Name: Induzione diretta di Hemogenic endotelio e Sangue da sovraespressione di fattori di trascrizione in cellule staminali pluripotenti umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Scopri come indurre endotelio emogenico e cellule ematopoietiche da cellule staminali pluripotenti umane mediante sovraespressione di fattori di trascrizione. Questo metodo consente di studiare la transizione endotelio-ematopoietica in vitro.

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Ringraziamo Matt Raymond per l'assistenza editoriale. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi del National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221 e P51 RR000167) e della Charlotte Geyer Foundation.

1. Preparativi Virus e fattore di trascrizione combinazioni <ol><li> Preparare soluzioni con PSIN-EF1α lentivirale plasmide di espressione contenente proteine ​​DNA codificante per ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 e LMO2 (Tabella 1). </li><li> Misurare la concentrazione e la purezza dei preparati plasmide usato per la produzione lentivirale registrando assorbimento UV con uno spettrofotometro a 230 nm, 260 nm e 280 nm. Nota: Preparati DNA dimostrano A260 / 280 e A260 / 230 valori superiori a 1.8 sono generalmente considerati di buona qualità. Lower A260 / 280 valori possono indicare contaminazione di proteine, mentre bassi valori A260 / 230 indicano le impurità con sali o qualche solvente quale il fenolo. Concentrazione plasmide consigliato è di 1-3 mg / mL. </li><li> Produrre lentivirus per trasduzioni come descritto in protocolli precedentemente pubblicati 11. Induzione di SE con un potenziale pan-mieloide richiede un co-espressione di ETV2 e GATA1, o ETV2 e GATA2.Induzione di SE con un potenziale erythro- e megacariocitica richiede GATA2 e TAL1. L&#39;aggiunta di LMO2 migliora significativamente la resa di cellule eritro-megacariocitica dal hPSCs in presenza di GATA2 e TAL1 10. </li></ol> 2. hPSCs Cultura protocollo <ol><li> Crescere cellule staminali pluripotenti in colonie stretti con bordi taglienti al 70-80% di confluenza prima subcoltura. Mark e rimuovere spontaneamente differenziati colonie prima passaging cellule. </li><li> Diluire commerciale gel matrice extracellulare (vedi Tabella 2) secondo le istruzioni del produttore e piastre coat 6 pozzetti notte a 4 ° C, o per almeno un&#39;ora a 37 ° C prima dell&#39;uso. Prima passaging cellule, aspirare la matrice, aggiungere 2 ml di fresco culturemedium completo commerciale (vedi Tabella 2) e tenere le piastre a 37 ° C, 5% CO 2 finché le cellule sono pronte per la semina. </li><li> HPSCs Passage <ol><li> Aspirate mezzo da un pozzetto confluenti di una piastra da 6 pozzetti con hPSCs e aggiungere 1,5 ml di soluzione di pre-riscaldato dispasi II (2 mg / ml in DMEM / F12, sterilizzata mediante filtrazione attraverso filtri 0,22 micron). Incubare per 5-7 minuti a 37 ° C, 5% CO 2 finché i bordi di colonie cominciano a sollevare dalla superficie. </li><li> Aspirare soluzione dispasi II e lavare accuratamente le colonie due volte con l&#39;aggiunta e poi aspirando 2 ml di fresco medio DMEM / F12. Quindi, utilizzando un 5 ml sierologica pipetta di vetro, dissociare hPSCs con 3 ml di terreno di coltura fresco commerciale completa (vedi Tabella 2) pipettando sospensione cellulare su e giù diverse volte. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti contenente 1,5 ml di mezzo di coltura completo commerciale (vedi Tabella 2). Agitare piatto avanti e indietro e da destra a sinistra diverse volte per garantire una distribuzione uniforme delle cellule quando collocare la piastra nell&#39;incubatore. Mantenere cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per 18-24 ore. </li><li> Il prossimo cambiamento giorno medio e fresco commerciale terreno di coltura completo (vedi Tabella 2) ed esaminare hPSCs morfologia. Risultati passaging successo in piccole colonie, ben attaccati, di sostegno HPSC morfologia. hPSCs devono essere alimentati con 2,5-3 ml freshmedium per bene su una base quotidiana e diversi passaggi ogni 4-5 giorni a non più del 70-80% di confluenza. NOTA: Se hiPSCs sono stati mantenuti su fibroblasti embrionali di topo (MEF), hanno bisogno di essere trasferiti in condizioni prive di alimentazione e diversi passaggi 2-3 volte prima di trasduzione per garantire la differenziazione efficiente. </li></ol></li></ol> 3. Induzione di Hematoendothelial Pprecursors da hPSCs (giorno 0, trasduzione di hPSCs) <ol><li> Per preparare mezzo di reazione si combinano 1,3 ml di terreno completo commerciale privo di siero (vedi Tabella 2), virus, polibrene, e Y27632 inibitore ROCK (Tabella 1): aggiungere 1,3 ml di inibitore ROCK 10 mm a 1,3 ml di mezzo ad una concentrazione finalezione di 10 pM, e polibrene una concentrazione finale 6 mg / ml. <ol><li> Aggiungere una quantità appropriata di concentrato virale (s) ad una concentrazione finale di 0,5-1,0 MOI (molteplicità di infezione) di ogni virus per cellula. Mantenere mezzo di reazione in ghiaccio oa 4 ° C fino a quando la sospensione di cellule singole è pronto. NOTA: La stessa quantità di MOI per ogni virus nel GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, e miscele GATA2 / TAL1 / reazione LMO2 è ottimale per l&#39;induzione della differenziazione. Culture Tuttavia, in ETV2 / GATA2 trasdotte raddoppio MOI per GATA2, relativi a ETV2, migliora la differenziazione. Pertanto, per queste culture, rapporto 1: 2 per MOI di ETV2 e 1 MOI di GATA2 è raccomandato (ad esempio, se concentrato virale è stimato a circa 6,8 x 10 7 particelle / ml, aggiungere 10 ml di ETV2 e 20 ml di concentrati virali GATA2 a 0,68 x 10 6 cellule per una reazione ETV2 / GATA2 in un pozzo 35 millimetri di un 6-pozzetti). </li></ol></li><li> Preparare hPSCs in una singola cella di sospensione. <ol><li> Crescere hPSCs in condizioni di assenza di alimentazione, come descritto nella sezione 2. Il giorno 4 dopo l&#39;ultimo passaggio, osservare densità cellulare e la morfologia sotto un microscopio invertito. hPSCs dovrebbero crescere in colonie stretti con spigoli vivi senza differenziazione spontanea e raggiungere ~ 60-70% di confluenza il giorno della trasduzione. </li><li> Aspirare il terreno, aggiungere 1,5-2 ml di reagente commerciale dissociazione delle cellule (Tabella 1) per pozzetto e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 per 5-7 minuti. </li><li> Raccogliere le cellule in volumi uguali di terreno completo commerciale (vedi tabella 2) con 10 micron di inibitore ROCK, contare le cellule e determinare la vitalità. Cellule pellet per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti e poi risospendere le cellule in terreno completo commerciale con 10 pM di inibitore ROCK ad una concentrazione di 3.4-5 x 10 6 cellule per ml. NOTA: La vitalità cellulare è fondamentale per la trasduzione virale di successo e la successiva differenziazione.Tipicamente, la vitalità cellulare prima trasduzione deve superare il 90%. </li></ol></li><li> Aggiungere 200 microlitri della sospensione cellulare, contenenti 0.68-1 x10 6 cellule in 1,3 ml di mezzo di reazione preparata in 3.1. </li><li> Aspirare la soluzione matrice dal rivestita 6 pozzetti durante la notte preparato in 2.2., Trasferire la miscela di reazione ad un pozzetto di un 6-pozzetti e distribuire le cellule in modo uniforme. Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 per 24 ore. Dopo 24 ore almeno l&#39;80% delle cellule deve essere collegato alla matrice. </li></ol> 4. Induzione Hematoendothelial precursori da hPSCs (giorno 1-7) <ol><li> 24 ore dopo la trasduzione, rimuovere medio virus contenente e lavare le cellule attaccate con commerciale terreno di coltura cellulare incompleto (vedi Tabella 1) e poi aggiungere 3 ml per pozzetto di commerciale terreno di coltura cellulare incompleto contenente citochine ematopoietiche: SCF 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml, bFGF 20 ng / ml (di seguito denominati 3F-medium). </li><li> Sostituire medio totale con fresco 3F-media nei giorni 2, 3 e 4 giorno per rimuovere le cellule morte e detriti. Dopo 4 giorni, quando le cellule ematopoietiche galleggianti stanno emergendo, sostituire la metà del 3F-medio ogni altro giorno, mantenendo il volume totale a 4 ml. NOTA: PSIN-EF1α plasmidi di espressione lentivirali incorporano puromicina gene di resistenza consentendo così la selezione positiva di cellule trasdotte. Il 1 ug / ml di puromicina può essere aggiunto a un terreno durante i primi 1-2 giorni di differenziazione per eliminare gli eventuali residui hPSCs indifferenziate. </li><li> Osservare morfologia cellulare il giorno 4 sotto un microscopio invertito: gruppi ristretti di cellule con morfologia tipica endoteliali iniziano a comparire (figure 2A, 3A). Globuli rotondi appare dal giorno 5 al 7 ° giorno di differenziazione, mentre alcune aree possono mantenere hPSCs morfologia. Analizzare HE e differenziazione ematopoietiche come descritto di seguito. NOTA: Riuscito diverso hematoendothelialiation provoca la produzione di globuli che appaiono cellule rotonde come rifrangenti vagamente attaccato alle cellule endoteliali piatte sottostanti. Queste cellule proliferano attivamente formando piccoli aggregati, ed eventualmente staccare e galleggiante (Figure 2A e 3A). Cellule del sangue dal vivo possono essere visivamente distinta dalle cellule morte e morenti in base alla loro capacità di riflettere la luce ed espandere in condizioni di coltura. </li></ol> 5. Analisi di Hemogenic endotelio (HE) Fase di differenziazione. <ol><li> Rilevare la formazione di HE tra i giorni 3 e 4 di differenziazione mediante osservazione microscopica delle cellule con morfologia endoteliale. Non ci sono globuli galleggianti in coltura in questa fase di differenziazione. La presenza di SE può essere confermata mediante colorazione immunofluorescenza e citometria a flusso di analisi utilizzando anticorpi VE-caderina, CD73, CD43 e CD226. <ol><li> Per valutare la formazione di HE by cellule utilizzare l&#39;analisi di citometria a flusso il giorno 3e il giorno 4 da un esperimento. Raccogliere le cellule incubando di culture con reagente commerciale dissociazione delle cellule (vedi Tabella 1) per 5-10 minuti a 37 ° C, 5% di CO 2 e quindi utilizzare fino a 1 x 10 5 cellule per reazione di colorazione (citometria a flusso procedura di colorazione descritta 12). NOTA: VE-caderina + HE cellule acquisiscono espressione della precoce ematopoietiche marcatore CD226, ma manca l&#39;espressione di CD73 e CD43 6. Al contrario, le cellule non esprimono CD73 HE (figure 2B, 3B). </li></ol></li><li> Immunofluorescenza per HPSC di derivazione HE. <ol><li> Lavare il monostrato di cellule allegata con tampone fosfato (PBS) e quindi fissare le cellule in 4% paraformaldeide da 30 a 60 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule nuovamente con PBS e quindi permeabilize usando 0,1% Triton X-100 in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule in PBS due a tre volte e poi incubaretampone di bloccaggio costituito da PBS con siero fetale bovino 10% (FBS), per 30 a 120 min. </li><li> Preparare la soluzione di colorazione, contenente entrambi gli anticorpi primari (1: 1.000 diluizione) topo CD43 anti-umana e di coniglio anti-umane VE-caderina in PBS con 5% FBS, (Tabella 1). </li><li> Aspirare il tampone di