Name: Clonazione e produzione su larga scala di ad alta capacità vettori adenovirali in base al tipo Adenovirus umano 5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Scopri la clonazione e la produzione di vettori adenovirali ad alta capacità basati su Adenovirus umano 5 per la terapia genica. Questo metodo consente di trasferire fino a 35 kb di DNA esogeno in cellule e organismi viventi.

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione DFG EH 192/5-1 (A.E.), dal progetto UE (E-rare-2) Transposmart (A.E.), dall'UWH Forschungsförderung (E.S. e W.Z) e dal programma di dottorato dell'Università Witten/Herdecke (P.B.). J.L. è stato sostenuto da uno stipendio del consiglio cinese per le borse di studio e da T.B. e M.G dalla fondazione Else Kröner-Fresenius (EKFS).

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il protocollo presentato qui permette la purificazione di vettori HCAdV basati su adenovirus umano di tipo 5 basato su procedure descritte in precedenza 4,12. Il genoma HCAdV all&#39;interno del plasmide pAdFTC è privo di tutti i geni di adenovirus e porta solo le 5&#39;- e 3&#39;ITR e il segnale di confezionamento. In questa strategia l&#39;HV AdNG163R-2 4 offre tutti i geni necessari per la produzione di virus efficiente in trans. Questo offre una capacità di confezionamento di fino a 35...

Per applicazioni terapeutiche gene è di grande importanza per evitare effetti collaterali citotossici e immunogenici causate da espressione di proteine ​​virali, il transgene stesso o da proteine ​​virali in arrivo. Adenovirus (adv) sono ampiamente utilizzati per introdurre DNA esogeno in un&#39;ampia varietà di cellule per studiare l&#39;impatto di espressione del transgene 1,2. La versione più avanzata di AdV è rappresentato da adenovirus ad alta capacità (HCAdV) privi di tutte le sequenze codificanti virali 3,4 e offrendo così una capacità di confezionamento fino a 35 kb in combinazione con bassa immunogenicità e bassa tossicità 5-8. Grazie alla loro elevata capacità di confezionamento consentono consegna di grandi o più transgeni utilizzando una singola dose di vettore. Pertanto, essi rappresentano uno strumento prezioso per la comunità di ricerca. A differenza di prima o di seconda generazione AdV privi dei geni precoci E1 e / o E3 che possono essere facilmente prodotti utilizzando kit commerciali, vector costruzione genoma e virus produzione di HCAdV è più complessa. Il sistema per la costruzione di genomi HCAdV si basa sulla pAdFTC plasmide portando un genoma HCAdV privo di tutte le sequenze codificanti virali e il plasmide shuttle pHM5 9-12. Ogni gene di interesse di fino a 14 basi chilo (kb) può essere clonato nel pHM5 navetta vettore in cui il sito di clonaggio multiplo è affiancato da riconoscimento / fendendo siti degli enzimi di homing Pi- Sce I e I-Ceu I. Pertanto, un gene clonato di interesse può essere rilasciato da PI- consecutivo Sce I e I-Ceu io digerisce per successivo inserimento diretto nelle stesse siti di restrizione presenti nel genoma HCAdV contenuta nel pAdFTC plasmide. Nel pAdFTC il sito di inserimento del transgene situato tra il PI- Sce I e I-Ceu io Decolleté siti è fiancheggiato da riempimento del DNA e le sequenze non codificanti adenovirali necessari per il confezionamento genoma tali ripetizioni terminali come il 5 &#39;e 3&#39; invertita (ITR)ad entrambe le estremità e il segnale di confezionamento a valle del 5&#39;ITR. Il DNA addizionale Stuffer fornisce dimensione ottimale del genoma HCAdV finale che vanno da 27 a 36 kb di assicurare imballaggio efficiente durante la produzione di virus. Poiché pAdFTC è una grande plasmide con un massimo di 45 kb (dipende dalla dimensione del transgene inserito) e l&#39;utilizzo di endonucleasi homing con siti di riconoscimento di DNA lunghe comparabilmente presenta forte legame al DNA, più fasi di pulizia sono necessari durante il trasferimento del transgene dal pHM5 a pAdFTC. Si raccomanda la gestione attenta evitando forze di taglio. I ITRs del genoma HCAdV si affiancano Not I siti di riconoscimento dell&#39;enzima di restrizione situati immediatamente a monte ea valle 5&#39;ITR del 3&#39;ITR 12. Pertanto, HCAdV può essere sganciato Non io digerisco per la successiva trasfezione del genoma virale nel linea cellulare produttore HCAdV. Si noti che l&#39;utilizzo di enzima di restrizione Not I per relfacilità del genoma virale dal pAdFTC plasmide implica che il transgene introdotto non privo di siti di riconoscimento Not I DNA. Le cellule produttrici basate cellule HEK293 (116 celle) stabilmente esprimono Cre ricombinasi. Per l&#39;amplificazione virus 116 cellule sono co-infettati con un virus helper (HV) che fornisce tutti i geni ADV necessari per la replica e l&#39;imballaggio in trans 3,4. L&#39;alta tensione è un AdV prima generazione con un segnale di imballaggio floxed che viene rimossa durante l&#39;amplificazione virus Cre ricombinasi espressa in 116 cellule 4. Questo assicura che i genomi prevalentemente HCAdV contenenti un segnale di imballo integro sono encapsidated. Pre-amplificazione del HCAdV viene eseguita effettuando passaggi passaggio in serie in 116 cellule coltivate su una superficie in piastre di coltura dei tessuti. Dopo ogni passaggio particelle virali sono rilasciate dalle cellule infette conducendo tre consecutivi passaggi di congelamento-scongelamento. Con ogni passaggio un numero crescente di cellule sono infettati con1/3 di lisato cellulare dal passaggio precedente. Infine lisato dall&#39;ultima fase di pre-amplificazione viene utilizzato per infettare cellule produttrici coltivate in sospensione in un pallone filatore per larga scala di amplificazione. Virioni sono purificati dalle cellule sospensione eseguendo ultracentrifugazione in una densità di cloruro di cesio gradiente 4,12. Con questa procedura particelle vuote e particelle completamente assemblati vengono separati in due bande distinte. Per concentrare ulteriormente il HCAdV particelle viene eseguita una seconda fase ultracentrifugazione non graduale. Successivamente il gruppo risultante contenente il HCAdV viene raccolto e dializzato contro tampone fisiologico. Preparazioni vettore finali sono caratterizzati in relazione al numero di particelle virali assoluti, particelle infettive e livelli di contaminazione HV. Particelle virali assoluti possono essere determinati mediante lisi particelle virali e misurare l&#39;assorbanza a 260 nm o eseguendo quantitativa real-time PCR (qPCR) 12. Infettività del purparticelle virali da norme possono essere determinate misurando qPCR genomi HCAdV presenti all&#39;interno delle cellule infettate 3 ore dopo l&#39;infezione.

