Name: Screening prodotti alimentari per la Classe 1 integroni e Gene cassette (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Scopri un metodo per rilevare integroni di classe 1 e cassette geniche di resistenza negli alimenti usando PCR e sequenziamento. Questo protocollo supporta la sorveglianza della sicurezza alimentare e la tracciabilità dei geni di resistenza.

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Grazie a Michaela Hall, Larissa Bispo e Gustavo Tavares per l&#39;assistenza tecnica.

I prodotti alimentari che vengono consumati crudi o poco cotti sono più preoccupazione per la salute umana. Gli esempi includono insalata di verdure, frutta, frutti di mare e crostacei. 1. Raccolta dei campioni <ol><li> Raccogliere i campioni in condizioni che riducono al minimo la contaminazione, e conservati in sacchetti puliti, separati durante il trasporto. Una volta raccolti, i campioni devono essere conservati a 4 ° C e trattati entro 24 ore. </li></ol> 2. Enriched Cultura Preparazione <ol><li> Frutta e verdura: <ol><li> Posizionare circa 10 g di materiale in un sacchetto di plastica resistente. Se l&#39;elaborazione di materiale più grande, concentrarsi sulla pelle della frutta o verdura. Aggiungere 90 ml di 0,1 M tampone fosfato di sodio, pH 7,0 e di processo in un miscelatore a pale per 30 sec. In alternativa, il materiale può essere agitato manualmente se un miscelatore a pale non è disponibile. </li><li> Raccogliere il liquido in due provette da 50 ml Falcon. Provette per centrifuga a 4.000 xg per 7 minuti a batteri pellet. </li&gt; <li> Rimuovere con attenzione il surnatante e sospendere i batteri pellet in 30 ml di sterile Luria Bertani (LB) brodo. </li><li> Incubare su un agitatore O / N, tenendo un tubo a 25 ° C e l&#39;altro a 37 ° C. Le colture devono essere agitati a 200 oscillazioni al minuto (OPM). Conservare le culture a 4 ° C fino a quando necessario. </li></ol></li><li> Frutti di mare: <ol><li> Sezionare lo stomaco (ostriche) o del tratto digestivo (gamberi) con pinza sterile e pinzette e posto in una provetta sterile da 1,5 ml contiene 200 ml di tampone fosfato 0,1 M di sodio, pH 7,0. Macerare il campione per creare un omogenato. </li><li> Dispensare 5 ml di brodo LB in due sterili provette da 5 ml, e inoculare ciascuna con l&#39;omogeneizzato frutti di mare. </li><li> Incubare su un agitatore O / N, tenendo un tubo a 25 ° C e l&#39;altro 37 ° C. Le colture devono essere agitati a 200 opm. Conservare le culture a 4 ° C fino a quando necessario. </li></ol></li></ol> 3. Culture screening per integroni 2 di 2,5 mm. Se necessario, Lorenz (2011) 24 ha delineato l&#39;ottimizzazione e la risoluzione dei problemi di PCR metodi in un numero precedente di questa rivista. <ol><li> La preparazione del DNA Bollito: <ol><li> Dispensare 100 l di cultura arricchito in una sterile 0,5 ml provetta PCR. Riscaldare il campione a 99 ° C per 10 minuti, utilizzando un bagnomaria o calore. Snap freddo in ghiaccio per 2 minuti. </li><li> Microcentrifuga a 14000 g per 5 minuti per far sedimentare i detriti cellulari. Ritorno a ghiaccio. I campioni di DNA possono essere congelati a -20 ° C fino al momento, ma devono essere scongelati in ghiaccio. </li></ol></li><li> Screening per la classe 1 integroni utilizzando PCR: NOTA: culture miste dal / N incubazione O sono proiettati per la classe 1 integroni che utilizzano il protocollo HS463a / HS464 PCR (Tabella 1). <ol><li> Scongelare tutti i reagenti PCR su ghiaccio, lontano da qualsiasi potenziale souRCE di contaminazione del DNA. Make up 48 microlitri PCR mastermix per campione, inclusi i controlli negativi (Tabella 2). Dispensare 48 ml di PCR master mix in ogni provetta, con punte di barriera. </li><li> Aggiungere 2 ml di DNA scongelata per provette PCR singole con puntali. Eseguire apposito programma nel termociclatore PCR. </li><li> Per valutare i risultati della amplificazione, elettroforesi 7 ml di prodotto di PCR su un gel di agarosio al 2% versato ed eseguire in tampone TBE (90 mM TRIS-borato, 2 mM EDTA). Include un marcatore di peso molecolare, come ad esempio una scala di 100 bp. </li><li> Posta macchia il gel con una macchia DNA, e visualizzare utilizzando un transilluminatore UV. Verificare che non vi è stata alcuna amplificazione nel controllo negativo. Una forte banda a circa 470 bp per qualsiasi campione particolare indica che la cultura mista contiene batteri che portano una classe 1 integrone. Colonie Pure verranno isolate da qualsiasi cultura mista che ha restituito una PCR