Istituzione di un clinicamente rilevanti Ex Vivo Mock chirurgia della cataratta modello per indagare epiteliale Wound Repair in un microambiente Native

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare un modello clinicamente rilevante in cui la riparazione delle ferite possa essere seguita nel suo microambiente nativo. Ciò si ottiene rimuovendo prima la lente dall'occhio di un embrione di pollo. Il secondo passo consiste nel praticare una piccola incisione nella parte anteriore del cristallino.

Quindi idroeluire la massa cellulare della fibra del cristallino. Successivamente, la capsula del cristallino con l'epitelio associato viene appiattita praticando ulteriori tagli nella capsula anteriore. Il passaggio finale consiste nel fissare la coltura ferita al piatto di coltura tissutale per seguire la guarigione della ferita man mano che avviene.

In definitiva, la microscopia time-lapse, la microscopia confocale e l'analisi biochimica vengono utilizzate per mostrare i meccanismi di riparazione delle ferite in un modello che ricapitola fedelmente l'ambiente in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della guarigione delle ferite, come ad esempio il modo in cui le cellule si muovono insieme in modo coordinato per chiudere la ferita. Anche se questo metodo può dare un'idea del processo di riparazione delle ferite.

Può anche essere applicato agli studi sulla guarigione delle ferite ABER, in particolare sulla fibrosi e sulle cicatrici. Iniziare posizionando tre piastre di Petri da 100 millimetri in una cappa sterile a flusso laminare. Riempire a metà due delle piastre di Petri con tampone di destrosio tris a temperatura ambiente, lasciando la terza vuota.

Quindi rimuovere un uovo di pollo bianco livornese giorno 15 giorno fertile dall'incubatrice a 37,7 gradi Celsius e pulire l'esterno del guscio con etanolo al 70% per sterilizzarlo. Quindi, rompi con cura l'uovo e mettine il contenuto nella capsula di Petri vuota da 100 millimetri. Utilizzando una pinza standard e forbici sottili, decapitare l'embrione e posizionare la testa in uno dei piatti contenenti il tampone destrosio TST.

Entro 15 minuti, sposta la testa dell'embrione di pollo su un coperchio della capsula di Petri. Usa una pinza ad alta precisione per pizzicare la parte posteriore dell'occhio, creando una piccola apertura nella parte posteriore dell'occhio. Quindi afferra l'umor vitreo con il forcipe e tira delicatamente il vitreo con il movimento rotatorio.

Il vitreo con la lente attaccata si staccherà dall'occhio. Posizionare la lente e il vitreo nella piastra di Petri rimanente contenente Tex extras Buffer. Lasciare che le lenti rimangano nel tampone per non più di 30 minuti prima di continuare con la dissezione.

Quindi, spostare la lente su un nuovo coperchio della capsula di Petri sotto un microscopio da dissezione con una pinza ad alta precisione, spazzolare via con cura tutte le cellule del corpo ciliare che sono state rimosse con la lente usando il bordo della pinza. Quindi separare il cristallino dall'umor vitreo pizzicando il corpo vitreo dalla sua associazione con la capsula posteriore del cristallino. Una volta separata, trasferire la lente in una goccia da 200 microlitri di tampone di destrosio di tris in un piatto di coltura tissutale da 35 millimetri e orientarla con l'aspetto anteriore della lente rivolto verso l'alto.

La parte anteriore del cristallino è facilmente identificabile per la presenza di un anello denso nel tessuto che nota il confine tra l'interno e la regione equatoriale dell'epitelio del cristallino. Utilizzando due pinze ad alta precisione, praticare una piccola incisione di circa 850 micron di lunghezza al centro della capsula anteriore del cristallino afferrando il tessuto con una pinza in ciascuna mano e tirando delicatamente in direzioni opposte. Quindi, prendi una siringa da un millilitro con la punta dell'ago calibro 27,5 e riempila con 300 microlitri di tampone destrosio TST.

Inserire la punta dell'ago nell'incisione praticata nella capsula anteriore del cristallino e circa a metà nel cristallino. Quindi premere delicatamente la siringa, iniettando il tampone destrosio TST nella lente. Massa cellulare in fibra.

Iniettare tra 50 e 200 microlitri di tampone per allentare la massa cellulare delle fibre dall'epitelio circostante e dalla capsula del cristallino. Non iniettare mai più di 300 microlitri. Utilizzando una pinza ad alta precisione, rimuovere la massa cellulare in fibra allentata dalla lente attraverso il sito di incisione anteriore.

La rimozione della massa cellulare fibrosa dal suo attacco sulla capsula posteriore crea un'area della ferita altamente riproducibile sulla membrana basale circondata dall'epitelio ferito. Partendo dalla sacca capsulare, eseguire cinque tagli nella parte anteriore del cristallino e fino all'equatore. Appiattire i cinque lembi risultanti della capsula del cristallino con l'epitelio attaccato sulla capsula di coltura con il lato rivolto verso il basso e con la cellula rivolta verso l'alto.

Premere delicatamente con la pinza in ogni punto della stella per fissare la capsula al piatto. Questo creerà una piccola rientranza alle cinque punte più esterne dell'explan x e si tradurrà in un attaccamento prolungato al piatto. Quindi rimuovere il tampone tris destrosio dal piatto da 35 millimetri e sostituirlo con 1,5 millilitri di M1 99 prebellico.

Terreni integrati con l'1% di L-glutammina e penicillina. La streptomicina ha coperto il piatto con il suo coperchio e lo ha posto nell'incubatrice. Posizionare la piastra di coltura sotto il microscopio da dissezione e osservare la demarcazione tra la zona di migrazione centrale e la zona di attacco originale delle cellule epiteliali.

Quindi utilizzare due pinze ad alta precisione per afferrare il bordo di entrambi i lati della linea di demarcazione tra le due zone. Tirare delicatamente la zona di attacco originale lungo il filo per separare facilmente le due zone. Continuare a separare le due zone intorno all'intera cultura fino a quando le due aree non sono completamente separate.

Studia le due frazioni utilizzando tecniche analitiche molecolari o biochimiche standard. Immediatamente dopo la rimozione della massa cellulare in fibra, una sottopopolazione di cellule di riparazione mesenchimali arricchite viene attivata e migra verso il bordo della ferita dell'epitelio. Queste cellule si spostano rapidamente sulla regione libera da cellule della capsula endogena della membrana basale, la zona di migrazione centrale per iniziare la guarigione.

La ferita, la tecnica qui descritta, prepara perfettamente questo sistema modello per la visualizzazione di questo processo con un microscopio o una videocamera, la guarigione della ferita progredisce rapidamente coprendo un'area significativa della ferita entro il primo giorno in coltura. Entro il terzo giorno, il processo di guarigione della ferita viene in genere completato dopo la separazione della migrazione centrale e delle zone di attacco originali. Qui sono state analizzate le differenze molecolari tra queste zone distinte.

I livelli di chinasi di adesione focale sono stati misurati nelle due zone e la quantità di chinasi di adesione focale fosforilata è risultata aumentata nella zona di migrazione centrale specifica per la migrazione. Una volta padroneggiata, questa tecnica di finta chirurgia della cataratta può essere completata in tre minuti se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare un modello di finta chirurgia della cataratta che imiti da vicino la riparazione delle ferite in un microambiente naturale.