Name: Generazione di locali oscillazioni CA1 γ di Tetanic Stimolazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Impara a preparare fette cerebrali acute per registrare oscillazioni gamma CA1 come modello di eccitabilità neuronale. Questo metodo elettrofisiologico consente di valutare gli effetti dei farmaci sulla funzione di rete e di studiare i meccanismi delle malattie neurogenetiche.

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Supportato da APA a RJH, 400121 di sovvenzioni del programma NHMRC a SP e borse di studio NMHRC 1005050 a SP. CAR riconosce il supporto dell'ARC (FT0990628) e del programma di borse di studio DOWD. Il Florey Institute of Neuroscience and Mental Health è supportato dai fondi infrastrutturali del governo dello Stato di Victoria.

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati approvati dal comitato etico animali Florey Institute. 1. Setup per il taglio Fette cervello <ol><li> Preparare una soluzione di taglio costituito da (mm) 125 colina-Cl, 2,5 KCl, CaCl 2 0.4, 6 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 20 D-glucosio saturata con gas CarboGen (95% O 2 -5 % 2 CO) e un liquido cerebrospinale artificiale (soluzione aCSF) registrazione composto (mM) 125 NaCl, KCl 2,5, 2 CaCl 2, MgCl 2 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 10 D-glucosio, saturata con CarboGen. Posizionare la soluzione di taglio su ghiaccio per mantenere il freddo. </li><li> Congelare circa 400 ml della soluzione di taglio e si fondono insieme con 100 ml di soluzione di taglio scongelato per creare una sospensione di ghiaccio. Bubble con CarboGen (95% O 2 -5% CO 2) ad una portata di circa 0,5 L / min attraverso piccoli ctubi Aliber o vetro sinterizzato per produrre un flusso costante ma gentile di bolle. </li><li> Preparare un becher da 250 ml con un inserto in maglia di nylon sollevata in cui verranno inseriti le fette di cervello. Riempire con aCSF per coprire la rete da circa 2 cm e bolla con CarboGen, assicurando che le bolle non disturbare direttamente l&#39;area della sezione possesso. E &#39;anche importante che non ci siano bolle d&#39;aria nel rete di nylon, così se presenti rimuoverli. Questo sarà camera di raccolta e si mantiene a RT (20 - 25 ° C). </li><li> Layout La strumenti sezionare tra cui un grosso paio di forbici, un piccolo paio di forbici, piccoli e grandi micro spatole, e grandi e piccole coppie di pinze e raffreddare su ghiaccio. Posizionare il blocco vibratome tessuto taglio sul ghiaccio su un quadrato di carta stagnola. Ottenere 2 pezzi di 6 cm carta filtro, una lama ad archetto, e un becher da 25 ml riempito con l&#39;impasto soluzione di taglio pure. </li><li> Riempire un secondo contenitore con ghiaccio, e c&#39;era un pezzo di tessuto paper sul ghiaccio e collocare un piatto di coltura di 12 cm da cima. Riempire il piatto cultura con taglio soluzione liquami ghiaccio e bolla con CarboGen. Questo è il contenitore in cui con essere eseguita la dissezione cerebrale. </li><li> Preparare il vibratome. Rimuovere un doppio lama di rasoio taglio fresco (usare una lama fresca ogni volta) dal suo involucro e spruzzare con l&#39;80% di etanolo acqua poi deionizzata. Tagliare a 3 ml pipetta di plastica al punto in cui inizia a cono. Questo verrà utilizzato per trasferire fettine cerebrali. Bend un ago G 27 alla base di circa 45 ° e legarsi a una siringa da 1 ml. Questo sarà usato per manipolare fette durante il taglio. </li></ol> 2. Taglio cervello Slices <ol><li> Anestetizzare un topo (P16 - P18) con il 2% isoflurano o un metodo approvato a livello locale. Dopo l&#39;induzione, decapitare il animale con un grosso paio di forbici e cadere la testa nel piatto cultura 12 centimetri che contiene bollito soluzione di taglio liquami. La sospensione deve immergere totalmente la testa perraffreddamento rapido. </li><li> Tenere la parte anteriore della testa con una mano peeling la pelle e il tessuto connettivo in avanti verso il naso. Utilizzando le piccole forbici tagliate il tessuto connettivo per rivelare il teschio sottostante. Quindi rimuovere i muscoli sovrastanti parte dorsale del cranio e del collo. </li><li> Rimuovere il cervello dal cranio dapprima fissare la parte anteriore del cranio con le pinze grandi e quindi fare due tagli laterali attraverso l&#39;osso entrambi i lati del foro occipitale utilizzando le forbici piccole (Figura 1, tagli etichettati A1 e A2). <ol><li> Fare un altro taglio tra gli occhi (solo anteriore del bregma) (Figura 1, taglio etichetta B) poi accuratamente tagliare lungo la sutura sagittale anteriormente e riflettere le sezioni di taglio del cranio per rivelare il cervello (Figura 1, taglio C marcato). </li><li> Utilizzare la piccola spatola per scavare il cervello e posto su un piatto di coltura. Siate consapevoli del crannervi IAL sulla faccia inferiore del cervello che dovranno essere tagliati, questo può essere fatto utilizzando la dimensione micro spatola più piccoli. Uso spatola il più grande trasferimento cervello al bicchiere da 25 ml riempito con il liquame soluzione di taglio. </li></ol></li><li> Preparare l&#39;emisfero cerebrale per affettare. <ol><li> Posizionare un pezzo di carta da filtro 6 cm sul fondo di un piatto di coltura fresco quindi riempire con soluzione di taglio fresco slurry e bolla. Utilizzare la spatola grande per posizionare il cervello, lato ventrale giù, sulla carta da filtro. Prendere un nuovo e pulito lama di rasoio singolo bordo e tagliare il cervello per rimuovere il cervelletto, poi fare un taglio lungo la linea di metà di separare il cervello in due emisferi. </li></ol></li><li> Preparazione del blocco dei tessuti vibratome. <ol><li> Prendete il blocco dei tessuti vibratome refrigerati, asciugare la superficie, e una goccia di colla cianoacrilato in mezzo e diffondere in modo uniforme la dimensione approssimativa del cervello. Utilizzare la piccola spatola per manipolare uno deiemisferi cerebrali sul grande micro spatola in modo che il lato mediale del cervello è giù. </li><li> Toccare il bordo della spatola all&#39;interfaccia del cervello sul secondo pezzo di carta da filtro per rimuovere la maggior quantità della soluzione possibile. Far scorrere il cervello al