Name: Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Scopri la visualizzazione di proteine di riparazione del DNA marcate con miniSOG mediante imaging spettroscopico elettronico. Questo metodo consente di analizzare l'ultrastruttura della cromatina danneggiata con risoluzione nanometrica.

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Ringraziamo il Dr. Roger Tsien per averci fornito i costrutti miniSOG. Dr. Xuejun Sun per l'aiuto con il TEM. Lisa Lem e Peter Shipple del Cross Cancer Institute per la fornitura di ossigeno. Hilmar Strickfaden è titolare di una borsa di studio post-dottorato presso l'Alberta Cancer Foundation ed è stata sostenuta dalla Bayrische Forschungsallianz. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Canadian Institutes of Health Research e dell'Alberta Cancer Foundation.

1. Generazione di linee cellulari miniSOG <ol><li> Grow U2OS (osteosarcoma umano) cellule in un piatto da 35 mm contenente 2 ml di glucosio basso modificata mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) che è integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS) a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 atmosfera. </li><li> Trasfezione le cellule quando sono l&#39;80% confluenti da lipofezione con qualità trasfezione purificato (A269 / 280 rapporto 1,8-2,0) costrutti plasmidici contenenti le sequenze per miniSOG e mCherry contrassegnati proteine ​​di riparazione secondo il protocollo del produttore del reagente trasfezione 19. I plasmidi di espressione miniSOG possono essere ordinati dalla Tsien-Lab: <a href="http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm">http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm</a> </li><li> Ordinare le cellule che esprimono la proteina ricombinante con il tag miniSOG e mCherry per fluorescenza delle cellule attivate ordinamento due giorni dopo la trasfezione. Raccogliere le cellulecon intensità di fluorescenza intermedio per evitare cellule che sono overexpressing 20. </li><li> Cultura le cellule positive su un piatto 10 cm in 10 ml di terreno DMEM che viene supplementato con 10% FBS e 0,6 mg / ml dell&#39;agente selezione G418 (geneticina). </li><li> Dopo colonie visibili sono emersi sulle piastre, schermo per mCherry colonie positive utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza e disegnare cerchi intorno a loro (sul fondo del piatto) con un pennarello indelebile. Utilizzare una lente obiettiva aria basso ingrandimento (ad esempio, 10x) e selezionare i cloni che usano una tecnica sterile grattando attentamente le colonie fuori e lentamente li succhia in una sterile, punta della pipetta 1000 ml. </li><li> Espandere le colonie selezionate e congelare parti di essi verso il basso con il mezzo di crescita descritto al punto 1.1 supplementato con 10% dimetilsolfossido. Metti alla prova le cellule per la formazione DRF da loro crescente su sterili 18 x 18 mm 2 vetrini e esponendoli a2 Gy di radiazioni. Le cellule che esprimono stabilmente irradiati un miniSOG mCherry taggati proteina riparazione deve mostrare il motivo caratteristica tipica focale di DSB quando visualizzati con un microscopio a fluorescenza utilizzando un filtro-set per l&#39;imaging mCherry. </li></ol> Cultura 2. Cella <ol><li> Cultura cellule U2OS esprimono stabilmente la miniSOG e mCherry contrassegnati proteine ​​di riparazione alle condizioni descritte al punto 1.1. Crescere le cellule a 80% di confluenza in un piatto fondo di vetro di diametro 35 mm contenente 2 ml di DMEM. Assicurarsi che il collante che attacca il vetrino per la plastica e la plastica utilizzata è resistente alle soluzioni acquose e alcoliche e resistente alla resina utilizzata! </li><li> Prima di effettuare l&#39;esperimento, delineare una piccola superficie di circa 1 mm 2 che contiene cellule che esprimono proteine ​​ectopiche graffiando con una penna di diamante sterile utilizzando un microscopio a fluorescenza per identificare la regione di interesse. In alternativa, utilizzare un piatto fondo di vetro tcappello contiene un vetrino con un sistema a griglia di pre-inciso integrato nel vetrino. NOTA: Se si utilizza la microscopia correlativa di alta qualità che combina ESI e fluorescenza immagini microscopiche 21, assicurarsi che lo spessore del vetrino è compatibile con gli obiettivi ad immersione olio. Dovrebbe avere spessore No. 1.5 (0,16-0,18 mm). Scegliere una zona vicino al centro del piatto per la regione da esaminare nella TEM per evitare problemi con la polimerizzazione della resina che può verificarsi in prossimità dei bordi (vedi punto 4,10-4,13). </li></ol> 3. DNA Damage induzione <ol><li> Irradiare le cellule con radiazioni gamma, utilizzare un farmaco radiomimetico, o indurre il danno da micro irradiazione laser su un microscopio confocale (ad esempio, come descritto in 18,22 o 23). </li><li> In questo esempio, irradiare le cellule con 2 e 6 Gy di raggi gamma in un microirradiate cesio 137-sorgente di radiazione laser o utilizzando il sol 405 nmid laser a stato di un microscopio confocale dopo sensibilizzare le cellule per 20 minuti con 0,5 mg / ml Hoechst. </li></ol> Preparazione del campione 4. <ol><li> Fissare le cellule con 1 ml di 4% paraformaldeide cautela in tampone cacodilato 0.1 M di sodio o in 0,1 M tampone fosfato pH 7,4 per 30 minuti a RT al buio. ATTENZIONE: Paraformaldeide e cacodilato