positiva. </li></ol></li></ol><ol><li> Diluizioni seriali e piastre spread: NOTA: Per isolare singole colonie da colture miste PCR-positivi, la coltura mista è serialmente diluiti 10 volte in tampone fosfato di sodio, e poi placcato recuperare singole colonie. <ol><li> Aggiungere 1 ml di coltura mista a 9 ml di tampone fosfato 0,1 M di sodio, pH 7,0 e mescolare per inversione. Aggiungere 1 ml della diluizione ad un ulteriore 9 ml di tampone fosfato, e ripetere fino una diluizione seriale di 10 -8 è raggiunto. </li><li> Stendere 100 ml di i 10 -4 a 10 -8 diluizioni su agar LB, in duplice copia. Incubare le piastre O / N alla stessa temperatura utilizzata per la coltura mista iniziale. Le piastre possono quindi essere conservati a 4 ° C fino al momento, ma è meglio elaborare le singole colonie abbastanza rapidamente. </li></ol></li><li> Selezione colonia unico e la preparazione del DNA bollito: <ol><li> Scegli singole colonie dalle piastre di diluizione seriali, SEnando come molti tipi differenti di colonie possibile, utilizzando criteri come le dimensioni delle colonie, forma e colore. Usa stuzzicadenti sterile per selezionare singole colonie dalla piastra diffusione. </li><li> Toccare lo stuzzicadenti alla colonia, e poi trasferire in un tubo di PCR contenente 100 ml di acqua sterile. Se un gran numero di colonie devono essere sottoposti a screening, quindi le colonie possono essere preparati in un vassoio di microtitolazione. Spin stuzzicadenti tra le dita per rimuovere alcune delle cellule in acqua. </li><li> Utilizzando lo stesso stecchino, inoculare una piastra LB con una striscia della colonia. Un gran numero di colonie possono essere memorizzati su piastre etichettati se ogni striscia è lungo circa 1 cm. Ripetere i passaggi da 1 a 3 fino a selezionare un numero adeguato di isolati. </li><li> Incubare la piastre LB O / N, alla stessa temperatura di quello usato per la coltura arricchita iniziale. Le culture possono quindi essere conservati a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Per la preparazione del DNA dalle sospensioni batteriche, seguire la procedura come outlined nella sezione 3.1. Per lo screening dei lisati coltura pura, eseguire la HS463a / HS464 PCR come indicato nella sezione 3.2. Gli isolati che restituiscono un PCR positivo sarà utilizzato per la preparazione di DNA genomico (sezione 5), e per ulteriori analisi. </li></ol></li></ol> 5. Le colonie singole genomico Estrazione del DNA di Integron positivi Uso Bead Beating 25 <ol><li> Inoculare 5 ml di brodo LB con un campione della coltura pura isolato nella sezione 4.2. Incubare O / N, agitando alla stessa temperatura che è stato utilizzato per la coltura arricchita iniziale. </li><li> Cellule pellet a 4.000 xg per 7 minuti, quindi rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule pellet in 1 ml di soluzione CLS-TC in un tubo di preparazione veloce di Lisi Matrix E. Utilizzando una macchina tallone pestaggio, elaborare il campione a 5,5 m / sec per 30 sec. </li><li> Provetta da centrifuga a 14000 xg per 5 min e recuperare 700 pl di surnatante in una provetta sterile da 1.5 ml. </li><li> Aggiungere 700 ml di matrice legante diluito 1: 5 con 6 M guanidinium tiocianato e mescolare a temperatura ambiente per 5 minuti. Centrifugare a 14000 g per 1 minuto, il surnatante scarto. </li><li> Aggiungere 800 microlitri etanolo di lavaggio sale (70% di etanolo, 0,1 M di acetato di sodio) e vortex fino a quando il pellet è completamente risospeso. Lavare per 5 minuti a RT, centrifugare a 14.000 xg per 1 minuto e scartare il surnatante. Assicurarsi tutte surnatante è stato rimosso, usando una micropipetta se necessario, quindi lasciare asciugare all&#39;aria per 5 min. </li><li> Risospendere la matrice pellet in 200 microlitri TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,6) pipettando su e giù. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Centrifugare a 14.000 xg per 3 min e trasferimento 160 microlitri della DNA eluito in una provetta sterile. Eseguire una aliquota della estrazione del DNA genomico su 2% w / v gel di agarosio per verificare la resa e l&#39;integrità della estrazione del DNA. Il DNA genomico purificato è conservato a -20 ° C e scongelato in ghiaccio quando richiesto per il test PCR. </li></ol> 6. PCR diagnostici e sequenziamento del DNA NOTA: IlDNA genomico preparata al punto 5 sarà utilizzato per tutte le PCR diagnostici, e per confermare il test positivo per la classe 1 integroni. <ol><li> Scongelare il DNA genomico sul ghiaccio, vortice brevemente