<table><tbody><tr><td>CeuI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0699S</td><td>restrizione digest</td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0696S</td><td>restrizione digest</td></tr><tr><td>T4 Ligasi</td><td>New Engand Biolabs</td><td>M0202S</td><td>legatura SwaI</td></tr><tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>R0604S</td><td>restrizione digest</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td>restrizione digest</td></tr><tr><td>Fosfatasi alcalina intestinale di vitello (CIP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>defosforilazione di plasmidi digeriti</td></tr><tr><td>Igromicina B</td><td>PAN Biotech</td><td>P02-015</td><td>selezione di CRE che esprimono 116 cellule</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03590&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Terreno di coltura cellulare Hek293T</td></tr><tr><td>Terreno essenziale minimo (MEM) Eagle</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-08500</td><td>116 terreno di coltura cellulare&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s tampone fosfato soluzione salina (DPBS)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td>lavaggio delle cellule, risospensione delle cellule</td></tr><tr><td>flacone di conservazione da 250 ml</td><td>Sigma</td><td>CLS430281-24EA</td><td>infezione di 116 cellule coltivate in sospensione</td></tr><tr><td>500 ml PP CentrifugeTubes</td><td>Sigma</td><td>CLS431123-36EA</td><td>sedimentazione di cellule da coltura</td></tr><tr><td>in sospensione Pallone di filatura</td><td>Bellco</td><td>1965-61030</td><td>crescita di 116 cellule in sospensione</td></tr><tr><td>Ultra Clear Provette per ultracentrifuga</td><td>Beckmann Coulter</td><td>344059</td><td>centrifugazione in gradiente di densità</td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckmann Coulter</td><td></td><td>centrifugazione in gradiente di densità</td></tr><tr><td>SW-41 Rotore Beckmann</td><td>Coulter</td><td></td><td>centrifugazione in gradiente di densità</td></tr><tr><td>Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane</td><td>VWR</td><td>132129</td><td>tubi per dialisi</td></tr><tr><td>cassette per dialisi pronte all'uso&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>66383</td><td>dialisi</td></tr><tr><td>one shot DH10B elettrocompetente E. coli</td><td>invitrogen</td><td>C4040-52</td><td>trasformazione delle reazioni di legatura</td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Midiprep System</td><td>Promega</td><td>A2495</td><td>midiprep</td></tr><tr><td>peqGOLD Tissue DNA Mini Kit&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>12-3396-02</td> isolamento <td>di DNA</td></tr><tr><td>genomico SuperFect Transfection</td><td>Reagent Qiagen</td><td>301305</td><td>trasfezione di 116 cellule</td></tr><tr><td>opti MEM (10% FBS)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>trasfezione di 116 cellule</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green</td><td>Supermix BioRad</td><td>&nbsp; 170-8882</td><td>q-PCR</td></tr><tr><td>CFX 96 C1000 touch&nbsp;</td><td>Macchina Biorad</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Fenolo/Cloroformio/Alcool isoamilico&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>A156.1</td><td>purificazione del DNA</td></tr><tr><td>Cloruro di cesio</td><td>Carl Roth</td><td>8627.1</td><td>densità gradiente centrifugazione</td></tr><tr><td>acetato di sodio 99%</td><td>Carl Roth</td><td>6773.2</td><td>Precipitazione del DNA</td></tr><tr><td>LB medium&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.3</td><td>etanolo medio di crescita batterica</td></tr><tr><td>&nbsp; puro al 99,8%</td><td>Carl Roth</td><td>9065.5&nbsp;</td><td>Precipitazione e lavaggio del DNA</td></tr><tr><td>SDS 99,5%</td><td>Carl Roth</td><td>2326.2</td><td>lisi&nbsp; tampone</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td>lisi&nbsp; tampone</td></tr><tr><td>Tris-HCl 99%</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td>tampone per dialisi/lisi&nbsp; tampone</td></tr><tr><td>glicerolo 99,5%</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td>tampone per dialisi</td></tr><tr><td>MgCl2 98.5%</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.2</td><td>tampone per dialisi</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td>tampone per dialisi opzionale</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td>tampone per dialisi opzionale</td></tr><tr><td>saccarosio</td><td>Carl Roth</td><td>9286.1</td><td>tampone per dialisi opzionale</td></tr><tr><td>Na2HPO4x2H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4984.2</td><td>tampone per dialisi opzionale</td></tr><tr><td>provette da 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.730.005</td><td>conservazione di preparati virali a -80 &deg; E</td></tr></tbody></table>