bloccaggio dalle cellule e aggiungere 1 ml per pozzetto di tampone colorazione con gli anticorpi primari aggiunti; incubare 3 ore a temperatura ambiente, o per una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule tre volte con l&#39;aggiunta di 2 ml di PBS con 5% FBS. </li><li> Preparare un secondo buffer di colorazione, contenente anticorpi secondari a diluizione 1: 500 in PBS con 5% FBS: asino anti-coniglio coniugato con colorante fluorescente verde, e anti-topo coniugato con colorante fluorescente rosso (Tabella 1). Aggiungere 1 ml per pozzetto di tampone colorazione secondaria e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare tre volte con PBS senza siero. Cellule macchia con 300 Nm DAPI soluzione di lavoro in dH2 O per 10-15 minuti. </li><li> Lavare le cellule con PBS due volte e aggiungere 2-3 ml di PBS in bene con cellule colorate. Osservare fluorescenza con filtri microscopio verde, rosso e blu. </li></ol></li></ol> 6. Analisi della indotte ematopoietiche precursori <ol><li> Mantenere colture differenziazione fino cellule galleggianti espandono significativamente, fino a 10-14 giorni, cambiando la metà del 3F-mezzo, come descritto in 3.1, ogni due giorni. </li><li> Dissociano raccogli differenziando monostrati di cellule trattando le cellule con un reagente di dissociazione cellulare commerciale (vedi Tabella 1) per 5-10 min a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Eseguire la citometria a flusso utilizzando anti-VE-caderina, anticorpi CD43 e CD45 per valutare emopoiesi nelle culture 12. Si noti che una grande frazione di cellule, fino al 40% delle cellule ETV2 e GATA2 trasdotte, co-esprime VE-cad e CD43. Gli anticorpi seguenti possono essere utilizzati per individuare linee cellulari specifiche e seguentiXpansion o differenziazione dei progenitori indotte sangue: CD235a (cellule eritroidi), CD41a (megacariocitica), CD32 (tutti i tipi di cellule mieloidi), CD66b (neutrofili) e CD163 (macrofagi). </li><li> Eseguire CFC-dosaggio con un mezzo clonogenico commerciale (Tabella 1) secondo le istruzioni del produttore. <ol><li> Trasferire 1-2 x 10 4 cellule in 3 ml di terreno clonogenica commerciale (vedi Tabella 3) per valutare il numero di cellule che formano colonie e tipi di colonie ematopoietiche. Ottimale densità di semina consente l&#39;identificazione e l&#39;isolamento di singole colonie che crescono separatamente gli uni dagli altri e non si sovrappongono. Densità di semina può variare tra esperimenti in base all&#39;efficienza differenziazione, ma non dovrebbe superare 1 x 10 4 cellule per 1 ml di terreno clonogenica commerciale. </li><li> Mescolare cellule in terreno clonogenica commerciale vortexando gentilmente, e trasferire 3 ml di sospensione per due 35 millimetri piatti ultra-basso di attaccoper CFC test, 1,5 ml di sospensione di ogni piatto. Distribuire uniformemente media e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 14 giorni. Evitare di disturbare i piatti; osservare la formazione di colonie il giorno 7 e il giorno 10 del test. </li><li> Identificare e contare le colonie ematopoietiche, secondo le loro morfologie il giorno 14. </li></ol></li></ol>

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</ol>

IS è socio fondatore e consulente per Cynata.

Il metodo sopra descritto per ematopoietiche differenziazione hPSCs di sovraespressione di TF, rappresenta un metodo veloce ed efficace per la generazione di HE e mieloidi e erytho-magakaryocytic progenitori da hESC e iPSCs, consentendo in tal modo la produzione di fino a 30 milioni di cellule del sangue dal un milione di cellule staminali pluripotenti 10. Questo metodo esposto differenziazione consistente in più di hESC e iPSCs linee 10. Durante differenziazione per ETV2 e GATA2, fattori GATA1 non...

