Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

L'obiettivo generale del seguente esperimento è mappare la distribuzione delle proteine di riparazione del DNA attorno alle rotture del DNA a doppio filamento a livello nanometrico. Per studiare l'ultrastruttura della cromatina danneggiata in fase di riparazione mediante imaging spettroscopico elettronico, si generano costrutti di espressione del DNA che codificano per proteine di fusione delle proteine di risposta al danno del DNA, utilizzando una proteina fluorescente e il marcatore mini SOG.

Come secondo passaggio, i costrutti vengono introdotti nelle cellule mediante trasfezione, quindi le cellule vengono danneggiate tramite irraggiamento laser o gamma. Successivamente, le cellule irradiate e fissate vengono sottoposte a procedure di preparazione per microscopia elettronica, al fine di rendere visibile la distribuzione della proteina riparatrice marcata con mini SOG al microscopio elettronico. L'immagini spettroscopiche elettroniche risultanti forniscono immagini dettagliate che permettono l'analisi dell'ultrastruttura della cromatina e della relazione tra proteine specifiche e fuochi di riparazione del DNA.

Il principale vantaggio di questa tecnologia rispetto ad altre tecnologie esistenti, come l'etichettatura con ImmunoGold, è che non dipende dalla disponibilità di anticorpi e che etichetta in modo piuttosto denso le strutture di interesse. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà poiché l'ossidazione fotochimica è molto sensibile al pH, all'intensità della luce e alla saturazione di ossigeno. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, perché i passaggi di ossidazione fotochimica, saturazione di ossigeno e illuminazione sono sensibili a variazioni minime; è quindi importante illustrare nel dettaglio come eseguire il metodo per poterlo riprodurre.

Il dottor Hilmar Fadden, un postdottorato del mio laboratorio, mostrerà il metodo per la coltura. Cellule di osteosarcoma umano che esprimono stabilmente le proteine di riparazione marcate con mini SOG e M cherry come descritto nel protocollo testuale allegato. Dopo aver suddiviso le cellule da una piastra da 10 centimetri, coltivare le cellule fino a un'80% di confluenza.

Successivamente, posizionare le cellule sotto un microscopio a fluorescenza e utilizzare una penna sterile al diamante per delimitare una piccola area di circa un millimetro quadrato contenente cellule che esprimono le proteine ectopiche; una volta marcata, sensibilizzare le cellule aggiungendo herx alla soluzione in modo da ottenere una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per millilitro, quindi collocarle nell'incubatore a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Successivamente, irradiare le cellule con microirradiazione laser utilizzando il laser a stato solido a 405 nanometri di un microscopio confocale al fine di indurre danni al DNA; dopo il danno al DNA, fissare le cellule al buio utilizzando un millilitro di paraformaldeide al 4% in tampone sodico 0,1 molare a temperatura ambiente dopo 30 minuti.

Lavare le cellule due volte con quattro millilitri di tampone al catecolato di sodio 0,1 molare a un pH di 7,4. Successivamente, trattare le cellule fissate con due millilitri di una soluzione contenente 50 millimolari di glicina, cinque millimolari di aminotriazolo e 10 millimolari di cianuro di potassio a un pH di 7,4 per 30 minuti. Sostituire il tampone con due millilitri di tampone per fotoossidazione a un pH di 7,4, preparato come descritto nel protocollo testuale allegato.

Quindi incubare il campione al buio su ghiaccio, insufflando ossigeno nella soluzione per mantenerla satura di ossigeno. Successivamente, montare con attenzione la piastra con le cellule fissate su un microscopio a fluorescenza invertito dotato di un obiettivo ad immersione in olio da 40 x e spostarla sull'area di interesse precedentemente delimitata. Eccitare il tag mini SOG con luce blu utilizzando cubetti filtro per la proteina fluorescente verde.

Continuare con l'illuminazione anche dopo che la fluorescenza verde del mini SOG è completamente scomparsa e fino a quando il prodotto marrone di fotoossidazione della dia amino benadina polimerizzata appare nel canale della luce trasmessa. Quindi fissare le cellule con un millilitro di glutaraldeide al 2% in tampone sodico Cate 0,1 molare a pH 7,4 per 30 minuti.

Successivamente, fissare le membrane cellulari con tetroxido di osmio allo 0,1-0,5% in tampone di catecolato di sodio 0,1 molare per 20 minuti a pH 7,4. Una volta fissate, disidratare le cellule mediante una serie di lavaggi con etanolo. Quindi, incubare le cellule in una miscela uno a uno di etanolo al 100% e resina acrilica su agitatore per quattro ore.

Successivamente, rimuovere la miscela e aggiungere resina acrilica al 100% ai campioni per un ulteriore periodo di quattro ore. Per polimerizzare la resina, tagliare il coperchio di un microtubo centrifugato da due millilitri etichettato con una lametta e ricoprire il bordo con un acceleratore per resina acrilica. Riempire con attenzione il tubo all'incirca per due terzi con resina LR white utilizzando un batuffolo di ovatta.

Si prenda cura che la resina non venga a contatto con l'acceleratore sul bordo. Rimuovere la resina che ha infiltrato le cellule nella piastra e posizionare la piastra capovolta su una provetta microcentrifuga disposta in posizione verticale, in modo che la larghezza della provetta occupi quasi completamente la finestra di osservazione coperta di vetro del peso della piastra. Attendere uno o due minuti affinché l'acceleratore sigilli la provetta e il vetrino.