il campione di DNA e di spin impulso a 14000 g per 20 sec. Ripetere la PCR per la classe 1 integrone-integrasi gene utilizzando HS463a / HS464 (Tabella 1), a conferma che l&#39;isolato è positivo per l&#39;amplicone 471 bp (Sezione 3.2). </li><li> Identificazione delle colture positive a livello di specie è ottenuta mediante analisi della piccola subunità gene rRNA (16S rDNA). Amplificare il gene 16S con primer f27 / r1492 (Tabella 1). Controllare i prodotti PCR mediante elettroforesi. Tutti gli obiettivi batterici dovrebbero generare un 16S amplicone di circa 1450 bp. </li><li> Sequenza gene amplicone 16S rRNA per determinare l&#39;identità delle specie, ma dal momento che ci sono probabilmente più PCR positivi dal punto 6.2, e molti di questi aspetti positivi saranno le stesse specie di batteri, abbiamo in primo luogo distinguere diverse specie using restrizione digestione del prodotto di PCR 16S. <ol><li> Digest un&#39;aliquota del 16S PCR con l&#39;enzima di restrizione Hinf 1. Ogni enzima che riconosce siti di rottura 4 bp farà, ma Hinf 1 genera buona diversità dagli obiettivi 16S, ed è un affidabile, enzima poco costoso. </li></ol></li><li> Impostare una limitazione di 30 microlitri digerire mastermix (Tabella 2) in una provetta sterile e aggiungere 20 ml di un-purfied prodotto 16S PCR. Incubare a 37 ° C bagnomaria O / N. Controllare il digest su un gel di agarosio al 2%. </li><li> Nota i modelli prodotti dalla digestione Hinf 1. Isolati con la stessa 16S profilo di restrizione saranno probabilmente della stessa specie. Piuttosto che sequenziare ogni prodotto 16S PCR, sequenza al massimo tre rappresentanti di ogni Hinf 1 restrizione modello. </li><li> Purificare i prodotti 16S PCR utilizzando un kit commerciale. Un unico kit exonuclease filamento può essere utilizzato, ma sulla base di colonna o metodi di precipitazione anche lavorare bene per rimuovere unincprimer orporated e DNA cavo rigido. Sequenza 16S amplificati usando Primer R910 (Tabella 1), che istituiscono le reazioni, come specificato dalla struttura sequenziamento. </li><li> Utilizzare la sequenza di DNA derivati ​​di interrogare la banca dati del DNA NCBI con la funzione BLASTN ( <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). Superiore al 97% nucleotide identità è solitamente considerato come l&#39;identità di specie. </li></ol> 7. mappatura e caratterizzazione di integroni e cassette Array NOTA: Classe 1 integroni provenienti da ecosistemi umani dominati sono probabilmente i integroni più comuni in tutti i campioni. Questi integroni tutti hanno un recente un&#39;unica origine, e quindi hanno una sequenza di DNA altamente conservata 5. <ol><li> Distinguere tra una classe 1 integroni provenienti da fonti umane e quelle che si trovano in natura in campioni ambientali eseguendo unaPCR con primer set intI1F165 / intI1R476 10 (Tabella 1). NOTA: Classe 1 integroni da batteri clinici o commensali genererà un prodotto ~ 300 pb, mentre la classe ambientale 1 integroni non genereranno alcun prodotto. </li><li> Caratterizzare le integroni clinici amplificando matrice cassetta con primer HS458 / HS459. Questo PCR amplifica la regione tra intI1 e segmento conservato il 3 &#39;al capolinea della maggior parte degli array di cassette. Poiché il numero e l&#39;identità di cassette è variabile, le dimensioni del prodotto di PCR anche variare. </li><li> Purificare ampliconi e sequenziare il DNA utilizzando ciascuno dei primer di amplificazione. Utilizzare sequenze di interrogare banche dati del DNA utilizzando la funzione BLASTN ( <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li><li> Garantire la denominazione di cassette seguire nomenclatura standardizzata 9, dal momento che molte deposizioni di dati per cassette gene integrones usano nomi incoerenti o ambigui. Dare particolare attenzione alle cassette geniche nuovi, dal momento che questi possono codificare nuovi fenotipi, compresi i geni che conferiscono aumentata trasmissibilità, patogenicità o la virulenza 8,21. NOTA: preclinici forme della classe 1 integrone circolano ancora in ambienti naturali. In particolare, coloro che sono legati alla attive Tn 402 trasposoni sono di maggior interesse 26. Gli array di cassette di questi integroni non amplificare con primer HS458 / HS459, ma possono essere amplificati con la MRG284 / MRG285 Primer set (Tabella 1), generando ampliconi di grandezza variabile dipendente sui contenuti cassetta. I prodotti di PCR devono essere purificati e DNA sequenziati come indicato al punto 7.2. </li></ol>