largo delle spatola di grosse dimensioni con la spatola più piccolo per guidarla sulla colla. </li><li> Fissare il blocco di taglio nella camera vibratome e riempire la camera con soluzione di taglio liquami e bolla, assicurando il cervello è completamente immersa. Ruotare il blocco di taglio in modo che il lato ventrale del cervello si trova ad affrontare la lama. </li></ol></li><li> Affettare il cervello. Nota: Ogni vibratome è unica in modo da seguire le istruzioni del produttore. <ol><li> Impostare lo spessore della fetta a 450 micron, e di garantire la lama vibra mentre si muove attraverso il cervello ad una velocità di circa 0,3 mm / s. Tagliare interamente attraverso il cervello dal lato ventrale di superficie corticale, questo produrrà intero cervello fette sagittali che possono Be utilizzato per le registrazioni elettrofisiologiche. Fette saranno prodotti lateralmente medialmente e tipicamente 3 - 4 fette possono essere tagliati da ciascun emisfero. </li><li> Se la base della fetta ascensori utilizzare il piegato 27 ago G di stampa dolce fetta indietro. Poiché ogni fetta viene tagliata, utilizzare la pipetta di trasferimento per spostarlo sulla piattaforma nella camera di tenuta dove sono vitali per un massimo di 8 ore. </li></ol></li></ol> 3. extracellulari Elettrofisiologia Recordings <ol><li> Montaggio fetta nella camera di registrazione. <ol><li> Usando la pipetta di trasferimento, posizionare una fetta cervello in una camera di registrazione sommerso perfuso con aCSF scorre a 1 - 2 ml / min e riscaldata a 32 ° C. Il aCSF utilizzato per le registrazioni differisce da quella nella camera di tenuta come la concentrazione di Mg 2+ è aumentato da 2 mM a 4 mM. </li><li> Fissare la fetta con un &quot;arpa&quot; (acciaio inox semi circolare con fili di nylon tesi attraverso a 2-3 mm di distanza). Luogol&#39;arpa in modo che i fili paralleli a CA1. Aumentare la velocità di perfusione a 8 - 10 ml / min a 32 ° C. </li></ol></li><li> Sotto un microscopio da dissezione posto un elettrodo stimolante e un elettrodo di registrazione (elettrodo di vetro riempita con la soluzione di registrazione aCSF) sulla superficie del radiatum strato della CA1 (Figura 2A). Posizionare l&#39;elettrodo stimolante prima poi posto l&#39;elettrodo di registrazione. </li><li> Stimolare la Schaffer dei collaterali con un 120 - 150 μA di ampiezza e 0,1 msec impulso di prova della durata e osservare il conseguente campo posta eccitatorio sinaptica potenziale (fEPSP) forma d&#39;onda per determinare la salute fetta (Figura 2B). Gli elettrodi stimolanti e di registrazione possono avere bisogno di essere spostato nella fetta di circa 50 - 100 micron dalla superficie fetta di ottenere la registrazione di un fEPSP con una piccola fibra volley e grande ampiezza. La garanzia Schaffer evocato fEPSPs sono stereotipati e di fornire un buon indicatore della salute fetta. HEalthy fette mostrano tipicamente una fibra volley per fEPSP rapporto di ampiezza inferiore a 0,3. </li><li> Riposizionamento gli elettrodi. <ol><li> Utilizzando un microscopio da dissezione, spostare l&#39;elettrodo stimolante mezzo delle oriens falda e spostare l&#39;elettrodo di registrazione per lo strato di cellule piramidali più vicino all&#39;elettrodo di registrazione come possibile, come mostrato nella Figura 3A. Gli elettrodi stimolanti e registrazione possono dover essere spinto nella fetta di circa 50 - 100 micron in modo che la risposta di ampiezza fEPSP al 120 - 150 μA impulso di prova è di circa 1 mV. </li></ol></li><li> Generazione di oscillazioni γ. <ol><li> Per generare oscillazioni γ stimolano il tessuto con un treno di 20 x 0,1 impulsi msec erogati a 200 Hz. Questo stimolo tetanica può produrre risposte riproducibili al momento della consegna ogni 5 minuti. </li></ol></li><li> Utilizzare i seguenti parametri di registrazione. <ol><li> Scala il guadagno del segnale di uscita in modo che corrisponda alla tensione di ingressoil convertitore analogico-digitale. Assicurarsi che escursione segnale massimo previsto utilizza un minimo di 30% della tensione di ingresso. Fare attenzione quando si imposta guadagni per alta come segnali potrebbero tagliare. La larghezza di banda di riferimento necessario per le registrazioni sul campo è di 500 Hz con accoppiamento AC a 0,1 Hz per eliminare la deriva della linea di base. </li><li> Digitalizzare almeno 4 - 5 volte più veloce della frequenza di taglio del filtro passa basso per evitare segnale aliasing. </li></ol></li><li> Analisi dei dati. <ol><li> Dati filtro passa alto a 5 Hz a rimuovere eventuali spostamenti della linea di base. Identificare picchi utilizzando una soglia derivato, con una distanza minima evento di 10 msec, un tempo tipico evento di picco e l&#39;intervallo di regressione di 7 ms, una soglia di ~ 100 mV / msec, e una valle separazione del 100%. Calcolare la latenza come il tempo impiegato per il primo picco identificato si verifichi dopo la fine del manufatto stimolazione. Questa analisi consente per la caratterizzazione del numero di picchi, latenza intervallo inter-evento, e la durata calcolata comesegue: </li><li> Calcolare il numero di picchi come il numero totale di punte per oscillazione per ogni scansione è determinato. </li><li> Calcolare la latenza di oscillazione. Per ogni oscillazione, sottrarre il tempo del primo picco identificato dalla fine del manufatto stimolazione. </li><li> Calcola l&#39;intervallo di inter-evento media (ISI). Determinare il periodo di tempo tra più picchi rilevati e media. </li><li> Calcolare la durata di oscillazione. Misurare il tempo tra il primo e l&#39;ultimo picco rilevato all&#39;interno di ogni oscillazione. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Un metodo robusto per generare CA1 oscillazioni γ in fettine di cervello acuto è descritto. Le oscillazioni generate nascono da un circuito locale consente una migliore opportunità per il controllo e la comprensione della basi neurofisiologiche delle oscillazioni di rete 12. Recettori AMPA, recettori GABA A, I h e T-tipo Ca 2+ canali sono tutti necessari per oscillazioni γ in questo modello. Mentre le oscillazioni locali CA1 qui descritte possono essere generati robusto questo...