sodio sono tossici! Indossare guanti e smaltire in modo adeguato le sostanze tossiche. </li><li> Lavare le cellule due volte con 4 ml di 0,1 M tampone sodio cacodilato pH 7,4 o tampone fosfato pH 7,4. </li><li> Trattare le cellule fissate con glicina 2 ml di 50 mM, 5 mM amminotriazolo e 10 mM cianuro di potassio cautela in 0,1 M tampone sodio cacodilato o tampone fosfato 0,1 M (pH 7,4) (controllare il pH!) Per 30 minuti per bloccare non reagito gruppi aldeidici e per sopprimere le specie reattive dell&#39;ossigeno generati da gruppi eme, che può aumentare il fondo. ATTENZIONE: cianuro di potassio è estremamente tossico! Wguanti orecchio, lavorano sotto un cappuccio e smaltire adeguatamente le sostanze tossiche. La reazione è molto sensibile al pH, quindi è importante che il pH verificato e preciso. </li><li> Registrare la zona che è stata selezionata al passo 2.2 in 2D o 3D su un microscopio a fluorescenza invertito, se la microscopia correlativa si desidera. </li><li> Preparare una / ml di soluzione di cloridrato ATTENZIONE diaminobenzidina 1 mg ponendo un 10 mg diaminobenzidina cloridrato in una provetta da 2 ml. Aggiungere 980 ml ​​di H 2 O distillata e 20 ml di acido cloridrico concentrato (11,65 M) e miscelare fino a che la soluzione è marrone chiaro e trasparente. Diluire questa soluzione 0,1 M di fosfato di sodio 0,1 M o tampone cacodilato ad una concentrazione finale di 1 mg / ml mentre regolando il pH con idrossido di sodio fino a pH tra 7,0 e 7,6 (pH 7.4 è raccomandato). ATTENZIONE: diamminobenzidina è tossico! Indossare guanti e smaltire in modo adeguato le sostanze tossiche. </li><li> Per fotoossidazione, replace buffer con 2 ml di una / ml soluzione di cloridrato diaminobenzidina 1 mg in 0,1 M tampone sodio cacodilato o tampone fosfato. Protect questa soluzione dalla luce e raffreddarlo in ghiaccio a 4 ° C al fine di aumentare la solubilità di ossigeno. Saturare la soluzione con facendovi gorgogliare ossigeno attraverso la soluzione (utilizzare un tubo che viene inserito nella soluzione e collegato ad una bombola di ossigeno). Controllare di nuovo il pH e regolare se necessario. NOTA: E &#39;fondamentale per la reazione fotossidazione che il pH è compreso tra pH 7,0 e pH 7,6. </li><li> Montare il piatto con le cellule fissate con cura su un microscopio a fluorescenza invertito dotato di una lente obiettivo 40x olio di immersione e spostarlo l&#39;area di interesse. Excite il tag miniSOG con luce blu utilizzando cubi filtro per GFP o PCP. MiniSOG ha un massimo di eccitazione a 448 nm con una spalla a 473 nm 10. </li><li> Continuare con l&#39;illuminazione, anche dopo il verde miniSOG fluorescenza ettaris completamente scomparsi e finché il prodotto fotoossidazione marrone della diaminobenzidina polimerizzata emerge nel canale luce trasmessa. Quando il prodotto di ossidazione è visibile nella maggior parte delle cellule, disattivare l&#39;illuminazione a fluorescenza per arrestare la foto-ossidazione. NOTA: Foto-ossidazione può richiedere diversi minuti a seconda della lente dell&#39;obiettivo, le lunghezze d&#39;onda di trasmissione filtro e l&#39;efficienza, e la sorgente di illuminazione. </li><li> Postfix le cellule con 1 ml di 2% glutaraldeide in 0,1 M di sodio cacodilato pH 7,4 tampone o tampone fosfato pH 7,4 per 30 min. </li><li> Fissare le membrane delle cellule con 0,1% -0,5% tetrossido di osmio per 20 min in 0,1 M tampone sodio cacodilato pH 7,4 o 0,1 M tampone fosfato a pH 7,4. NOTA: si consiglia di utilizzare la concentrazione più bassa possibile di tetrossido di osmio necessario per stabilizzare le membrane. Poiché i precipitati DAB polimerizzate presentano un&#39;alta densità di azoto, che può essere rilevata direttamente da ESI, un forteosmio colorazione non è necessario per identificare la proteina miniSOG-tag e potrebbe essere dannoso per la ESI. Tetrossido di osmio è molto tossica! Lavorare in una cappa aspirante e smaltire adeguatamente i rifiuti tossici. </li><li> Disidratare le cellule attraverso una serie di etanolo usando 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100% etanolo (passaggi ogni 5 min). Successivamente, incubare le cellule in una miscela 1: 1 di etanolo al 100% e resina acrilica (LR bianco) e mettere il piatto su un agitatore per 4 ore per facilitare l&#39;infiltrazione nelle cellule prima incubando le cellule per almeno un altro 4 ore a 100 resina acrilica% (LR bianco). </li><li> Per polimerizzare la resina, tagliare il coperchio di una etichetta provetta 2 ml con una lama di rasoio e rivestire il cerchio con acceleratore resina acrilica. Assicurarsi che l&#39;acceleratore copre solo il cerchio e non scorre nel tubo. Successivamente, compilare accuratamente il tubo di circa due terzi con resina LR bianco con una pipetta Pasteur. Fare attenzione che la resina non entrare in contatto with l&#39;acceleratore sul cerchio! </li><li> Rimuovere la resina che infiltrato le cellule nel piatto e posizionare il piatto capovolto sul tubo microcentrifuga permanente posizione verticale in modo che la larghezza del tubo riempie quasi completamente la finestra di osservazione di vetro rivestita del piatto. </li><li> Attendere 1 per 2 min per l&#39;acceleratore per sigillare il tubo e il vetrino, poi invertire il tubo in modo che la resina nel tubo ora copre le cellule. </li><li> Porre la capsula con il tubo in un