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<li>Holmes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+activity+of+a+distinctive+integron-gene+cassette+system+associated+with+stutzeri.+populations+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil.</a> Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non hanno niente di rilevante da rivelare.

L&#39;identificazione di integroni e le loro cassette geniche associate è potenzialmente un passo fondamentale nel predire l&#39;emergere di nuovi patogeni opportunisti, tracking percorsi per gli agenti patogeni nella catena alimentare umana, e identificando nuova resistenza e la virulenza determinanti 8,21,26. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di descrivere un approccio semplificato per lo screening dei campioni per la classe 1 integroni, che caratterizzano le loro matrici cassette e identificare le s...

La scoperta degli antibiotici è stata una delle più grandi conquiste scientifiche del 20 ° secolo. Tuttavia, l&#39;uso e l&#39;abuso di antibiotici ha portato alla rapida evoluzione dei batteri resistenti agli antibiotici, e questi ora rappresentare una seria minaccia per la salute pubblica nel 21 ° secolo. L&#39;aumento di ceppi batterici resistenti alla maggior parte delle opzioni di trattamento solleva la possibilità che stiamo entrando in un&#39;era in cui i farmaci antimicrobici non sono più efficaci 1,2. Il macchinario genetico che conferisce resistenza agli antibiotici è un antico sistema, anticipando gli esseri umani e le pressioni di selezione antibiotici da milioni di anni 3. Elementi genetici mobili, come i plasmidi, trasposoni, isole genomiche, elementi di coniugazione integrativi e integroni possono diffondere geni resistenti agli antibiotici (ARG), sia all&#39;interno e tra specie batteriche 4. Di questi, integroni hanno svolto un ruolo centrale nella diffusione di ARG, nonostante lafatto che si basano su plasmidi e trasposoni per la mobilitazione e l&#39;inserimento in genomi batterici 5. Integroni catturano cassette geniche che utilizzano un integrone-integrasi, e quindi esprimono cassette utilizzando un integrone codificato promotore 6,7 (Figura 1). Integron gene cassette sono piccoli elementi mobili costituiti da singole fasi di lettura aperti (ORF) i cui prodotti possono conferire resistenza agli antibiotici e disinfettanti 8. Classe 1 integroni sono i integroni più comunemente recuperati da isolati clinici 5, dove hanno complessivamente acquisito oltre 130 diverse cassette antibiotico gene di resistenza 9. La diffusione di classe 1 integroni in commensali e batteri patogeni umani associata genera flussi di rifiuti umani che contengono un gran numero di questi elementi genetici 10. Si stima che 10 19 batteri che contengono classe 1 integroni vengono rilasciati tramite fanghi di depurazione ogni anno in il Regno Unito 11. Non è quindi sorprendente che classe 1 integroni che conferiscono resistenza agli antibiotici sono ora rilevati nel microbiota degli uccelli selvatici, pesci e altri fauna selvatica 12-14. Rilasciando integroni indietro nell&#39;ambiente costituisce una significativa minaccia per la salute pubblica, dal momento che l&#39;acquisizione di nuove cassette geniche e riarrangiamenti complessi con altri elementi mobili continua a verificarsi, soprattutto negli