con parafilm sonicato. La miscela a temperatura ambiente in un bagno sonica per 10 minuti. Durante questo periodo, la soluzione dovrebbe diventare limpida e produrrà piccole uni o vescicole con un diametro di circa 50 nanometri.

Lavare i vetrini di copertura in acqua seguita da etanolo, quindi lasciarli asciugare all'aria. Quindi, prendi i dischi di Micah e stacca lo strato esterno usando del nastro adesivo. Attaccare il disco MICA a un vetrino coprioggetto utilizzando una goccia di colla trasparente otticamente trasparente.

Quindi fissare i cilindri di plastica alla MICA utilizzando grasso per vuoto e assicurarsi che non vi siano perdite. Versare l'intera soluzione liposomica direttamente sulla mica e aggiungere altri 140 microlitri di tampone lipidico a doppio strato supportato per raggiungere un volume di 300 microlitri. Successivamente, aggiungere 0,9 microlitri di una soluzione molare di cloruro di calcio per raggiungere una concentrazione finale di tre millimolari di calcio, incubare i campioni per due minuti a 37 gradi Celsius e quindi per almeno 10 minuti a 65 gradi Celsius durante questa fase, preriscaldare anche il tampone a doppio strato lipidico supportato a 65 gradi Celsius.

Se necessario, aggiungere un tampone per garantire che il campione non si asciughi. Coprire la camera del campione con un vetrino coprioggetto manterrà anche il campione idratato. Quindi sciacquare delicatamente il campione con il lipide supportato da preriscaldare con uno strato di tampone da 10 a 15 volte per rimuovere il calcio e le vescicole non fuse.

Prestare particolare attenzione durante le fasi di lavaggio per evitare che il doppio strato si asciughi dopo le fasi di lavaggio. Raffreddare i doppi strati supportati a temperatura ambiente. Prima delle misurazioni sul microscopio a forza atomica, impostare il microscopio a forza atomica o un FM per eseguire l'imaging dei doppi strati lipidici in una soluzione.

Utilizzando la modalità di contatto in conformità con le specifiche del produttore, aggiungere un tampone al campione per mantenerlo immerso nel tampone durante l'intero esperimento. Montare il campione sullo stadio A FM e assicurarsi che tutti i moduli di isolamento dalle vibrazioni siano accesi. Attendere almeno 15 minuti affinché il sistema si equilibri e riduca la deriva termica.

Quindi, avvicinarsi al campione in modalità contatto con una punta morbida a sbalzo FM fino a quando non viene stabilito il contatto. Poiché i doppi strati sono molto fragili, ridurre al minimo il set point della punta A FM durante l'imaging in modalità contatto per mantenere la forza al minimo e correggere la deriva termica mantenendo il contatto con il campione. Una volta completata l'imaging, elaborare le immagini adattando ciascuna linea di scansione alle funzioni di livellamento polinomiale.

Eseguire la rimozione della linea per le scansioni che perdono il contatto con la membrana. Utilizzando il software proprietario dell'azienda produttrice di A FM, calibrare il cantilever seguendo il protocollo del produttore al fine di determinare la corretta conversione del segnale elettrico in una misura di forza. Dopo aver acquisito l'imaging di un'area del doppio strato, selezionare una regione di cinque micron per cinque micron nel doppio strato per eseguire la spettroscopia di forza.

Imposta gli AFM in modo che prenda le curve di forza in una griglia 16 per 16 di quella regione, risultando in 256 curve di forza per regione. Quindi impostare lo spostamento Z piso a 400 nanometri. Questo determina il campo massimo di movimento del piezo z e garantisce che il cantilever si sia completamente ritirato dal campione tra una misurazione e l'altra.

Successivamente, impostare la velocità di avvicinamento a 800 nanometri al secondo e la velocità di ritrazione a 200 nanometri al secondo. Impostare anche la forza target massima per ciascuna curva di forza, in questo caso, 12 nano Newton. Dopo aver impostato tutti i parametri, acquisire le curve di forza premendo il pulsante di esecuzione del software A FM.

Acquisisci almeno 500 curve di forza per ogni condizione per garantire buone statistiche, traccia un istogramma dei valori e poi adatta gli istogrammi a una distribuzione gaussiana per ottenere il picco e l'ampiezza della distribuzione. A causa della composizione lipidica utilizzata in questo studio, si formano due regioni principali della membrana. C'è una regione liquida ordinata che è composta da fing, mielina e colesterolo e una regione liquida disordinata che è composta principalmente da DOPC.

Il profilo altimetrico dell'imaging A FM può fornire informazioni importanti sulla struttura della membrana osservando il profilo altimetrico. Lo spessore del doppio strato può essere misurato utilizzando la presenza di difetti della membrana. La mappa delle altezze può essere utilizzata anche per misurare il dislivello tra le fasi ordinate e disordinate.

Le curve di forza derivate dalla modalità di spettroscopia di forza vengono utilizzate per misurare la forza di rottura eseguendo il vining del valore della forza al picco della curva di forza, come mostrato qui. Inoltre, lo spessore della membrana può essere derivato sottraendo il valore della distanza dal picco della curva di forza al valore della distanza. Quando la curva di forza inizia a salire di nuovo, durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere la soluzione di stratificazione B e monitorare costantemente l'assemblaggio FM per correggere gli effetti della deriva termica e dell'accumulo di D sulla punta Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come la microscopia a fluorescenza confocale, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come la dinamica delle membrane. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come prepararti supportato da strati e utilizzare un FM per visualizzare e indagare le proprietà fisiche di questi doppi strati.