forno a 60 ° C e curare per 12 hr. </li><li> Quando il blocco viene guarito, rimuovere il piatto con la resina-riempito provetta attaccata dal forno e separare la provetta dal piatto. Facilitare la separazione dai cicli di gelo e disgelo in azoto liquido e acqua calda. </li><li> Eliminare il piatto fondo di vetro e tagliare con attenzione aprire la provetta con una lametta per rimuovere il blocco. </li><li> Etichettare il blocco con un pennarello indelebile. </li><li> Utilizzare una lama di rasoio per trim il blocco in modo che solo la regione 1 mm 2 che contiene l&#39;area precedentemente segnato con la penna diamante o tungsteno (o contiene l&#39;area con le cellule di interesse) rimane. </li><li> Montare il blocco in un ultramicrotomo, tagliare il blocco con un coltello taglio e tagliare sezioni ultrasottili di circa 50 nm con un coltello di diamante. </li><li> Raccogliete le sezioni ad alta trasmissione 300 reti mesh. Queste griglie sono molto piccoli bar griglia e coprono quindi un minor numero di cellule nella zona di interesse. </li><li> Cappotto sezioni sulle griglie con circa 0,2-0,4 nm di carbonio utilizzando un dispositivo a induzione di carbonio per aiutarli a stabilizzare sotto il fascio di elettroni del TEM. </li></ol> 5. Microscopia Elettronica <ol><li> Caricare le griglie in un TEM che è dotato di un filtro di energia. Dopo aver sintonizzato il microscopio e il filtro di energia in base alle istruzioni del fabbricante, controllare le celle delle sezioni in modalità basso ingrandimento (trasmissione normale) e confrontareloro di fluorescenza dei dati quando opportuno (ottenuto nel passaggio 4.4). </li><li> Una volta che un nucleo con caratteristiche interessanti (danni al DNA delle tracce o riparazione del DNA foci) viene trovato, passare alla modalità di filtraggio energia e registrare una mappa di spessore. NOTA: Questa procedura include la registrazione di una perdita zero e un&#39;immagine non filtrata. Spessori fino a 0,3 cammino libero medio (30% degli elettroni del fascio incidente viene dispersa dal campione) sono abbastanza sottile per generare buone mappe elementari. </li><li> Mappe rapporto record di fosforo e azoto elementi utilizzando il software che controlla il filtro energia del microscopio utilizzato. Registrare le immagini successive fosforo mappa giuntati a 175 eV perdita di energia con una larghezza di 20 eV feritoia e pre-edge immagini a 120 eV perdita di energia, anche con una larghezza di 20 eV feritoia. Per le mappe di azoto, registrare immagini successive giuntati a 447 eV con fenditura di 35 eV e pre-edge immagini a 358 eV, anche con una larghezza di 35 eV feritoia. NOTA: Poiché il contenuto degli elementi di immagine (phosphOrus e azoto) è relativamente bassa (circa. 1%), scegliere &quot;Rapporto Immagine&quot; (qualitativa mappa elementale) sopra il &quot;metodo 3 finestra&quot; (quantificare mappa elementale) al fine di generare immagini con un segnale migliore di rumore. </li></ol> Elaborazione 6. Immagine <ol><li> Aprire le mappe rapporto elementari in un software di elaborazione delle immagini in grado di gestire il formato file delle immagini acquisite (ad esempio, Digital Micrograph). Copiare la mappa azoto nel canale rosso e la mappa di fosforo nel canale verde di un&#39;immagine RGB, sovrapporre e allineare le mappe. </li><li> Esportare l&#39;immagine composita come un file di formato di file di immagine con tag (TIFF). Apri l&#39;immagine con un software di elaborazione di immagini che può utilizzare strati (ad esempio, Photoshop). </li><li> Regolare la gamma dinamica di ciascun canale di riscalare i valori minimo e nell&#39;immagine di un set di dati a 8 bit (da 0 a 255). </li><li> Sottrarre il fosforo dalla mappa di azoto (utilizzando laFinestra &quot;livelli&quot;) al fine di generare una mappa qualitativa che mostra la distribuzione delle proteine. </li><li> Convertire le mappe del acido nucleico (fosforo) e proteine ​​(azoto) creato nella fase precedente in &quot;scala di colore&quot; e creare una tabella di ricerca gialla nello spazio colore CMYK per la mappa che mostra la distribuzione degli acidi nucleici e un tavolo ciano di ricerca per visualizzare la carta non nucleoproteina. I colori sono scelti per generare il massimo contrasto tra le due mappe elementari. </li><li> Creare una nuova immagine e importare i mappe che mostrano le distribuzioni di fosforo e proteine ​​come diversi strati. Utilizzare la modalità di trasparenza &quot;schermo&quot; per vedere entrambi gli strati sovrapposti l&#39;uno sull&#39;altro. </li><li> Aprite l&#39;immagine a perdita zero acquisito nel passaggio 5.2. Questa immagine rappresenta un&#39;immagine dell&#39;area registrata che assomiglia un&#39;immagine TEM convenzionale, ma contiene solo gli elettroni che sono passati attraverso il campione senza urtare il campione. Esportazionequesta immagine come immagine TIFF. </li><li> Aprite l&#39;immagine perdita pari a zero esportato in un editor di foto e copiarlo nella strato superiore della immagine che mostra la mappa elementare. Allineare l&#39;immagine utilizzando la modalità di trasparenza &quot;schermo&quot;. </li><li> Facoltativamente soglia dell&#39;immagine perdita zero per segmentare il segnale che proviene dal miniSOG. Aggiungere l&#39;immagine risultante come livello separato come descritto sopra. </li></ol>