impianti di trattamento delle acque reflue e di altri corpi idrici 15-18. L&#39;ambiente naturale diventa un terreno di reclutamento fertile per i nuovi determinanti di resistenza e patogeni opportunisti 19,20. Batteri integrone contenente Nuovi e nuovi ARG possono fare il giro nella comunità umana attraverso acqua e cibo contaminati 21,22. Sorveglianza di ARG ambientali è una strategia chiave per la comprensione e la gestione di resistenza agli antibiotici in futuro 23. In particolare, occorre prestare attenzione agli alimenti che vengono consumati crudi opoco cotti, dal momento che questi rappresentano la più grande minaccia per la trasmissione di nuovi elementi mobili e gli agenti patogeni. In questo protocollo, un approccio semplificato per il rilevamento, l&#39;identificazione e la caratterizzazione di classe 1 integroni e le loro cassette geniche associate nei prodotti alimentari sono delineati (Figura 2). Utilizzando una combinazione di reazione coltura e della polimerasi a catena (PCR), integroni possono essere rapidamente individuati nelle comunità batteriche complesse e singoli isolati. I metodi per identificare le specie di batteri e la conformazione e l&#39;identità delle cassette geniche Integron associata sono dati. Il metodo è adatto per una vasta gamma di alimenti vegetali e animali, ed esempi di workflow tipici sono fornite per ciascuno di questi tipi di alimenti.

<table><tbody><tr><td>GoTaq Mastermix incolore</td><td>Promega</td><td>M7132</td><td>Utilizzato in tutte le PCR</td></tr><tr><td>RNAsi (Ribonucleasi A da pancreas bovino)</td><td>Sigma</td><td>R6513-10MG</td><td>Utilizzato in tutte le PCR</td></tr><tr><td>Enzima di restrizione HinFI</td><td>Promega</td><td>R6201</td><td>Utilizzato per digerire i prodotti PCR 16S rDNA. L'enzima viene fornito con un tampone ottimale e una scala BSA</td></tr><tr><td>100 bp</td><td>GE Healthcare</td><td>27400701</td><td>Utilizzato come standard di dimensioni su tutti i gel di agarosio Colorazione</td></tr><tr><td>GelRed DNA</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>ATTENZIONE: È necessario indossare una protezione personale quando si maneggia questo materiale</td></tr><tr><td>Tiocianato di guanidio</td><td>Life Technologies</td><td>AM9422</td><td>ATTENZIONE: È necessario indossare una protezione personale quando si maneggia questo materiale</td></tr><tr><td>CLS-TC Soluzione</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540409</td><td>Soluzione di risospensione utilizzata all'inizio dell'estrazione del DNA genomico</td></tr><tr><td>Matrice di lisi E Provette FastPrep</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914500</td><td>necessaria per la disgregazione meccanica delle pareti cellulari batteriche. Questo codice viene utilizzato per confezioni da 500 tubi, sono disponibili quantità minori.</td></tr><tr><td>Matrice legante</td><td>MP Biomedicals</td><td>116540408</td><td>diluita 1:5 con tiocianato di guanidinio 6 M e utilizzata nel metodo di estrazione del DNA genomico.</td></tr><tr><td>Macchina Fast Prep</td><td>MP Biomedicals</td><td>Numero di opzioni disponibili</td><td>MP Biomedicals ha un certo numero di macchine FastPrep disponibili per l'acquisto. Visita <a href="http://www.mpbio.com" target="_blank">http://www.mpbio.com</a> per maggiori informazioni</td></tr></tbody></table>