clonazione e produzione su larga scala di ad alta capacità vettori adenovirali in base al tipo adenovirus umano 5

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

I vettori adenovirali ad alta capacità (HCAdV) privi di tutte le sequenze codificanti virali rappresentano uno dei vettori di consegna genica più avanzati grazie alla loro elevata capacità di confezionamento (fino a 35 kb), bassa immunogenicità e bassa tossicità. Tuttavia, per molti laboratori l'uso di HCAdV è ostacolato dalla complicata procedura per la costruzione del genoma del vettore e la produzione di virus. Qui viene descritto un protocollo dettagliato per il clonaggio e la produzione efficiente di HCAdV basato sul plasmide pAdFTC contenente il genoma di HCAdV. La costruzione dei genomi di HCAdV si basa su un sistema di vettori di clonaggio che utilizza endonucleasi di homing (I-CeuI e PI-SceI). Qualsiasi gene di interesse fino a 14 kb può essere subclonato nel vettore shuttle pHM5, che contiene un sito di clonazione multiplo affiancato da I-CeuI e PI-SceI. Dopo il rilascio mediato da I-CeuI e PI-Scedel transgene dal vettore shuttle, il transgene può essere inserito nel vettore di clonazione HCAdV pAdFTC. A causa delle grandi dimensioni del plasmide pAdFTC e dei lunghi siti di riconoscimento degli enzimi utilizzati associati a un forte legame con il DNA, è necessaria un'attenta manipolazione dei frammenti di clonazione. Per la produzione di virus, il genoma HCAdV viene rilasciato dal digestato NotI e trasfettato in una linea cellulare produttrice basata su HEK293 che esprime stabilmente la Cre ricombinasi. Per fornire tutti i geni adenovirali per l'amplificazione dell'adenovirus, è necessaria la co-infezione con un virus helper contenente un segnale di impacchettamento fiancheggiato da siti loxP. La preamplificazione del vettore viene eseguita in cellule produttrici coltivate su superfici e l'amplificazione su larga scala del vettore viene condotta in fiasche rotanti con cellule produttrici coltivate in sospensione. Per la purificazione del virus, vengono eseguite due fasi di ultracentrifugazione basate su gradienti di cloruro di cesio seguite da dialisi. Qui vengono presentati suggerimenti, trucchi e scorciatoie sviluppati negli ultimi anni lavorando con questo sistema vettoriale HCAdV.