La capacità unica di cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) per auto-rinnovarsi e di differenziarsi in cellule di tre foglietti embrionali, compreso il sangue, li rendono uno strumento prezioso per gli studi meccanicistici di sviluppo ematopoietiche, la modellazione di malattie del sangue, lo screening di stupefacenti, studi di tossicità, e lo sviluppo di terapie cellulari. Perché la formazione del sangue nei proventi embrioni da endotelio hemogenic (HE) attraverso una transizione ematopoietiche endoteliale 1,2, la generazione di SE nelle culture sarebbe essenziale per studiare i meccanismi molecolari che regolano la endoteliale transizione ematopoietiche e le specifiche ematopoietiche. Metodi attuali per studi di HE si basano sull&#39;induzione di differenziazione hematoendothelial in aggregati (EBS) con l&#39;aggiunta di citochine ematopoietiche 3-5, e di co-coltura con cellule stromali hPSCs Emopoiesi-solidale 6,7 o nelle culture bidimensionali con extracellulare matrici e cytokines 8,9. Questi metodi di differenziazione classici si basano sull&#39;introduzione di segnali esterni che agiscono sulla superficie cellulare e avvio cascate di percorsi molecolari che conducono alla attivazione del programma trascrizionale guidare lo sviluppo hematoendothelial. Quindi, l&#39;efficienza di hPSCs differenziazioni in questi sistemi si basa su una induzione effettivo di questi segnali, la trasduzione del segnale al nucleo, e l&#39;attivazione di specifiche risultante regolatori trascrizionali. Inoltre, lo studio di HE in colture di differenziazione convenzionali richiede l&#39;ulteriore fase di isolare HE cellule usando separazione delle cellule. Qui, descriviamo un semplice protocollo per l&#39;induzione diretta di SE e sangue sovraespressione di fattori di trascrizione ematopoietiche. Questo metodo consente l&#39;induzione efficiente HE in un piatto e osservazione diretta della endoteliale transizione ematopoietiche senza la necessità di isolamento di HE utilizzando una procedura di ordinamento cellule ingombrante. Formazione di SE e del sangue da cellule staminali umane pluripotenti possono essere efficacemente indotti da iperespressione pochi fattori di trascrizione (TFS). La combinazione ottimale di TF in grado di indurre robusto emopoiesi pan-mieloide da hPSCs include ETV2 e GATA1 o GATA2. Al contrario, la combinazione di GATA2 e TAL1 induce erythromegakaryocytopoiesis 10. Programmazione hPSCs attraverso la sovraespressione di questi fattori differenzia hPSCs direttamente al VE-cad + CD43 - CD73 - HE cellule che acquisiscono gradualmente il fenotipo ematopoietiche definito mediante l&#39;espressione dei primi ematopoietiche marcatore CD43 7. Questo metodo basato lentivirali-per la programmazione diretta del metodo di cellule staminali pluripotenti umane è applicabile per la generazione di HE e cellule del sangue per studi meccanicistici, studi di endoteliale di transizione ematopoietiche e regolazione trascrizionale di sviluppo ematopoietiche e le specifiche. Sebbene la cprotocollo orrente descrive la produzione di sangue usando l&#39;espressione costitutiva dei transgeni, risultati simili possono essere ottenuti utilizzando modificato mRNA 10.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Table 1. Induzione della differenziazione delle hPSC con fattori di trascrizione e analisi dell'endotelio emogenico e delle cellule del sangue.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmide #61061</td><td>Vettore lentivirale</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmide #61063</td><td>Vettore lentivirale</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmide #61062</td><td>Vettore lentivirale</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmide #61062</td><td>Vettore lentivirale</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmide #61064</td><td>Vettore lentivirale</td></tr><tr><td>Esadimetrina bromuro (Polybrene)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>Polimero cationico utilizzato per aumentare l'efficienza dell'infezione</td></tr><tr><td>Y-27632 (dicloridrato) Inibitore di ROCK</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td>Inibitore della via RHO/ROCK Inibisce ROCK</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/ stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>A11105-01</td><td>Reagente</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> di dissociazione cellulare <tr><td>Terreno di coltura incompleto (privo di fattore di crescita)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; mTeSR1 Formulazione personalizzata&nbsp;</td><td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td><td>MCF</td><td><a name="GAMMA! D12">Terreno mTeSR1 senza siero senza bFGF e TGFb&nbsp; </a></td></tr><tr><td>umano SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>TPO umano</td> di grado premium <td>Peprotech</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>FGF umano di grado</td> di ricerca <td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>CD144 (VE-cad) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>560411</td><td>Marcatore endoteliale (FACS)</td></tr><tr><td>CD226 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>338305</td><td>Ematopoietico ( FACS)</td></tr><tr><td>CD43 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560199</td><td>Ematopoietico (FACS)</td></tr><tr><td>CD73 APC</td><td>R& Sistemi D</td><td>FAB5795A</td><td>marcatore endoteliale (FACS)</td></tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555485</td><td>Hematopoietic (FACS)</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Life Technologies</td><td>A1310</td><td>Live/Dead assay (FACS)</td></tr><tr><td>Paraformaldeide&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Fissazione cellulare&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML&nbsp;</td><td>Permeabilizzazione&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003</td><td>Siero fetale bovino</td></tr><tr><td>Mouse anti-umano CD43</td><td>BD Biosciences</td><td>551457</td><td>Anticorpo primario puro per la colorazione in immunofluorescenza (IF) Coniglio</td></tr><tr><td>anti-umano VE-caderina</td><td>BenderMedSystem</td><td>BMS158</td><td>Primario (IF)</td></tr><tr><td>Anti-coniglio Alexa Fluor 488-coniugato</td><td>JacksonResearch</td><td>715-486-152</td><td>Secondario (IF)</td></tr><tr><td>Anti-topo Alexa Fluor 594-coniugato</td><td>JacksonResearch</td><td>715-516-150&nbsp;</td><td>Secondario (IF)</td></tr><tr><td>Colorazione con acido nucleico DAPI</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>D1306&nbsp;</td><td>Saggio vivo/morto (IF)</td></tr><tr><td>Terreno clonogenico MethoCult H4435 Enriched</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>4435</td><td>Saggio CFC</td></tr><tr><td>Soluzione di colorazione di Wright</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>32857</td><td>Colorazione di citospin<</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table 2. hPSCs culture.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)&nbsp;</td><td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td><td>hESCs (WA01, WA09) cellule staminali embrionali umane; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) cellule staminali pluripotenti indotte senza transgeni</td><td>hPSCs hPSCs sono in grado di auto-rinnovarsi e di differenziarsi in cellule di tre strati germinali</td></tr><tr><td>Terreno completo privo di siero per la coltura di hPSCs&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; mTeSR1 media&nbsp; &nbsp;</td><td>Istituto di ricerca WiCell (Madison, WI)</td><td>M500&nbsp;</td><td>Terreno privo di siero con fattori di crescita per colture prive di feeder di ESC/iPSC</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscienze / Corning&nbsp;</td><td>356234</td><td>Matrice per il mantenimento di ESC / iPSC umane</td></tr><tr><td>DMEM / F-12, polvere</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>12500-062</td><td>Mezzo basale&nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's PBS polvere</td><td>Fisher Scientific</td><td>dSH30013.04</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Dispase II, polvere</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>17105-041</td><td>Proteasi neutra, dissociazione cellulare</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome del primer</td><td>Forward (Fwd)&nbsp; 5' -->3' </td><td>Reverse (Rev) 5'-->3' </td><td>Descrizione&nbsp; </td></tr><tr><td>pSIN EF1a Fwd</td><td>TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA</td><td>--</td><td>EF1a sequenza promotore</td></tr><tr><td>GATA1 Rev</td><td>-</td><td>-TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC</td><td>&nbsp; Regione di codifica&nbsp;</td></tr><tr><td>GATA2 Rev</td><td>--</td><td>GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG</td><td>&nbsp; Regione di codifica&nbsp;</td></tr><tr><td>TAL1 Rev</td><td>--</td><td>AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT</td><td>&nbsp; Regione di codifica&nbsp;</td></tr><tr><td>LMO2 Rev</td><td>--</td><td>GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC</td><td>&nbsp; Regione di codifica&nbsp;</td></tr><tr><td>ETV2 Rev</td><td>--</td><td>GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC</td><td>&nbsp; Regione di codifica&nbsp;</td></tr></tbody></table>

induzione diretta di hemogenic endotelio e sangue da sovraespressione di fattori di trascrizione in cellule staminali pluripotenti umane

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Durante lo sviluppo, cellule ematopoietiche derivano da un sottoinsieme specializzato di cellule endoteliali, endotelio hemogenic (HE). Modellazione sviluppo HE in vitro è essenziale per gli studi meccanicistici della transizione endoteliale-ematopoietiche e le specifiche ematopoietiche. Qui, si descrive un metodo per l&#39;induzione efficiente di SE da cellule umane pluripotenti staminali (hPSCs) mediante sovraespressione di diverse serie di fattori di trascrizione. La combinazione di ETV2 e GATA1 o GATA2 TF viene usato per indurre HE con potenziale pan-mieloide, mentre una combinazione di fattori di trascrizione e GATA2 TAL1 consente la produzione di HE con eritroide e potenziale megacariocitica. L&#39;aggiunta di LMO2 a GATA2 e la combinazione TAL1 accelera notevolmente il differenziamento eritroide e aumenta e le cellule megacariociti produzione. Questo metodo fornisce un mezzo efficace e rapido di induzione HE da hPSCs e permette l&#39;osservazione del endoteliale-hematopoietic transizione in un piatto di coltura. Il protocollo comprende le procedure hPSCs trasduzione e analisi post-trasduzione di SE e progenitori sangue.