<ol><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).</li>
<li>Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometric+analysis+of+protein-+and+nucleic+acid-based+structures+in+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Micron+%28Oxford%2C+England%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus.</a> Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).</li>
<li>Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Visualization+of+a+Protein+Nuclear+Architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture.</a> Molecular biology of the cell. 10, 2051(1999).</li>
<li>Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+microanalysis+of+biological+specimens+by+electron+energy+loss+spectroscopy+and+by+electron+spectroscopic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+ultrastructure+research%22%5BJournal%5D)">High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging.</a> Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).</li>
<li>Leapman, R. D., Ornberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).</li>
<li>Simon, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+spectroscopic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrastructural+pathology%22%5BJournal%5D)">Electron spectroscopic imaging.</a> Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).</li>
<li>Egerton, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEgerton%2C+R+%22Electron+Energy-Loss+Spectroscopy+in+the+Electron+Microscope%22">Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+thickness+correction+of+EFTEM+phosphorus+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps.</a> Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).</li>
<li>Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+molecules+employing+horseradish+peroxidase+as+reporter+enzyme+for+protein+localization+in+the+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope.</a> Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).</li>
<li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells%2C+Tissues%2C+and+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLoS biology. 9, e1001041(2011).</li>
<li>Gaietta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).</li>
<li>Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+on+foci%3A+H2AX+and+the+recruitment+of+DNA-damage+response+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).</li>
<li>Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+foci+of+mammalian+Rad51+recombination+protein+in+somatic+cells+after+DNA+damage+and+its+localization+in+synaptonemal+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).</li>
<li>Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hMre11+and+hRad50+nuclear+foci+are+induced+during+the+normal+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).</li>
<li>Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+function+of+DNA+double-strand+break+repair+foci+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells.</a> DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).</li>
<li>Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1-associated+exclusion+of+53BP1+from+DNA+damage+sites+underlies+temporal+control+of+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair.</a> Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).</li>
<li>Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+imaging+of+changes+in+the+structure+and+spatial+organization+of+chromatin%2C+gamma-H2A.X+and+the+MRN+complex+within+etoposide-induced+DNA+repair+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).</li>
<li>Kruhlak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+chromatin+structure+and+mobility+in+living+cells+at+sites+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).</li>
<li>Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+cell+lines+expressing+GFP-tubulin+and+photoactivatable-GFP-tubulin+and+characterization+of+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).</li>
<li>Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+sorting+conditions+for+the+selection+of+stable%2C+high-producing+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+progress%22%5BJournal%5D)">Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines.</a> Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).</li>
<li>Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+electron+spectroscopic+imaging+of+chromatin+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ.</a> Methods in enzymology. , 375-456 (2004).</li>
<li>Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+repressive+complex+2+contributes+to+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair.</a> Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).</li>
<li>Mortusewicz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+RNA+polymerase+II+cofactor+PC4+to+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites.</a> J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).</li>
<li>Bekker-Jensen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+mammalian+genome+surveillance+machinery+in+response+to+DNA+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).</li>
<li>Ferrando-May, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highlighting+the+DNA+damage+response+with+ultrashort+laser+pulses+in+the+near+infrared+and+kinetic+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+genetics%22%5BJournal%5D)">Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling.</a> Frontiers in genetics. 4, 135(2013).</li>
<li>Lukas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+nuclear+bodies+form+around+DNA+lesions+generated+by+mitotic+transmission+of+chromosomes+under+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress.</a> Nature. 13, 243-253 (2011).</li>
<li>Harrigan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+stress+induces+53BP1-containing+OPT+domains+in+G1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells.</a> The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).</li>
<li>Aronova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprint+of+%27Three-dimensional+elemental+mapping+of+phosphorus+by+quantitative+electron+spectroscopic+tomography+%28QuEST%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST).</a> J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).</li>
<li>Fussner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+heterochromatin+reorganization+during+somatic+cell+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming.</a> The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).</li>
<li>Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KAP1+depletion+increases+PML+nuclear+body+number+in+concert+with+ultrastructural+changes+in+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin.</a> Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