Sono mostrati esempi qui rappresentativi per la clonazione, l&#39;amplificazione e la purificazione di preparati HCAdV. Una panoramica della strategia di clonazione (figura 1) ed esempi rappresentativi per la clonazione e il rilascio del genoma HCAdV da enzima di restrizione digerire sono forniti (Figura 2). Un modello di restrizione tipico dopo il rilascio della cassetta GOI-espressione da pHM5 da PI- Sce I e I-Ceu io digerisco e estra...

Viene presentato un protocollo per la generazione di vettori adenovirali ad alta capacità privi di tutte le sequenze di codifica virale. Il clonaggio dei transgeni contenuti nel genoma del vettore si basa sulle endonucleasi di homing. L'amplificazione del virus nelle cellule produttrici cresciute come cellule aderenti e in sospensione si basa su un virus helper che fornisce geni virali in trans.

Clonazione e produzione su larga scala di ad alta capacità vettori adenovirali in base al tipo Adenovirus umano 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre un vettore adenovirale ad alta capacità con geni eliminati, per il trasporto e l'espressione di transgeni terapeutici in cellule o organismi viventi. Questo metodo può aiutare il campo della terapia genica a trasferire transgeni di grandi dimensioni che non possono essere inseriti in altri vettori virali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che gli adenovirus ad alta capacità sono privi di geni virali.Utilizzando questi vettori, è possibile trasferire fino a 35 kb di DNA esogeno. L'applicazione di questa tecnica si estende alla terapia delle malattie ereditarie poiché consente di veicolare interventi terapeutici per la correzione genica o l'aggiunta di geni. Questo metodo fornisce uno strumento avanzato per il trasferimento biologico di transgeni terapeutici ed è applicabile sia in colture cellulari che in organismi viventi.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché l'amplificazione del vettore e la purificazione del vettore richiedono una certa esperienza. È necessario avere la giusta manualità durante la purificazione del vettore. Analizzare un'aliquota di un plasmide di espressione del genoma adenovirale ad alta capacità linearizzato, diluito uno a dieci, mediante elettroforesi su gel.Un frammento di nove chilobasi per il plasmide pAd-FTC e un secondo frammento di DNA di 28-36 chilobasi per il genoma dell'adenovirus ad alta capacità, più il gene di interesse, dovrebbero essere rilevabili. Successivamente, trasfettare una piastra da 60 millimetri di cellule HEK293 a una confluencia del 50-80% con cinque microgrammi del genoma lineare dell'adenovirus ad alta capacità, seguendo le procedure standard. Da 16 a 18 ore dopo la trasfezione, rimuovere con attenzione il mezzo e aggiungere tre millilitri di mezzo fresco.Quindi, infettare le cellule con il virus helper AdNG 163R2, applicando cinque unità trasduttive per cellula. Incubare in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 5% CO2. Agitare la piastra ogni 20 minuti durante la prima ora di incubazione per distribuire uniformemente il virus helper a tutte le cellule.48 ore dopo l'infezione, raccogliere le cellule lavandole dalla piastra di coltura utilizzando il mezzo di coltura. Conservare un'aliquota di 0,5 millilitri delle cellule del passaggio zero per l'isolamento del DNA genomico. Successivamente, sottoporre ripetuti cicli di congelamento/scongelamento un'aliquota di 2,5 millilitri di cellule del passaggio zero immergendola in azoto liquido.O posizionando le cellule nel congelatore a -80 gradi Celsius e successivamente trasferendole in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 3-4 volte. Mescolare 2,5 mL di lisato con 1 mL di mezzo fresco e aggiungere il virus helper a due unità trasformanti per cellula. Aspirare il mezzo da una piastra da 60 mm contenente un sesto di cellule al 90-95% di confluenza e aggiungere la miscela virale alle cellule.Incubare le cellule per 48 ore come in precedenza. Quindi, raccogliere le cellule e ripetere le procedure di congelamento/scongelamento e di infezione due volte per ottenere i lisati del passaggio uno e del passaggio due. Dopo aver ottenuto il lisato del passaggio due, mescolare 2,5 millilitri di lisato con 17,5 millilitri di mezzo fresco e aggiungere due unità trasformanti per cellula di virus helper.Aspirare il mezzo da una piastra da 150 millimetri con cellule al 80-100% di confluenza e infettare le cellule con la miscela virale. 