Lo schema di SE e induzione sangue da hPSCs di sovraespressione di fattori di trascrizione è mostrato in Figura 1. ETV2 con combinazione GATA1 o GATA2 induce emopoiesi pan-mieloide, mentre un GATA2, TAL1 +/- combinazione LMO2 induce emopoiesi prevalentemente eritro-megacariocitica. Entrambe le combinazioni TF direttamente indotto cellule HE che in seguito trasformati in progenitori di sangue con una gamma diversa di differenziazione ematopoietiche. Differenziazione delle hPSCs dallo sta...

Questo protocollo descrive l'efficiente induzione dell'endotelio emogenico e dei progenitori ematopoietici multipotenziali da cellule staminali pluripotenti umane attraverso l'espressione forzata di fattori di trascrizione.

Induzione diretta di Hemogenic endotelio e Sangue da sovraespressione di fattori di trascrizione in cellule staminali pluripotenti umane

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule ematiche eritroidi e mieloidi da cellule staminali pluripotenti umane mediante l'espressione forzata di fattori di trascrizione. Questo metodo è applicabile per la generazione di endotelio omogeneo in cellule ematiche per studi sul passaggio endoteliale verso l'epo e sulla regolazione trascrizionale dello sviluppo e della specificazione dell'epo. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce un mezzo inefficace e rapido per l'induzione di endotelio omogeneo da cellule staminali umane, consentendo l'osservazione del passaggio ematico endoteliale in una piastra di coltura cellulare.La dottoressa Bruske, assistente di ricerca nel laboratorio del dottor Lin, illustrerà la procedura. Prima di iniziare, rivestire le piastre a sei pozzetti con una matrice extracellulare come Matrigel, diluendola secondo le istruzioni del produttore e versandola nei pozzetti. Incubare le piastre per 30-60 minuti a 37 gradi Celsius. Per il mezzo di trasduzione, preparare aliquote di lentivirus per ogni serie di trasduzione in modo che la stima della molteplicità di infezione (MOI) tra virus e cellule sia di un virus per cellula, mantenendole a 4 gradi Celsius.Successivamente, combinare il mezzo completo senza siero per i virus hbsc poly brain fino a una concentrazione finale di sei microgrammi per millilitro e l'inibitore ROCK Y 2 7 6 3 2 fino a una concentrazione finale di 10 micromolari, in un volume totale di 1,3 millilitri per ogni serie di trasduzione, e porre le miscele sul ghiaccio per preparare le cellule. Iniziare con un lotto sano di cellule staminali pluripotenti al 70% di confluenza, circa quattro giorni dopo il passaggio precedente. Se le cellule staminali pluripotenti umane erano state mantenute in maps, devono essere trasferite in condizioni senza feeder, da due a tre passaggi prima degli esperimenti di trasduzione, e devono rappresentare colture di cellule staminali pluripotenti sane.Privi di differenziamento spontaneo. Aspirare il mezzo per cellule staminali pluripotenti umane e aggiungere due millilitri di soluzione di distacco enzimatico, come Accutase, per ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti, incubando la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per cinque a sette minuti. Successivamente, aggiungere due millilitri di mezzo completo contenente 10 micromolar di inibitore della chinasi ROCK e raccogliere le cellule distaccate.Dopo aver preparato una sospensione cellulare omogenea, prelevare un piccolo aliquota e contare le cellule vitali mediante il metodo di esclusione del blu di tripano. Successivamente, centrifugare le cellule a 200 × g per