ESI può servire come un ottimo strumento per l&#39;esame diversi stati di cromatina e ribonucleoproteine ​​nel nucleo, perché è in grado di mappare in particolare le aree che sono ricchi di fosforo. Essa aumenta profondamente la quantità di dettagli che può essere ottenuta con un microscopio elettronico e non dipende opposti metodi non specifici. Uno svantaggio di ESI è che richiede sezioni sottili di TEM convenzionale alla stessa tensione di accelerazione. Questo può essere superato lavorando con sezioni seriali o con ...

Nonostante i progressi significativi nella microscopia ottica negli ultimi anni 1, cell-biologi soffrono ancora di una lacuna nella risoluzione. Questo limita comprensione delle relazioni struttura-funzione nei processi cellulari fondamentali che coinvolgono l&#39;interazione coordinata tra complessi macromolecolari (ad esempio, nel rimodellamento della cromatina, la riparazione del DNA, RNA trascrizione e replicazione del DNA). Sebbene microscopi elettronici a trasmissione (TEM) s fornire la risoluzione richiesta, è stato difficile da definire questi processi strutturalmente a causa della incapacità di etichettare specifiche proteine ​​pur essendo in grado di determinare la composizione biochimica delle strutture visualizzate. In assenza di membrane interne per aiutare a differenziare le strutture nucleari, il nucleo è stato particolarmente impegnativo. Electron spettroscopica di imaging (ESI) risolve alcune di queste limitazioni, consentendo la determinazione e differenziazione di DNA, RNA, e protein-based strutture nucleari 2-5. Elettrone di imaging spettroscopico: Per mappare distribuzioni elementari ad alta sensibilità e risoluzione al microscopio elettronico, si può usare uno spettrometro ad immagine che seleziona elettroni che sono stati anelasticamente dispersi attraverso le interazioni con elettroni guscio interno di un elemento nel campione 6. Poiché specifici dell&#39;elemento quantità di energia vengono persi come conseguenza della ionizzazione degli atomi nel campione, questi elettroni possono essere separati e visualizzati usando uno spettrometro che è collegato al microscopio elettronico. Pertanto, l&#39;analisi dello spettro degli elettroni che hanno interagito con il campione rivela informazioni qualitative e quantitative sulla composizione elementare del campione 7. Gli elettroni che non perdono energia quando passa attraverso il campione si trovano nella &quot;picco perdita zero&quot; della perdita di energia degli elettronispettro. L&#39;abbondanza di questi elettroni è correlato alla massa, densità e spessore del campione e comprende elettroni che passano attraverso il campione senza urtare il campione o perdere energia durante il passaggio attraverso il campione. Queste informazioni possono essere utili per la quantificazione assoluta dei numeri di atomi di un elemento specifico presente nel campione 8. Poiché campioni biologici consistono principalmente di elementi leggeri che mal deviano gli elettroni nel fascio incidente del TEM, metodi di colorazione utilizzando metallo pesante sali devono essere applicate in modo da generare contrasto nel campione. La mancanza di specificità della maggior parte di questi agenti di contrasto e l&#39;incapacità di visualizzare più di una macchia in cui la specificità è possibile ha limitato il valore di microscopia elettronica convenzionale nello studio del nucleo. ESI ha vantaggi significativi rispetto TEM convenzionali, in particolare per lo studio delle strutture del nucleo cellulare.È possibile sfruttare la natura ricca fosforo di DNA e complessi macromolecolari-RNA contenente distinguere complessi nucleoproteici da complessi proteici e risolvere diversi complessi nucleoproteici basate sulla loro densità di acidi nucleici. Il materiale biologico residuo può essere ripreso in base alla sua abbondanza di azoto. Mappatura solo questi due elementi e analisi della loro distribuzione e abbondanza relativa all&#39;interno di diverse strutture anatomiche ci fornisce un sacco di informazioni sul nucleo. Ad esempio, è facile identificare cromatina e ribosomi nella mappa rappresentano fosforo abbondanza. Lo spazio interchromatin, complessi del poro nucleare, e corpi nucleari, invece, possono essere facilmente individuati nell&#39;immagine azoto mappa. Mini sistema di generatore di ossigeno singoletto (miniSOG) Mentre ESI rappresenta una potente tecnica per studiare in situ struttura della cromatina, perché ci vuoles vantaggio dei rapporti caratteristici di composizione elementare tra il fosforo e l&#39;azoto, la composizione elementare non può essere normalmente utilizzati per discriminare tra le diverse popolazioni di complessi proteici. Anticorpi marcati con piccole particelle d&#39;oro nella gamma nanometri sono stati ampiamente utilizzati per mappare la posizione delle singole molecole. Poiché la particella oro viene normalmente collegato a un anticorpo secondario, apparirà entro una circonferenza di circa 20 nm circa l&#39;epitopo rilevato dal anticorpo primario. In campioni successivi-embedding, anticorpi possono rilevare solo epitopi che sono esposte alla superficie delle sezioni. Mentre è possibile dimostrare la presenza di un antigene e si riferiscono ad una certa struttura anatomica della cellula, le