screening prodotti alimentari per la classe 1 integroni e gene cassette

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

La resistenza agli antibiotici è una delle più grandi minacce per la salute nel 21° secolo. L'acquisizione di geni di resistenza tramite trasferimento genico laterale è un fattore importante nella diffusione di diversi meccanismi di resistenza. Tra gli elementi del DNA che facilitano il trasferimento laterale, gli integroni di classe 1 sono stati in gran parte responsabili della diffusione di determinanti di resistenza agli antibiotici tra i patogeni Gram negativi. In totale, queste integroni hanno acquisito e diffuso oltre 130 diversi geni di resistenza agli antibiotici. Con l'uso continuato di antibiotici, gli integroni di classe 1 sono diventati onnipresenti nei commensali e nei patogeni dell'uomo e dei loro animali domestici. Di conseguenza, ora possono essere trovati in tutti i flussi di rifiuti umani, dove continuano ad acquisire nuovi geni e hanno il potenziale per tornare negli esseri umani attraverso la catena alimentare. Questo protocollo descrive in dettaglio un approccio semplificato per rilevare gli integroni di classe 1 e le cassette geniche di resistenza associate negli alimenti, utilizzando la coltura e la PCR. Utilizzando questo protocollo, i ricercatori dovrebbero essere in grado di: raccogliere e preparare campioni per realizzare colture arricchite e screening per integroni di classe 1; isolare singole colonie batteriche per identificare gli isolati integron-positivi; identificare le specie batteriche che contengono integroni di classe 1; e caratterizzare queste integroni e le cassette geniche associate.

Proiezione di colture miste e isolati batterici per intI1 Primer HS463a / HS464 PCR può essere utilizzato per rilevare la presenza della classe 1 integrone-integrasi gene, intI1 (Figura 1). Questo set di primer funziona bene per la rilevazione intI1 in colture miste, ed è anche utilizzato per lo screening colonie batteriche raccolte da dispositivo di spargimento (Figura 2). Isolati positivi dovrebbero generare una singola banda forte a 471 bp ...

Questo protocollo descrive la rilevazione delle integroni di classe 1 e delle cassette geniche ad esse associate negli alimenti.

Screening prodotti alimentari per la Classe 1 integroni e Gene cassette

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un approccio semplificato per rilevare gli integroni di classe uno e i relativi cassetti genici presenti negli alimenti. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando una coltura batterica arricchita a partire dall'alimento scelto. Il secondo passaggio consiste nell'analizzare la coltura per verificare la presenza di integroni di classe uno mediante PCR e nell'isolare singole colonie dalla coltura mista positiva per integroni.Dopo aver esaminato le colonie singole per la presenza di integroni, preparare il DNA genomico dalle colonie singole per eseguire PCR diagnostiche al fine di differenziare le specie batteriche e rilevare la presenza di cassette geniche. L'ultimo passaggio consiste nella purificazione dei prodotti di PCR e nel loro invio per l'analisi del sequenziamento del DNA. In definitiva, l'analisi del sequenziamento del DNA viene utilizzata per caratterizzare le cassette geniche all'interno di un integrone di classe uno e identificare le specie in cui sono presenti.La resistenza agli antibiotici è uno dei principali problemi che la medicina deve affrontare nel XXI secolo. Uno dei modi per gestire la resistenza agli antibi

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Un metodo rapido ed efficace per integrare DNA estraneo di interesse in pre-fatti ceppi accettori, chiamati ceppi pista di atterraggio, è descritta. Il metodo permette integrazione sito-specifica di una cassetta DNA nel locus ingegnerizzato atterraggio di un dato ceppo, tramite coniugazione e l'espressione del ΦC31 integrasi.

