Implementazione di In Vitro Drug Resistance saggi: massimizzare il potenziale per scoprire clinicamente rilevanti Resistenza Meccanismi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di facilitare la rapida scoperta preclinica di varianti a singolo nucleotide clinicamente rilevanti che possono guidare funzionalmente la resistenza a varie classi di terapie. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo oncologico, come ad esempio quali mutazioni genetiche possono contribuire alla resistenza funzionale alle terapie in clinica che possono in ultima analisi guidare il miglioramento delle terapie e le strategie di gestione clinica alternative per i pazienti resistenti ai farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, poiché stiamo facilitando l'emergere di mutazioni spontanee e applicando una tecnologia di screening imparziale nei cloni resistenti, c'è una maggiore probabilità che queste varianti stiano guidando terapie mirate alla recidiva in clinica.

A dimostrare la procedura sarà un ricercatore di grande talento del mio laboratorio per valutare il GI 50 per le linee cellulari. Preparare una piastra di analisi seminando le cellule in trasparente non trasparente. Fondo 96 piastre a pozzetti in 100 microlitri di terreno cellulare secondo la mappa mostrata qui.

Preparare una piastra di controllo in modo simile, aggiungendo cellule ai pozzetti blu e solo medie ai pozzetti bianchi. Dopo aver incubato le piastre a 37 gradi Celsius per una notte, equilibrare il reagente di vitalità cellulare luminescente a temperatura ambiente e mescolare delicatamente invertendolo. Per ottenere una soluzione omogenea, aggiungere 80 microlitri di reagente ai pozzetti della piastra di controllo e agitare il contenuto per 30 minuti.

Per indurre la lisi cellulare. Utilizzare un luminometro con un'esposizione da 0,1 a 1,0 secondi e una lunghezza d'onda di rilevamento di 560 nanometri per registrare la luminescenza. Successivamente, per aggiungere i composti in esame alle piastre di analisi, eseguire una serie di diluizioni di una su quattro dei composti in DMSO a partire da una concentrazione di 2000 micromolari per un totale di 10 diluizioni.

Quindi aggiungere i composti diluiti in serie al terreno per ottenere una miscela di terreno composto a una concentrazione finale di 10 x. Conservare la piastra composta a meno 20 gradi Celsius per l'uso il terzo giorno del saggio. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di composti diluiti alle cellule in triplicato in modo tale che la dose più alta sia 10 micromolari.

Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per tre giorni. Il terzo giorno, preparare una miscela di 400 microlitri di composti composti utilizzando le piastre composte preparate tre giorni prima. Capovolgere le piastre di analisi per rimuovere il terreno e asciugare tamponando su carta assorbente in autoclave due o tre volte.

Aggiungere un composto x a pozzetti sfumati in blu e aggiungere 100 microlitri di terreno ai pozzetti perimetrali per evitare l'evaporazione. Il sesto giorno, valutare il numero relativo di cellule vitali effettuando la lettura della luminescenza come dimostrato in precedenza nel video. Quindi calcola i valori dell'IG 50 utilizzando software come PRISM utilizzando i valori dell'IG 50 calcolati per impostare le cellule per i saggi di resistenza ai farmaci.

Se si lavora con un agente citostatico, seminare le cellule al 30-40% di confluenza in piastre di coltura quadrate da 150 millimetri. Se si lavora con un agente tossico, vedere le celle al 70-80% di confluenza. Dopo aver determinato le concentrazioni iniziali dei composti secondo il protocollo di testo, trattare le cellule con i composti in esame per composti altamente tossici, che causano la morte cellulare in un test di vitalità di sei giorni.

Iniziare con l'IG 50 e aumentare gradualmente la concentrazione ogni due o tre settimane fino a quando non si osserva una robusta resistenza. Per isolare i cloni di singole cellule, utilizzare la microscopia a contrasto di fase con ingrandimento di 40x per esaminare la piastra di coltura e identificare gruppi vitali di cellule sul fondo della piastra. Utilizzare una penna per contrassegnare i cloni di dimensioni medie e ben isolati dalle altre colonie per prelevare i cloni utilizzando un pipettatore P 200.

Rimuovi il terreno di coltura dal piatto e usa un XPBS per sciacquare via le cellule galleggianti. Con la punta della pipetta, sollevare i cloni e trasferirli nei pozzetti di una piastra da 48 pozzetti contenente 50 microlitri di tripsina allo 0,25% di incubazione a 37 gradi Celsius per uno o due minuti. Quindi aggiungere 200 microlitri di terreno fresco con metà della concentrazione di composto per consentire un recupero ottimale delle cellule.

Per isolare i cloni utilizzando dischi di clonazione da tre millimetri, posizionare i dischi in una piastra di coltura tissutale da 10 centimetri contenente cinque millilitri di tripsin EDTA allo 0,25% per due minuti. Quindi, aspirare il terreno dal piatto contenente i cloni resistenti e sovrapporre i cloni con i dischi di clonazione imbevuti di inciampo. Incubare a 37 gradi Celsius per uno o due minuti, a seconda della facilità con cui i cloni si sollevano dalle piastre.

Quindi, utilizzando una pinza sterile, raccogliere i dischi di clonazione e trasferirli in piastre a 48 pozzetti con 200 microlitri di terreno fresco, e far pipettare delicatamente la concentrazione del composto su e giù per rimuovere le cellule dai dischi di clonazione e incubare a 37 gradi durante la notte il giorno successivo, rimuovere i dischi di clonazione, incubare le cellule, Quindi valutare la resistenza ai farmaci. Secondo il protocollo di testo, come mostrato qui, HCT 16 cellule trattate per un periodo prolungato con citotossico. Il composto numero uno ha portato all'emergere spontaneo di cloni resistenti che hanno continuato a crescere durante il trattamento.

I cloni sono stati raccolti utilizzando un pipettatore. In questa figura i cloni resistenti da uno a tre hanno tutti dimostrato una resistenza significativa al composto numero uno e al suo analogo stretto composto numero due, mentre tutti i cloni hanno mostrato sensibilità a un composto citotossico non correlato. Velcade. Dopo la conferma della resistenza fenotipica, il GDNA è stato isolato e sottoposto all'analisi di sequenziamento dell'intero esoma.

Le varianti strutturali che erano ricorrenti e avevano il potenziale di impatto funzionale sono state confermate da uno strumento di sequenziamento indipendente come il sequenziamento Sanger. Un esempio mostrato qui portava una mutazione missenso eterozigote e la linea cellulare parentale è stata successivamente ingegnerizzata per esprimere il CDNA mutato. Mentre la sovraespressione del CDNA wild type non è riuscita a conferire resistenza ai farmaci.

Il mutante CD NA ha conferito in modo significativo resistenza fenotipica al composto numero uno, confermando il ruolo funzionale della variazione strutturale come driver della resistenza. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare una crescita spontanea resistente per lo screening dei geni responsabili della resistenza ai farmaci nelle cellule tumorali dopo il suo sviluppo. Questa tecnica consente ai ricercatori nel campo dell'oncologia di esplorare i meccanismi di resistenza ai farmaci in modo imparziale sia nelle linee cellulari tumorali che nei modelli animali.