informazioni che si ottiene è incompleta, poiché la maggior parte degli epitopi sono oscurati da resina. Tecniche, che utilizzano protocolli simili a quelli utilizzati per la microscopia a fluorescenza Pre-embedding, consentire l&#39;accesso agli antigeni tuttol&#39;intera profondità del campione ma i passi permeabilizzazione necessari per consentire l&#39;anticorpo di penetrare cella tipicamente richiede la rimozione di membrane lipidiche e rimuovere i componenti che non possono essere risolti con aldeidi. Inoltre, il fissativo aldeide preferito per la conservazione ultrastruttura, glutaraldeide, comunemente distrugge epitopi e, di conseguenza, è in genere necessario paraformaldeide. Questo è meno efficace a proteina-proteina reticolazione. Un altro svantaggio di anticorpi che sono etichettati con una nanoparticella di oro è che l&#39;oro è un materiale molto elettron-denso che crea un forte contrasto che possono oscurare interessanti dettagli strutturali del campione, che ha più debole contrasto. L&#39;emergere della proteina verde fluorescente (GFP) come un tag di proteina espressa ha trasformato l&#39;uso di microscopia a fluorescenza per rispondere alle domande di biologia cellulare. Tagging una proteina con un piccolo dominio fluorescente permette mappatura della sua distribuzione in vivo </em&gt; senza la necessità di procedure di permeabilizzazione che possono alterare la struttura. Per tradurre il principio elegante di usare i tag proteine ​​per mappare distribuzioni cellulari delle proteine ​​di microscopia elettronica, un sistema era necessario che sia in grado di produrre un segnale in prossimità della struttura di interesse e generare contrasto nella TEM. Diaminobenzidina polimerizzato è una macchia che viene spesso utilizzato in istologia per rilevare legame degli anticorpi. Questa macchia è di solito depositato con perossidasi (HRP) coniugata con un anticorpo secondario. Sebbene la reazione produce un risultato affidabile, HRP non è cataliticamente attivo nel citosol delle cellule 9. I prodotti di reazione di HRP possono anche diffondono lontano dal sito di generazione in modo che la loro risoluzione è peggiore rispetto al metodo nanogold 10. Per bypassare questi problemi, il sistema / Reash Flash è stato sviluppato 11. È costituita da proteine ​​di fusione ricombinanti che possiedono un motivo tetracysteine. Questo motivo permette vincolanteun fluoroforo biarsenic. Quando eccitato, il flash associato o Reash è in grado di generare l&#39;ossigeno singoletto altamente reattivo e quindi photoconvert diaminobenzidina (DAB) in un polimero che precipita immediatamente al sito delle proteine ​​tag. Il polimero DAB può essere colorato con tetrossido di osmio, che è denso di elettroni e quindi può essere utilizzato per mappare la distribuzione della proteina di fusione ricombinante nel TEM. Nel 2011, Shu et al. 10 presentato il sistema miniSOG, che consiste in un piccolo 106 amino acidi tag fusione derivato da una flavoproteina di Arabidopsis che è fluorescente e in grado di creare molti radicali ossigeno singoletto eccitato con 448 quando nm luce blu. Tali radicali dell&#39;ossigeno singoletto possono essere utilizzati per foto-diaminobenzidina ossidare per formare polimeri sopra e vicino alla superficie della proteina marcata, che è notevolmente più vicino di anticorpi marcati immunogold 11. Mentre il sistema di flash / Reash richiede portare il fluorocromo e la diaminobenzidina nelle cellule prima di fare il fotoconversione, il sistema richiede solo miniSOG diaminobenzidina e luce e in aggiunta è circa due volte più efficace a polimerizzazione diaminobenzidina. Qui, miniSOG è impiegato in combinazione con ESI per mappare l&#39;ultrastruttura di riparazione del DNA focolai. Riparazione del DNA focolai (DRF) DNA non riparato doppie rotture dei filamenti rappresentano una grave minaccia alla cella in quanto possono portare a traslocazioni e la perdita di informazioni genetiche. A sua volta, questo può portare a senescenza, il cancro, e la morte cellulare. Molte proteine ​​che sono coinvolte nella riparazione del DNA a doppia interruzione filo accumulano nei focolai che assemblare intorno a un DNA a doppio filamento pausa 12-14. Anche se la loro funzione non è nota, rappresentano il sito nel nucleo che contiene il DNA a doppio filamento pausa ed è il sito di DNA a doppio filamento break riparazione. Riparazione del DNA foci (DRF) sono stati caratterizzati da microscopio a fluorescenza e servono come biomarcatori per danno al DNA 12,15. Sono massiccio rispetto alle dimensioni della pausa doppio filamento e sono stati considerati relativamente omogenea fino recenti studi di microscopia super-risoluzione rivelato alcune prove di sub-compartimentalizzazione delle molecole all&#39;interno di ogni fuoco 16. Per comprendere come sono organizzati questi siti, è necessario visualizzare tutte le strutture biologiche sottostanti rispetto all&#39;altro. Ciò non può essere ottenuto mediante microscopia a fluorescenza, ma è possibile attraverso microscopia elettronica 17,18. Qui, viene descritto un metodo che combina elettroni spettroscopica con il metodo miniSOG per illustrare il potenziale di questo approccio combinato di esplorare l&#39;ultrastruttura di DNA a doppio filamento break riparazione.