Site-specific Ingegneria batterica Cromosoma: ΦC31 integrasi Mediated Cassette Exchange (IMCE)

I batteri producono composti secreti che hanno il potenziale per influenzare la fisiologia dei loro vicini microbiche. Qui si descrive una schermata co-coltura che permette la rilevazione di tali interspecie interazioni mediate chimicamente mescolando microbi del suolo con fluorescenti ceppi giornalista trascrizionali di Bacillus subtilis su supporti solidi.

Utilizzo di co-coltura per rilevare chimicamente mediata interspecie Interazioni

Questo lavoro presenta un metodo di screening ad alto rendimento utilizzando un sistema di screening enzimatico genetico universale che può essere teoricamente applicato a oltre 200 enzimi. Qui, il singolo sistema di screening identifica tre diversi enzimi (lipasi, cellulasi e fosfatasi alcalina) semplicemente cambiando il substrato utilizzato (p-nitrofenil acetato, p-nitrofenil-β-D-cellobioside e fenil fosfato).

Multi-enzima screening utilizzando un high-throughput genetica Enzyme Screening System

Salmonella spp /Shigella spp sono agenti patogeni comuni attribuiti alla diarrea. Qui, descriviamo una piattaforma di alto-rendimento per lo screening della Salmonella spp /Shigella spp usando la PCR in tempo reale combinati con cultura guidato.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Qui presentiamo un protocollo per l'uso di pre-esistente antibiotico resistenza-cassette eliminazione costrutti come base per la fabbricazione di mutanti di delezione in altri ceppi di Escherichia coli . Tali mutazioni di omissione possono essere mobilitati e inseriti il locus corrispondente di un ceppo destinatario mediante trasduzione del batteriofago P1.

Produzione di delezioni del Gene in Escherichia coli di trasduzione P1 con cassette di resistenza agli antibiotici soggetti ad accisa

L'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) è un test di amplificazione dell'acido nucleico isotermico (iNAAT) che ha attirato un ampio interesse nel campo del rilevamento degli agenti patogeni. Qui presentiamo un protocollo Salmonella LAMP convalidato in più laboratori come metodo rapido, affidabile e robusto per lo screening della Salmonella negli alimenti per animali e la conferma della Salmonella presuntiva dall'isolamento della coltura.

Amplificazione isotermica mediata ad anello per lo screening della Salmonella negli alimenti animali e conferma della Salmonella dall'isolamento della coltura

Il protocollo descrive come ottenere modifiche dirette al sito nel genoma delle zanzare Anopheles malaria utilizzando il sistema φC31 . Le modifiche descritte includono sia l'integrazione che lo scambio di cassette transgeniche nel genoma di linee di attP..

Integrazione mediata dal sito φC31 e scambio di cassette in Anopheles Vettori della malaria

La coniugazione media il trasferimento genico orizzontale mobilitando il DNA plasmidico attraverso due cellule diverse, facilitando la diffusione di geni benefici. Questo lavoro descrive un metodo ampiamente utilizzato per la rilevazione efficiente del trasferimento plasmidico coniugativo, basato sull'uso di marcatori differenziali nel plasmide coniugativo, nel donatore e nel ricevente per rilevare la transconiugazione.

Rilevazione del trasferimento genico orizzontale mediato da plasmidi coniugativi naturali in E. coli

Il Campylobacter è la principale causa di gastroenterite batterica di origine alimentare in tutto il mondo. Nonostante gli stabilimenti adottino misure per ridurre la prevalenza in tutte le loro strutture, i prodotti contaminati raggiungono costantemente i consumatori. La tecnica sviluppata negli ultimi dodici anni affronta i limiti dei metodi esistenti per isolare e rilevare Campylobacter spp. dalla carne cruda.

Rilevamento e isolamento di Campylobacter spp. da carne cruda

Questo studio stabilisce una serie di procedure operative standard (SOP) per lo screening e l'isolamento efficiente dei batteri intestinali in grado di scindere i glicosidi C.

Screening e isolamento dei batteri intestinali che scindono il glicoside C

Scopri un metodo per rilevare integroni di classe 1 e cassette geniche di resistenza negli alimenti usando PCR e sequenziamento. Questo protocollo supporta la sorveglianza della sicurezza alimentare e la tracciabilità dei geni di resistenza.

Screening prodotti alimentari per la Classe 1 integroni e Gene cassette

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