Oscillazioni di rete del cervello si verificano all&#39;interno di bande di frequenza distinte che sono correlate a stati comportamentali. Nei roditori, le oscillazioni θ dell&#39;ippocampo (5-10 Hz) sono osservate durante comportamenti esplorativi 1,2, mentre le oscillazioni γ (20 - 80 Hz) associato con i vari processi cognitivi, tra cui la percezione e l&#39;attenzione 3,4. Attività di rete γ sincrona è anche implicato nella patologia di disturbi come l&#39;epilessia e la schizofrenia 5,6. Ad esempio, le oscillazioni γ si pensa che corrispondono alle aree di corticali focolai epilettici 5,7,8 e potrebbero essere utilizzati come marcatori di pharmacosensitivity o di resistenza, due importanti aree di indagine nel campo della ricerca epilessia 9. La fetta cerebrale dell&#39;ippocampo è un modello che è stato ampiamente utilizzato per studiare l&#39;attività di rete 10-12. Sono stati sviluppati vari protocolli di generare oscillazioni γ in fettine cerebrali che tipicamente involve modulazione farmacologica quali partire Mg 2+, 4 aminopiridina (4AP), bicucullina, e acido kainico 12-17. Carenze di oscillazioni farmacologicamente innescate sono che si verificano casualmente dopo l&#39;applicazione della droga e non sono affidabile generati o stabile nel tempo. Elettricamente attivati ​​oscillazioni γ superare molti di questi problemi e hanno anche il vantaggio di essere temporalmente bloccato all&#39;evento stimolante che consenta la registrazione e l&#39;analisi episodica. Qui un protocollo è descritto per la generazione di oscillazioni CA1 γ fornendo una stimolazione tetanica alle Oriens falda nella fetta dell&#39;ippocampo.