48 ore dopo l'infezione, raccogliere il lisato del passaggio tre utilizzando la procedura appena illustrata. Per iniziare questo passaggio, aggiungere 900 millilitri di mezzo preriscaldato a un flask da coltura spinner da tre litri.Rimuovere il mezzo da almeno 10 piastre singole da 150 millimetri contenenti una uno sei cellule al 90-100% di confluenza. Lavare le cellule con 10 millilitri di mezzo fresco, preriscaldato. Pipettare su e giù diverse volte per ottenere una sospensione cellulare omogenea.E quindi trasferire direttamente le cellule nel flacone agitato. Incubare il flacone agitato su un agitatore magnetico in un'incubatrice per colture cellulari per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Regolare l'agitatore magnetico a 70 giri/min per evitare l'adesione delle cellule alle superfici di vetro.24 ore dopo l'allestimento del flacone per coltura in agitazione, aggiungere 500 millilitri di mezzo fresco. Ripetere questo passaggio nuovamente dopo ulteriori 24 ore. 72 ore dopo l'allestimento della coltura, aggiungere un litro di mezzo fresco al flacone, ottenendo un volume totale di tre litri di sospensione cellulare.24 ore dopo, raccogliere le cellule in sospensione one one six mediante centrifugazione per dieci minuti a 500 ×g a temperatura ambiente. Eliminare il soprannatante e risospendere il pellet in 150 millilitri di mezzo, pipettando su e gi&ugrave; circa da otto a dieci volte. Trasferire le cellule in un flacone da 250 millilitri per conservazione, dotato di un’asta magnetica sterile.Quindi, co-infettare le cellule con il lisato del passaggio tre e due unità trasformanti di virus helper per cellula. In questo caso, il numero totale di cellule è di circa nove per dieci alla ottava cellule; pertanto, vengono aggiunte uno virgola otto per dieci alla nona unità trasformanti. Mescolare la miscela di cellule e virus su un agitatore magnetico nell'incubatore per colture cellulari per due ore a 60 giri al minuto.Assicurarsi che il flacone di conservazione non sia completamente chiuso per permettere la circolazione dell'aria. Due ore dopo l'infezione, trasferire il volume totale della miscela cellulare con il virus nel flacone da tre litri per coltura in agitazione. Aggiungere 1850 millilitri di mezzo fresco, preriscaldato e incubare nell'incubatrice per colture cellulari per 48 ore a 70 giri al minuto (RPM).Dopo 48 ore, trasferire la sospensione cellulare del virus in provette da centrifuga da 500 millilitri. Quindi, centrifugare per 10 minuti a 890 ×g a temperatura ambiente. Rimuovere il mezzo e risospendere le cellule in pellet in un volume totale di 28 millilitri di DPBS.Conservare la sospensione cellulare del virus a meno 80 gradi Celsius fino al momento della purificazione del virus. Per preparare il lisato virale alla purificazione mediante gradiente al cloruro di cesio, sottoporre la sospensione cellulare del virus a quattro cicli di congelamento/scongelamento. Successivamente, centrifugare il lisato virale a 500 ×g per otto minuti a temperatura ambiente.Quindi, raccogliere il surnatante contenente l'adenovirus ad alta capacità. Pipettare con attenzione e lentamente le soluzioni di cloruro di cesio nei tubi nel seguente ordine: 0,5 millilitri di soluzione da 1,5 grammi per centimetro cubo, tre millilitri di soluzione da 1,35 grammi per centimetro cubo e 3,5 millilitri di soluzione da 1,25 grammi per centimetro cubo. Sovrapporre circa 4,5 millilitri di surnatante del vettore chiarificato sopra lo strato da 1,25 grammi per centimetro cubo.Centrifugare i gradienti in una ultracentrifuga utilizzando un rotore a benna oscillante a 12 gradi Celsius per almeno due ore a 226.000 ×g per separare le particelle virali contenenti il genoma adenovirale ad alta capacità dalle particelle vuote e dai detriti cellulari. Al termine della centrifugazione, si forma una banda diffusa di detriti cellulari in cima ai tubi. Al di sotto di questa, possono essere osservate due bande bianche.La banda superiore contiene particelle vuote, mentre quella inferiore è l'adenovirus ad alta capacità. Rimuovere con attenzione gli strati di detriti cellulari e le particelle vuote. Quindi, raccogliere un millilitro delle bande inferiori da ogni provetta.Trasferire il virus in un tubo sterile da 50 millilitri. Aggiungere fino a 24 millilitri di soluzione di cloruro di cesio 1,35 grammi per centimetro cubo alle particelle virali raccolte e mescolare con cura. Riempire i tubi della centrifuga fino all'orlo con soluzione virale di cloruro di cesio 1,35 grammi per centimetro cubo.Quindi centrifugare tutta la notte a 226.000 ×g a 12 gradi Celsius in una ultracentrifuga utilizzando un rotore a pendolo con accelerazione e decelerazione lente. Rimuovere i livelli superiori dalla parte superiore mediante pipetta. Successivamente, raccogliere l'adenovirus ad alta capacità presente nella marcata banda inferiore utilizzando una nuova punta di pipetta.Infine, eseguire la dialisi delle particelle virali raccolte per lo scambio di buffer. Successivamente, determinare il titolo della preparazione finale seguendo le istruzioni dettagliate nel protocollo scritto. Questo istogramma mostra i numeri assoluti di particelle per una singola preparazione di vettore, determinati con tre metodi diversi: titolo misurato per densità ottica (OD), titolo di infezioni e contaminazione da virus helper misurata mediante qPCR.Il rapporto tra le particelle totali di adenovirus ad alta capacità infettive e i livelli di contaminazione da virus helper misurati mediante qPCR è mostrato qui. Se un gene marcatore fluorescente è presente nel vettore, è possibile eseguire una microscopia fluorescente per monitorare la pre-amplificazione del vettore e caratterizzare l'infettività della preparazione finale del vettore. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre adenovirus ad alta capacità con geni eliminati.Soprattutto come inserire il transgene e come amplificare e purificare i vettori.

