Generazione di scalabili, Metallic Tacchi-Aspect nanocompositi Rapporto in un Biologica Liquid Media

L'obiettivo generale di questa procedura è generare compositi micro e nano lineari con un elevato rapporto di aspetto, utilizzando materiali di partenza contenenti rame e cisteina. Questo risultato si ottiene innanzitutto combinando nanoparticelle di rame sottoposte a sonificazione o solfato di rame con cistina e acqua in un flacone sterile provvisto di sfiato. Il secondo passaggio della sintesi consiste nel posizionare i componenti combinati nel flacone all'interno di un incubatore con 5% di CO2 a 37 gradi Celsius per almeno sei ore.

Successivamente, il pallone viene ispezionato ad occhio nudo e mediante microscopia a luce bianca. Per determinare il grado di formazione delle strutture lineari, l'ultimo passaggio consiste nell'interruzione della sintesi posizionando il pallone di sintesi in un frigorifero mantenuto a quattro gradi Celsius. Infine, si utilizza la microscopia digitale per caratterizzare le strutture sintetizzate. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la posizione dell'elettrodo, è che la sintesi descritta può essere facilmente scalata in forma liquida e il processo avviene in condizioni fisiologiche.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi di malattie come il cancro, poiché le strutture sintetizzate possono essere degradate dalle cellule, offrendo potenzialmente un mezzo per somministrare farmaci. Ebbi per la prima volta l'idea di questo metodo quando stavamo conducendo esperimenti per valutare la tossicità potenziale di diversi nanomateriali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché gli ultimi passaggi della sintesi possono risultare difficili da apprendere.

Procedure errate possono portare alla formazione di strutture aggregate o all'assenza totale di strutture. Per eseguire la sintesi mediante autoassemblaggio utilizzando nanoparticelle di rame o CMP, preparare una soluzione di nanoparticelle di rame pesando almeno due milligrammi di CMP. Indossare guanti monouso durante questo passaggio per evitare possibili contatti dei CMP con la pelle.

Posizionare le nanoparticelle in un vial di vetro sterile vuoto da 16 millilitri insieme al vial contenente i CMP. Aggiungere acqua deionizzata sterile nel volume appropriato per ottenere una soluzione di due milligrammi per millilitro e vorticare la soluzione per 20 secondi per garantire la dispersione delle nanoparticelle prima dell'inizio della sintesi. Non riempire il vial oltre metà con acqua, poiché ciò potrebbe inibire il processo.

Mescolare mediante vortex provoca il rapido deposito dei CMP sul fondo della provetta, assumendo un colore scuro. Sonicare la soluzione di CNP per 17 minuti a temperatura ambiente per garantire una dispersione massima dei CMP prima dell'inizio della sintesi. Verificare periodicamente che i CMP si stiano mescolando a seguito della sonica; dopo una sonica riuscita, i CMP rimangono sospesi in soluzione per almeno 30 minuti e la soluzione appare di colore scuro.

Pesare 7,29 milligrammi di cistina per la sintesi. Poiché la cistina non è direttamente solubile in acqua, aggiungere la cistina in un contenitore di pesatura antistatico al contenitore contenente la cisteina. Aggiungere un volume sufficiente di idrossido di sodio sterile 1 M in modo che la cistina si sciolga completamente, ottenendo una soluzione di 72,9 milligrammi per millilitro.

Sciogliere completamente la cisteina in 100 microlitri di idrossido di sodio uno molare. Successivamente, mescolare sette microlitri di cisteina disciolta con 6.643 microlitri di acqua sterile in un matraccio da sintesi sterile. Posizionare il matraccio con la soluzione mescolata nell'incubatrice per 30 minuti a 37 gradi Celsius, con il tappo del matraccio aerato per garantire un'efficace miscelazione.