<table><tbody><tr><td>4-(N-etil-N-fenilammino)-1,2-dimetil-6-(metilammino) pirimidinio cloruro (ZD7288)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z3777</td><td></td></tr><tr><td>Biucullina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14340</td><td></td></tr><tr><td>6-ciano-7-nitrochinossia- linea-2,3-dione (CNQX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C127</td><td></td></tr><tr><td>Nichel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>266965</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazepina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4024</td><td></td></tr><tr><td>(2R)-ammino-5-fosfonopentano-ato (APV)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Retigabine</td><td>ChemPacific</td><td>150812-12-7</td><td></td></tr><tr><td>Choline-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1879-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &bull; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 & toro; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodo in vetro</td><td>Harvard Apparatus&nbsp;</td><td>GC150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodo metallico concentrico bipolare stimolante&nbsp;</td><td>FHC</td><td>CBBPF75</td><td></td></tr><tr><td>Isolatore Digitale</td><td>Ottenendo Strumenti Modello</td><td>BJN8-9V1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore modello 1800</td><td>Sistemi A-M</td> Amplificatore <td></td><td>modello 1800</td></tr><tr><td>Digitalizzatore</td><td>Strumenti nazionali</td><td>NI USB-6211</td><td></td></tr><tr><td>Vibrotomo</td><td>Leica</td><td>VT1200s</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di locali oscillazioni ca1 γ di tetanic stimolazione