Quindi capovolgere il tubo in modo che la resina nel tubo copra ora le cellule. Posizionare la piastra con il tubo nel forno a 60 gradi Celsius e polimerizzare per 12 ore. Una volta polimerizzato il blocco, rimuovere la piastra con il microtubo centrifugo riempito di resina dal forno e separare il microtubo centrifugo dalla piastra.

Scartare la capsula di vetro con fondo piatto e tagliare con attenzione il tubo da microcentrifuga con una lametta per rilasciare il blocco. Utilizzando una lametta, rifinire il blocco in modo che rimanga soltanto la regione di un millimetro quadrato contenente l'area precedentemente segnata con la penna al diamante o al tungsteno. Successivamente, montare il blocco su un ultramicrotomo e rifinirlo con un coltello per la rifinitura finché non si raggiungono le cellule.

Quindi passare a un coltello in diamante e tagliare sezioni ultraterne di circa 50 nanometri attraverso le cellule. Raccogliere le sezioni su griglie da 300 mesh ad alta trasmissione. Successivamente, posizionare le griglie in un evaporatore di carbonio e ricoprire le sezioni con circa 0,2-0,4 nanometri di carbonio per stabilizzarle sotto il fascio elettronico del microscopio elettronico a trasmissione.

Inserire le griglie in un microscopio elettronico a trasmissione dotato di filtro energetico. Esaminare le cellule sulle sezioni utilizzando la modalità normale di trasmissione a basso ingrandimento e confrontarle con le immagini a fluorescenza acquisite in precedenza. Una volta individuato un nucleo con una traccia di danno al DNA o foci di riparazione del DNA, passare alla modalità di filtraggio energetico e acquisire il campione con una mappa dello spessore.

Successivamente, registrare le immagini della mappa del fosforo post-edge a 175 electron energy loss con una larghezza di fessura di 20 electron volts. Registrare anche le immagini pre-edge a 120 electron volts di perdita energetica, sempre con una larghezza di fessura di 20 electron volts per la registrazione delle mappe di azoto. Immagini post-edge a 447 electron volts con una larghezza di fessura di 35 electron volts e immagini pre-edge a 358 electron volts.

Anche con una larghezza di fessura di 35 elettronvolt. Aprire le mappe dei rapporti elementari in un software di elaborazione delle immagini come questo. Copiare la mappa dell'azoto nel canale rosso e la mappa del fosforo nel canale verde di un'immagine RGB.

Quindi sovrapporre e allineare le mappe. Esportare l'immagine composita come file in formato tagged image file format e aprire successivamente l'immagine in un software di elaborazione delle immagini in grado di utilizzare livelli. Successivamente, regolare la dinamica di ciascun canale ridimensionando i valori minimo e massimo nell'immagine a un set di dati a otto bit.

Quindi sottrarre il contenuto di fosforo dalla mappa dell'azoto all'interno della finestra dei livelli. Convertire l'immagine in una tavolozza di colori indicizzata e creare una tavolozza di colori gialla nello spazio cromatico CMYK per la mappa che mostra la distribuzione degli acidi nucleici e una tavolozza di colori ciano per mostrare la mappa delle proteine non cromatiniche. Successivamente, creare una nuova immagine e importare le mappe che mostrano le distribuzioni di fosforo e delle proteine non cromatiniche come livelli diversi.

Utilizzare la modalità di trasparenza dello schermo per visualizzare entrambi i livelli sovrapposti l'uno all'altro. Qui sono mostrate mappe di rapporto spettroscopiche elettroniche provenienti dall'interno di un nucleo cellulare, che indicano le localizzazioni di fosforo e azoto quando le due mappe di rapporto vengono sovrapposte nello spazio colore RGB. Un'immagine come quella mostrata qui viene ottenuta in questa immagine.

Le strutture gialle rappresentano proteine nucleari che riflettono la presenza sia di fosforo che di azoto. Qui, l'immagine spettrale elettronica viene utilizzata per osservare i cambiamenti nella struttura dei fuochi dopo l'irradiazione gamma in cellule U2 OS. Nella riga superiore, le immagini di cellule che esprimono stabilmente proteine di riparazione marcate con M cherry mostrano cellule non irradiate.

La seconda riga mostra cellule fissate tre ore dopo la radiazione. La terza riga mostra cellule fissate sei ore dopo la radiazione. L'imaging spettrale elettronico rivela che la struttura dei fuochi sembra riorganizzarsi nel tempo, poiché la quantità relativa della proteina 53BP1 nel fuoco, indicata dall'aumento del segnale dell'azoto, sembra aumentare, mentre la cromatina, indicata dal segnale del fosforo, assume una posizione più periferica.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare cellule irradiate che esprimono proteine di riparazione mini so per analizzare l'ultrastruttura della cromatina nei fuochi di riparazione del DA mediante imaging spettroscopico elettronico. Non dimenticare che lavorare con tampone al cianuro di sodio, cianuro di potassio e ossido di osmio può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come lavorare in una cappa aspirante e indossare guanti devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.