Questa sarà la soluzione lavorativa di cisteina. Ripesare la soluzione di CNP da due milligrammi per millilitro mediante vortex per 30 secondi, poiché i CMP si saranno depositati dopo il passaggio di sonificazione, per un volume totale di sintesi di sette millilitri. Trasferire la soluzione lavorativa di cisteina in un’ampolla da coltura cellulare da 25 centimetri quadrati e aggiungere 350 microlitri di CMP risospesi.

Sostituire il tappo sul flacone e avvitarlo bene in modo che sia ben chiuso. Dopo aver combinato tutti i componenti per la sintesi, mescolare delicatamente il flacone agitandolo con movimenti circolari per quattro o cinque volte. Posizionare il flacone nell'incubatrice a anidride carbonica e sfiatare il flacone allentando leggermente il tappo in modo da permettere lo scambio gassoso all'interno e all'esterno del flacone.

Durante la sintesi, lasciare avvenire la reazione nell'incubatrice per circa 24 ore. Durante questo processo, è possibile osservare al microscopio e ad occhio nudo la formazione di compositi altamente lineari. Questo passaggio è fondamentale per assicurare che si stiano formando alcune strutture e che il processo di autoassemblaggio non prosegua per un tempo eccessivo.

Terminare la sintesi dei biocompositi una volta osservate strutture lineari nel flacone chiudendo ermeticamente il flacone di sintesi, etichettare il flacone con le condizioni di sintesi, inclusa la data di utilizzo della sintesi e dell'incubazione, e l'ora della sintesi prima della terminazione. Successivamente, conservare il contenitore in frigorifero poiché le strutture generate rimangono stabili in questa forma per almeno un anno. In alternativa, per eseguire la sintesi di autoassemblaggio utilizzando solfato di rame, sostituire i CMP con sale di solfato di rame usando una tecnica sterile, sciogliendo almeno due milligrammi di solfato di rame in un volume sufficiente di acqua deionizzata sterile per ottenere una soluzione di due milligrammi per millilitro.

I cristalli di solfato di rame si disciolgono facilmente in soluzione a questa concentrazione, ma se necessario agitare il vial mediante vortex ed esaminare ad occhio nudo per assicurarsi che tutti i cristalli siano completamente sciolti dopo la preparazione del solfato di rame. Eseguire la sintesi come appena dimostrato, sostituendo i CMP con il solfato di rame. Caratterizzare i biocompositi ottenuti dai CMP e dal solfato di rame mediante microscopia a luce bianca e microscopia elettronica per la caratterizzazione e l'ispezione dei biocompositi.

La parasintesi mediante microscopia a luce bianca utilizza un microscopio invertito. I composti si depositeranno sulla superficie inferiore del matraccio entro pochi minuti dopo aver posizionato il matraccio in posizione orizzontale e potranno quindi essere messi a fuoco. Utilizzare l'impostazione a campo chiaro del microscopio per massimizzare il contrasto tra i biocompositi e il mezzo liquido. I composti derivati da CMP e solfato di rame appariranno entrambi di colore trasparente fino a opaco, mentre gli aggregati di CNP non reagiti appariranno di colore molto scuro.

Utilizzare la microscopia ottica a campo chiaro invertita per valutare l'efficacia della sintesi in un determinato esperimento. Ad esempio, documentare la presenza o l'assenza di CMP non reattivi nella sintesi. Le provette utilizzate per i biocompositi derivati da CNP provengono da provette con parametri diversi, come il tempo di incubazione o la durata della sonificazione.

I singoli CMP sono troppo piccoli per essere osservati con un microscopio ottico, ma gli aggregati di CNP inattivi appariranno come oggetti scuri e di forma rotonda. Questo è in contrasto con i compositi di CNP sintetizzati con successo, che avranno un elevato rapporto di forma, una forma lineare e una gamma di lunghezze diverse. Evitare di proseguire la sintesi per un periodo di tempo troppo lungo prima della sua interruzione, poiché ciò porterà alla formazione di strutture altamente ramificate di tipo riccio, difficili da disperdere in strutture individuali una volta formate.