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Oscillazioni di rete neuronali sono caratteristiche importanti di attività cerebrale in salute e malattia e può essere modulata da una serie di farmaci usati clinicamente. Un protocollo è prevista per generare un modello per studiare oscillazioni CA1 γ (20 - 80 Hz). Queste oscillazioni γ sono stabili per almeno 30 minuti e dipendono attività sinaptica eccitatoria e inibitoria oltre all&#39;attivazione di correnti pacemaker. Oscillazioni Tetanically stimolati hanno una serie di caratteristiche riproducibili e facilmente quantificabili compresi conteggio picco, la durata di oscillazione, la latenza e la frequenza che riporta sullo stato della rete. I vantaggi delle oscillazioni stimolate elettricamente includono stabilità, riproducibilità e acquisizione episodica consentendo robusta caratterizzazione della funzione di rete. Questo modello di CA1 oscillazioni γ può essere usato per studiare i meccanismi cellulari e di indagare in modo sistematico come rete neuronale attività è alterata nella malattia e dalle droghe.Malattia stato farmacologia può essere facilmente integrato con l&#39;uso di sezioni di cervello di modelli animali geneticamente modificati o interventistiche per consentire la selezione di farmaci che colpiscono specificamente meccanismi di malattia.

Stimolazione tetanica dei Oriens falda generato robusti e riproducibili oscillazioni γ (35.4 ± 2.2 Hz), si veda la Figura 3B. Per dimostrare che le oscillazioni sono stati generati all&#39;interno della rete locale, CA1 fattori produttivi da CA3 furono recisi tagliando la fetta della regione CA2 con un&#39;inclinazione 32 ago G. Le proprietà di oscillazione nelle fette del taglio non differivano dalle fette tagliati (p = 0,85; tagliate a fette 6,16 ± 1,1 picchi, n = 6; fette tagliati 5,89 ± 0,8 picchi, ...

Oscillazioni sono proprietà di rete fondamentali e sono modulati dalla malattia e la droga. Studiare le oscillazioni cerebrali slice permette la caratterizzazione di reti isolate in condizioni controllate. I protocolli sono forniti per la preparazione di fettine di cervello acuto per evocare CA1 oscillazioni γ.