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Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Negli ultimi 15 anni, i vettori derivati dall'adenovirus canino di tipo 2 (CAV2) hanno dimostrato la loro efficienza nel trasdurre cellule in vitro e in vivo e sono ampiamente utilizzati per la vaccinazione e la terapia genica. Qui descriviamo una procedura per costruire, produrre e purificare vettori CAV2, dando origine a sospensioni virali ad alto titolo.

Produzione e purificazione di vettori derivati dall'adenovirus canino di tipo 2 non replicativo

Qui, vi presentiamo un protocollo per generare una prova di principio di tipo bivalente adenovirus 5 (Ad5) vettore Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 utilizzando la strategia di Antigen Capside-incorporazione. Questo vettore è stato dimostrato per esporre idoneità qualitativa, la capacità di sfuggire sieri Ad5-positivi in vitro, e l'antigenicità e immunogenicità agli antigeni incorporati.

Utilizzando la strategia di Antigen Capside-Incorporation per lo sviluppo di approcci Adenovirus sierotipo 5 Vectored vaccino

Qui, descriviamo una strategia efficiente e riproducibile per produrre, titolo e batch di controllo di qualità di vettori di virus adeno-associato. Permette all'utente di ottenere una preparazione di vettore con alto-titolo (≥ 1 x 1013 vettoriale genomi/mL) e un'elevata purezza, pronta per l'uso in vitro o in vivo .

Produzione, purificazione e controllo di qualità per i vettori basati su Virus Adeno-associato

Qui, presentiamo un protocollo per la produzione di adenovirus utilizzando il sistema pAdEasy. La tecnologia include la ricombinazione dei plasmidi pAdTrack e pAdEasy-1, l'imballaggio e l'amplificazione dell'adenovirus, la purificazione delle particelle adenovirali dal litorato cellulare e dal mezzo di coltura, la titolazione virale e il test funzionale dell'adenovirus.

Un metodo efficiente per la produzione di adenovirus

Qui forniamo una procedura dettagliata per la produzione su larga scala di vettori AAV di grado di ricerca utilizzando cellule HEK 293 aderenti coltivate in pile cellulari e purificazione cromatografica di affinità. Questo protocollo produce costantemente &gt;1 x 1013 genomi vettoriali / mL, fornendo quantità vettoriali appropriate per studi su animali di grandi dimensioni.

Produzione di vettori virali adeno-associati in pile cellulari per studi preclinici in modelli animali di grandi dimensioni

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