Utilizzare anche la microscopia ottica a contrasto di fase per valutare l'efficacia della sintesi in un determinato esperimento utilizzando solfato di rame. Poiché il solfato di rame va completamente in soluzione, seguendo questo protocollo, la soluzione apparirà meno scura rispetto alla soluzione ottenuta mediante sintesi con CMPs.

Documentare le dimensioni e l'estensione dei composti di solfato di rame confrontando i flaconi con diverse condizioni di sintesi, come il tempo di sintesi prima della terminazione. Per concentrare i composti bio mediante parasintesi, aggiungere prima sei millilitri di strutture derivate da CNP o strutture derivate da solfato di rame in un tubo da centrifuga da 15 millilitri. Centrifugare per 10 minuti a 500 ×g e a temperatura ambiente per formare un pellet per volumi più piccoli.

Aggiungere 500 microlitri di strutture in soluzione a tubi da 0,6 millilitri, centrifugare a 2000 ×g e a temperatura ambiente per almeno 10 minuti per formare un pellet. Collocare le strutture in acqua deionizzata sterile e sottoporre a sonicazione per almeno 10 minuti per risospendere. Applicando ripetutamente questo processo nel tempo, le strutture diventano frammentate e più piccole in lunghezza media.

Documentare le variazioni delle dimensioni dei composti in funzione dei diversi tempi di sonificazione utilizzando un microscopio ottico invertito e una fotocamera digitale; i nostri risultati rappresentativi derivano dalla scoperta di biocompositi nel mezzo di coltura cellulare: dopo 82 ore, le dispersioni iniziali uniformi di CMP si aggregano in microstrutture. Nel tempo, le particelle vengono eliminate e si formano aggregati più grandi. Infine, compaiono aggregati più grandi con strutture lineari che formano strutture di tipo riccio.

Viene mostrata la trasformazione dei CMP in compositi biologici lineari. I CMP sono stati combinati con cisteina e acqua a partire da dispersioni iniziali omogenee di CMP. Dopo tre ore si formano aggregati con microstrutture, mentre strutture intermedie si formano entro le sei ore.

Strutture con elevato rapporto di forma formate mediante microscopia elettronica. La caratterizzazione dei biocompositi sintetizzati ottenuta mediante microscopia elettronica a trasmissione mostra il materiale di partenza CNP con i compositi lineari in formazione; i CMP sono rotondeggianti, come mostrato dalla microscopia elettronica a scansione o SEM. Le caratteristiche nano e micro dei compositi formati da CMP e cisteina sono mostrate mediante SEM.

Le caratteristiche dei composti formati da solfato di rame e cisteina sono illustrate anche mediante microscopia elettronica a scansione con spettroscopia dispersiva di energia. È mostrata l'analisi elementare mediante spettroscopia X a dispersione di energia dei materiali di partenza e dei componenti lineari sintetizzati. I CMP di partenza mostrano un picco evidente di rame senza zolfo.

I biocompositi ottenuti da CMP e cistina mostrano l'emergere di picchi di zolfo e carbonio dovuti alla cistina a partire dal solfato di rame. Il materiale mostra picchi per rame e zolfo. I biocompositi ottenuti da solfato di rame e cistina mostrano l'emergere di picchi per carbonio dovuti alla cistina. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 12-24 ore se eseguita correttamente.

Nel corso di questa procedura, è importante ricordare di monitorare l'avanzamento della sintesi sia ad occhio nudo che al microscopio, in modo che le strutture sintetizzate non diventino troppo aggregate. Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'etichettatura fluorescente delle strutture, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se le strutture sintetizzate si legano alle cellule. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare i reagenti per la sintesi, combinarli correttamente, monitorare l'avanzamento della sintesi e concentrare e modificare le strutture dopo la sintesi.