Generazione di locali oscillazioni CA1 γ di Tetanic Stimolazione

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare sezioni cerebrali per la registrazione di oscillazioni gamma extracellulari come modello di eccitabilità neuronale. Questo viene ottenuto innanzitutto rimuovendo il cervello dal cranio. Il secondo passaggio consiste nel raffreddare rapidamente il cervello in una soluzione CSF ghiacciata e nel tagliarlo in fette di 450 micron.Successivamente, trasferire una sezione nella camera di registrazione e posizionare l'elettrodo stimolante nello strato e un elettrodo di registrazione nello strato paramedial del CA1. L'ultimo passaggio consiste nell'indurre oscillazioni gamma e valutare l'impatto dei farmaci sull'eccitabilit&agrave; neuronale. In definitiva, la caratterizzazione delle oscillazioni gamma ippocampali viene utilizzata per mostrare gli effetti dei farmaci sulla funzione della rete neurale o per comprendere i meccanismi alla base della genesi delle malattie in patologie neurogenetiche.Questo metodo può essere utilizzato per ottenere informazioni sui meccanismi delle malattie in cui si verificano aumenti dell'eccitabilità della rete neuronale, come l'epilessia, l'autismo e l'Alzheimer, e può inoltre essere impiegato per studiare il meccanismo d'azione dei farmaci. Per iniziare questa procedura, preparare una camera di contenimento inserendo una rete di nylon rialzata in un becher da 250 millilitri. Successivamente, riempire il becher con un liquido cerebrospinale fino a coprire la rete di circa due centimetri e farvi gorgogliare carbogeno a temperatura ambiente.Assicurarsi che le bolle non disturbino direttamente l'area di contenimento della sezione. Quindi posizionare gli strumenti da dissezione, inclusa una grande forbice, una piccola forbice, una spatola microscopica piccola e una grande, e una pinzetta piccola e una grande, sul ghiaccio. Posizionare il blocco tagliente per tessuti Vibram raffreddato su un foglio di alluminio posto sul ghiaccio.Dopo questa riparazione, preparare due pezzi di carta da filtro di sei centimetri, una lametta a bordo singolo e un becher da 25 millilitri riempito con una sospensione di soluzione di taglio. Successivamente, riempire un secondo contenitore con ghiaccio per la dissezione del cervello. Posare un pezzo di carta da filtro sul ghiaccio e collocare sopra una piastra di coltura da 12 centimetri.Successivamente, riempire la piastra di coltura con una sospensione ghiacciata di soluzione per il taglio e saturare con carbogeno. In questa procedura, recidere la cute e il tessuto connettivo della testa in direzione del naso utilizzando le piccole forbici, tagliare il tessuto connettivo per esporre il cranio sottostante. Quindi rimuovere i muscoli sovrapposti alla faccia dorsale del cranio e del collo.Per rimuovere il cervello, fissare la parte anteriore del cranio con un paio di pinze grandi. Quindi effettuare due tagli laterali attraverso l'osso su entrambi i lati del rem e magnum. Successivamente, effettuare un altro taglio tra gli occhi appena anteriormente al bgma.Tagliare con attenzione lungo la sutura sagittale e riflettere le sezioni del cranio per esporre il cervello. Successivamente, utilizzare la spatola piccola per estrarre il cervello, avendo cura di recidere i nervi cranici. Posizionare il cervello in una piastra di coltura.Quindi trasferire il cervello in un becher da 25 millilitri riempito con sospensione di soluzione di taglio. Per preparare l'emisfero cerebrale al taglio, posizionare un pezzo di carta da filtro da sei centimetri sul fondo di una piastra per colture. Successivamente, riempirla con sospensione di soluzione di taglio fresca e saturare con car. Successivamente, posizionare il cervello con il lato ventrale rivolto verso il basso sulla carta filtro. Poi, rimuovere il cervelletto utilizzando una nuova e pulita lametta a bordo singolo. Effettuare un taglio lungo la linea mediana per separare i due emisferi.Per preparare il blocco di tessuto Vibram, asciugare la superficie della piattaforma di taglio del tessuto Vibram raffreddata. Posizionare una goccia di colla Sano ACRL al centro e distribuirla uniformemente fino a raggiungere le dimensioni approssimative del cervello. Utilizzare una spatola piccola per trasferire un emisfero su una spatola micros grande e posizionarlo in modo che il lato mediale del cervello sia rivolto verso il basso.Assorbire la soluzione del cervello con un pezzo di carta da filtro il più possibile. Quindi far scivolare il cervello dalla spatola più grande e utilizzare la spatola più piccola per guidarlo sulla colla. Successivamente, fissare la piattaforma di taglio alla camera del Vibram.Costruire la camera con la sospensione di soluzione di taglio in modo da coprire completamente il cervello e insufflare carbogeno nella soluzione. Ruotare quindi la piattaforma di taglio in modo che la faccia ventrale del cervello sia rivolta verso la lama. Tagliare il cervello in sezioni spesse 450 micrometri, effettuando il taglio dalla superficie ventrale a quella dorsale per ottenere sezioni sagittali complete del cervello da utilizzare per registrazioni elettrofisiologiche.Se la base della sezione si solleva, utilizzare un ago curvo da 27 gauge per premere delicatamente la sezione verso il basso. Quindi utilizzare la pipetta per trasferire la sezione nella camera di mantenimento. Tipicamente, da tre a quattro sezioni di ippocampo di Campbell possono essere ottenute da ciascun emisfero per montare la sezione nella camera di registrazione.Posizionare una sezione cerebrale in una camera di registrazione immersa, perfusa con un liquido cerebrospinale che scorre a una velocità di uno-due millilitri al minuto e riscaldato a 32 gradi Celsius. Il liquido cerebrospinale utilizzato per le registrazioni differisce da quello della camera di mantenimento poiché la concentrazione di magnesio è aumentata da due millimolari a quattro millimolari. Fissare la sezione posizionando un peso semicircolare in acciaio inossidabile sulla stessa, con i suoi filamenti paralleli all'ippocampo CA1.In seguito, aumentare la velocità della perfusione a otto-dieci millilitri al minuto a 32 gradi Celsius. Utilizzando un microscopio stereoscopico, spostare l'elettrodo stimolante al centro dello strato oriens. Quindi, spostare l'elettrodo di registrazione al livello parametrale il più vicino possibile all'elettrodo stimolante.Successivamente, abbassare sia l'elettrodo stimolante che quello di registrazione di 50-100 micrometri all'interno della sezione. Per generare un EPSP di campo di un millivolt in risposta all'impulso di prova di 120-150 microsecondi necessario a indurre oscillazioni gamma, stimolare il tessuto con una serie di 20 impulsi della durata di 0,1 millisecondi ciascuno, somministrati a 200 hertz. Questo stimolo intenso può produrre risposte riproducibili se somministrato ogni cinque minuti.Questo schema mostra la posizione dell'elettrodo stimolante nello strato orietans e dell'elettrodo di registrazione nello strato pyramidale del CA1. Ecco un esempio delle oscillazioni gamma indotte da stimolazione tetanica. Questa figura illustra il blocco farmacologico dei recettori AMPA con 20 micromolar CNQX, dei recettori GABAA con 20 micromolar bicucullina, della corrente IH con 20 micromolar zolpidem, dei canali del cloruro e dei canali del calcio di tipo T.Con 100 micromolar di nichel, ciascun agente è stato in grado di ridurre autonomamente il numero di potenziali d'azione generati. Questa preparazione è ideale per determinare l'azione farmacologica su scala di rete. La tina è un farmaco antiepilettico utilizzato clinicamente che apre i canali del potassio e riduce l'eccitabilità della membrana in bagno.L'applicazione della tina ha prodotto una riduzione dipendente dalla dose del numero di picchi durante la durata dell'oscillazione. Una volta acquisita padronanza, la preparazione di fette cerebrali e la dissezione per le registrazioni elettrofisiologiche possono essere eseguite in circa 10 minuti seguendo questa procedura. L'aggiunta di altri metodi, come le registrazioni con tecnica del patch clamp in modalità cella intera, può essere integrata per comprendere il ruolo dei singoli neuroni all'interno di una rete, sia in condizioni di malattia che dopo l'applicazione di farmaci.