<table><tbody><tr><td>Piastre con fondo in vetro da 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Piastre con fondo in vetro da 35 mm</td><td>grigliate MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD&nbsp;</td><td>Non realizzato per obiettivi ad immersione</td></tr><tr><td>LR Bianco: resina acrilica</td><td>emsdiasum</td><td>14381</td><td></td></tr><tr><td>LR Bianco acceleratore</td><td>emsdiasum</td><td>14385</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diaminobenzidina tetracloridrato 10 mg compresse</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Slim Bar Grids 300 Mesh</td><td>SPI</td><td>1161123</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten-Point Lab Pen</td><td>emsdiasum</td><td>41148</td><td></td></tr><tr><td>Tetrossido di osmio</td><td>emsdiasum</td><td>19100</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Coater 208 carbon</td><td>Cressington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra microtome Leica EM UC6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS5</td><td>Adobe</td><td></td><td>potrebbe funzionare anche con le versioni precedenti</td></tr><tr><td>Digital Micrograph V.2.30</td><td>Gatan</td><td></td><td>potrebbe funzionare anche con le versioni precedenti</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>H-1399</td><td></td></tr><tr><td>Effectene</td><td>Quiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniSOG-Constructs</td><td>Tsien-Lab</td><td></td><td><a href="mailto:tsienlab@yahoo.com">tsienlab@yahoo.com</a></td></tr><tr><td>MDC1 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>53BP1 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rad52 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cesio 137 sorgente di radiazioni "MARCO 1"</td><td>&nbsp;( J.L. Shepherd & Associato)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/FiJi</td><td>open source</td><td></td><td>http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>2 ml Eppendorf tubi</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-146</td><td></td></tr><tr><td>Coltello diamantato ultra 35&deg;</td>Coltello da taglio per <td>diatomee</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultratrim</td><td>Diatomee</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato di sodio triidrato</td><td>emsdiasum</td><td>12300</td><td>Attenzione Tossico!</td></tr><tr><td>Glutaraldeide EM Grado 8%</td><td>emsdiasum</td><td>16020</td><td>Attenzione Tossico!</td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico</td><td>emsdiasum</td><td>21180</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato monobasico</td><td>emsdiasum</td><td>21190</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>emsdiasum</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>Tetrossido di osmio 4% soluzione</td><td>emsdiasum</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Micoscopio a fluorescenza invertita Axiovert 200M</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido</td> <td>cloridricoFisherbrand</td><td>A142-212</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di idrossido di sodio 10M</td><td>Fluka</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Ossigeno</td><td>Medigas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Ammino-1,2,4-triazolo</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>Cianuro di potassio</td><td>Sigma</td><td>207810</td><td>Attenzione Tossico!</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>emsdiasum</td><td>15058</td><td>Attenzione Tossico!</td></tr><tr><td>Lama di rasoio Single Edge in acciaio al carbonio</td><td>emsdiasum</td><td>71960</td><td>Attenzione Sharp!</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D 5546</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Life Technologies</td><td>11811-023</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione 200 kV</td><td>JEOL</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>GIF Tridiem 863 Filtro energetico</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione di minisog tagged proteine ​​di riparazione del dna, in combinazione con electron spettroscopica imaging (esi)