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La preparazione di fettine cerebrali acute di ippocampo isolato, così come le registrazioni elettrofisiologiche simultanee di astrociti e neuroni...

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Questo video dimostra la procedura per indurre oscillazioni gamma CA1 locali in una fetta di cervello di topo ippocampale CA1 utilizzando simulazioni tetaniche. Questo metodo è importante per comprendere l'attività della rete neuronale.

Generazione di oscillazioni gamma locali di Cornu ammonis 1 (CA1) utilizzando stimolazioni tetaniche in una fetta di cervello ippocampale

Questo video mostra un metodo per registrare le risposte sinaptiche CA3-CA1 in una fetta di ippocampo di ratto. Delinea i passaggi necessari per posizionare gli elettrodi stimolanti e di registrazione sulla fetta ippocampale e misurare il potenziale postsinaptico eccitatorio di campo (fEPSP) per valutare la forza della risposta sinaptica.

Registrazione delle risposte sinaptiche CA3-CA1 in una fetta di ippocampo di ratto

Questo video dimostra il metodo per utilizzare l'optogenetica per modulare la dinamica della rete ippocampale attivando interneuroni sensibili alla luce geneticamente modificati in una fetta di cervello di topo, migliorando la sincronizzazione dell'oscillazione theta e studiando il comportamento dei circuiti neurali.

Controllo optogenetico della dinamica della rete ippocampale

Il nucleo pedunculopontine (PPN) si trova nel tronco cerebrale e le sue neuroni vengono attivati ​​al massimo durante gli stati di veglia e movimento rapido degli occhi (REM) del cervello sonno. Questo lavoro descrive l'approccio sperimentale di registrare in banda gamma di oscillazione membrana sottosoglia vitro in neuroni PPN.

Registrazione Gamma banda oscillazioni Pedunculopontine Nucleo neuroni

Qui presentiamo un protocollo per registrare la teoria ritmica della rete neuronale e le oscillazioni gamma da una preparazione interamente isolata di ippocampo. Descriviamo le fasi sperimentali dall'estrazione dell'ippocampo ai dettagli del campo, delle registrazioni a blocchi di patch patch unitari e intere cellule, nonché della stimolazione ottogenetica del ritmo theta.

Tuning nella Banda Theta Ippocampale<em&gt; In vitro</em&gt;: Metodologie per la registrazione dal circuito isolante di roditore Septohippocampal

Descriviamo l'uso di optogenetica e registrazioni elettrofisiologiche per manipolazioni selettive delle oscillazioni di teta hippocampal (5-10 Hz) in topi si comporta. L'efficacia di trascinamento ritmo è controllata mediante potenziali di campo locale. Una combinazione di opto - e farmacogenetica inibizione indirizzi la lettura efferente di sincronizzazione hippocampal.

Optogenetica trascinamenti di teta Hippocampal oscillazioni nel comportarsi topi

Questo protocollo descrive la registrazione dei potenziali di campo locale con Multi-Tibia punte in silicio lineare. Conversione dei segnali mediante analisi di densità di corrente sorgente consente la ricostruzione dell'attività elettrica locale nell'ippocampo del mouse. Con questa tecnica, le oscillazioni nello spazio limitato del cervello possono essere studiate in topi liberi di muoversi.

Registrazione spazialmente limitate oscillazioni nell'ippocampo dei topi di comportarsi

Modelli di sequestro acuta sono importanti per studiare i meccanismi alla base di eventi epileptiform. Inoltre, la capacità di generare eventi epileptiform su richiesta fornisce un metodo altamente efficiente per studiare l'esatta sequenza degli eventi alla base la loro iniziazione. Qui, descriviamo i modelli di sequestro corticale acuta 4-aminopiridina stabiliti nel tessuto umano e del mouse.

Iniziazione di generazione e On-Demand di attività Ictal acuta nel tessuto umano e del roditore

Qui presentiamo un protocollo per Ca2 + imaging in neuroni e cellule gliali, che consente la dissezione di Ca2 + segnali a risoluzione subcellulare. Questo processo è applicabile a tutti i tipi di cellulari che permettono l'espressione di codificato geneticamente indicatori di Ca2 + .

Dissezione del locale Ca2 + segnali in cellule coltivate di targeting per membrana Ca2 + indicatori

Abbiamo usato elettrodi di registrazione e stimolazione in fette di cervello ippocampali longitudinali e elettrodi di registrazione e stimolazione longitudinalmente posizionati nell'ippocampo dorsale in vivo per evocare potenziali post-ynaptici extracellulari e dimostrare plasticità sinaptica a lungo termine lungo l'interlamellar longitudinale CA1.

Studiare la plasticità sinaptica a lungo termine nell'Ippocampo Interlamellar CA1 di Electrophysiological Field Recording

Impara a preparare fette cerebrali acute per registrare oscillazioni gamma CA1 come modello di eccitabilità neuronale. Questo metodo elettrofisiologico consente di valutare gli effetti dei farmaci sulla funzione di rete e di studiare i meccanismi delle malattie neurogenetiche.

Generazione di locali oscillazioni CA1 γ di Tetanic Stimolazione

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