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

I limiti della risoluzione ottica e la sfida di identificare popolazioni di proteine ​​specifiche in microscopia elettronica a trasmissione sono stati gli ostacoli in biologia cellulare. Molti fenomeni non possono essere spiegati mediante analisi in vitro in sistemi semplificati e necessitano di ulteriori informazioni strutturali in situ, in particolare nel campo tra 1 nm e 0,1 micron, per essere pienamente compreso. Qui, electron spettroscopica di imaging, una tecnica di microscopia elettronica di trasmissione che permette la mappatura simultanea della distribuzione delle proteine ​​e acidi nucleici, e un tag espressione, miniSOG, vengono combinati per studiare la struttura e l&#39;organizzazione di DNA a doppio filamento break riparazione foci.

ESI Confrontando le immagini ESI del nucleo (figura 1) con le immagini TEM convenzionali (ad esempio, la Figura 7-1) rivela un drammatico aumento strutture anatomiche che possono essere facilmente distinguibili. Le creste cromatina appaiono in giallo ed è abbastanza facile identificare le chromocenters in cellule di topo. Nucleoli può essere facilmente distinta dalla cromatina dalla loro struttura rotonda e colore diverso, dal momen...

L'imaging spettroscopico elettronico può visualizzare e distinguere l'acido nucleico dalle proteine con una risoluzione nanometrica. Può essere combinato con il sistema miniSOG, che è in grado di marcare in modo specifico le proteine marcate in campioni di microscopia elettronica a trasmissione. Illustriamo l'uso di queste tecnologie utilizzando come esempio i fuochi di riparazione della rottura a doppio filamento.

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è mappare la distribuzione delle proteine di riparazione del DNA attorno alle rotture del DNA a doppio filamento a livello nanometrico. Per studiare l'ultrastruttura della cromatina danneggiata in fase di riparazione mediante imaging spettroscopico elettronico, si generano costrutti di espressione del DNA che codificano per proteine di fusione delle proteine di risposta al danno del DNA, utilizzando una proteina fluorescente e il marcatore mini SOG.Come secondo passaggio, i costrutti vengono introdotti nelle cellule mediante trasfezione, quindi le cellule vengono danneggiate tramite irraggiamento laser o gamma. Successivamente, le cellule irradiate e fissate vengono sottoposte a procedure di preparazione per microscopia elettronica, al fine di rendere visibile la distribuzione della proteina riparatrice marcata con mini SOG al microscopio elettronico. L'immagini spettroscopiche elettroniche risultanti forniscono immagini dettagliate che permettono l'analisi dell'ultrastruttura della cromatina e della relazione tra proteine specifiche e fuochi di riparazione del DNA.Il principale vantaggio di questa tecnologia rispetto ad altre tecnologi

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Vi presentiamo una procedura che bidimensionale agarosio-gel analisi può essere utilizzato per identificare la struttura degli intermedi di replica che si verificano dopo irradiazione UV.

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Visualizzazione basata sull'immunofluorescenza delle interazioni proteiche di riparazione del DNA

Qui, lo studio di diversi approcci di riconoscimento delle lesioni del DNA tramite l'imaging AFM a singola molecola è dimostrato con il sistema di riparazione per escissione nucleotidica come esempio. Vengono descritte le procedure di preparazione dei campioni di DNA e proteine e i dettagli sperimentali e analitici per gli esperimenti AFM.

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Qui viene dimostrato come può essere utilizzato il test di Ligation Proximity (PLA) in situ per rilevare e visualizzare le interazioni proteiche-proteiche dirette tra ATM e p53 nelle colture di cellule di sospensione esposte a stress genotossico.

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Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione

Riparazione di rotture a doppio filamento del DNA è un processo dinamico, che richiede non solo la formazione di complessi di riparazione presso le pause, ma anche la loro risoluzione dopo che la lesione è indirizzata. Qui, usiamo il microscopia di immunofluorescenza per interruzioni di double-stranded transitorie e di lunga durata come strumento per sezionare questo meccanismo di mantenimento del genoma.

Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

In seguito al danno al DNA, le cellule umane attivano percorsi di riparazione essenziali per ripristinare l'integrità del loro genoma. Qui, descriviamo il metodo dell'immunofluorescenza indiretta come mezzo per rilevare le proteine di riparazione del DNA, analizzare il loro reclutamento spaziale e temporale e contribuire a interrogare l'interazione proteina-proteina nei siti di danno al DNA.

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Questo articolo introduce passaggi essenziali di immunosomodulazione e immunoprecipitazione della cromatina. Questi protocolli sono comunemente usati per studiare i processi cellulari legati ai danni al DNA e per visualizzare e quantificare il reclutamento di proteine implicate nella riparazione del DNA.

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Il presente protocollo descrive i metodi per valutare le proteine di riparazione del danno al DNA negli organoidi di cancro ovarico derivati da pazienti. Qui sono inclusi metodi completi di placcatura e colorazione, nonché procedure di quantificazione dettagliate e oggettive.

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Scopri la visualizzazione di proteine di riparazione del DNA marcate con miniSOG mediante imaging spettroscopico elettronico. Questo metodo consente di analizzare l'ultrastruttura della cromatina danneggiata con risoluzione nanometrica.

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