cinque minuti e risospendere il pellet in mezzo completo contenente l'inibitore ROCK a 10 micromolare, ad una concentrazione finale di 3,4 × 10⁶ cellule vive per millilitro. Quindi aggiungere 200 microlitri di sospensione cellulare contenente 0,68 × 10⁶ cellule in ciascuno dei 1,3 millilitri di mezzo di trasduzione preparato in precedenza.Rimuovere la piastra a sei pozzetti rivestita con matrice da 37 a gradi Celsius. Successivamente, aspirare la soluzione di matrice e trasferire ciascuna delle miscele di trasduzione in un pozzetto, quindi ruotare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente le cellule nel pozzetto. 24 ore.Dopo la trasduzione, visualizzare le pozzette al microscopio per assicurarsi che almeno l'80% delle cellule sia aderito. Scartare la soluzione virale e lavare le cellule aderenti con mezzo incompleto privo di fattori di crescita. Successivamente, aggiungere tre millilitri di mezzo integrato con citochine, indicato come mezzo tre F, alle cellule.Incubare le cellule durante la notte il giorno successivo. Cambiare il mezzo con mezzo F fresco contenente un microgrammo per millilitro di puromicina, al fine di eliminare le cellule residue non trasdotte.Sostituire questo mezzo ogni 24 ore per rimuovere le cellule morte. Dopo 48 ore dal trattamento, interrompere la puromicina e utilizzare solo mezzo F fresco al giorno quattro. Dopo la trasduzione, osservare le cellule al microscopio per verificare la comparsa di cellule aggregate con morfologia endoteliale, al fine di determinare la formazione di cellule emo-endoteliali.Associare innanzitutto le cellule tra il terzo e il quarto giorno dalla piastra di coltura con la soluzione di distacco cellulare. Raccogliere le cellule distaccate in mezzo completo e centrifugarle, quindi risospendere le cellule nel buffer max a temperatura ambiente e contare le cellule con un emocitometro; successivamente, incubare un milione di cellule per reazione di marcatura con gli anticorpi appropriati per la rilevazione di v catrina, CD226, CD73 e CD43. Marcatori della superficie cellulare.Il flusso citometrico viene eseguito come descritto nel protocollo testuale a partire dal giorno quattro. Dopo la trasduzione, proseguire la differenziazione delle cellule sostituendo metà del mezzo di coltura in ogni pozzetto ogni 48 ore; tra i cinque e i sette giorni compariranno cellule ematiche rotonde aggregate in modo lasso e sospese al di sopra dello strato di cellule endoteliali. Mantenere le colture fino a 14 giorni, periodo durante il quale le cellule in sospensione dovrebbero espandersi in modo significativo.Analisi mediante citometria a flusso di ETV due, gata uno e ETV due. Le cellule trasdotte con Gata due mostrano la formazione di un emodermis terin-positivo, identificabile mediante l'espressione di CD 2 26 e l'assenza di espressione di CD 73 al terzo-quarto giorno di differenziazione. L'analisi mediante citometria a flusso di ETV due, gata uno e ETV due mostra l'induzione di cellule ematiche esprimenti CD 43 al settimo giorno.Dopo la trasduzione, l'analisi mediante citometria a flusso delle cellule indotte da gata two TAL one LMO two al giorno 14 mostra la formazione di cellule ematiche che esprimono CD 2 35 A e CD 41 A. Preparati di citosina colorati di cellule ematopoietiche indotte da gata two TAL one lmo two hanno mostrato morfologie di eritroidi, macrofagi e cellule megacariocitiche negli assay di formazione di colonie. La trasduzione di cellule staminali pluripotenti umane può essere eseguita in meno di un'ora durante l'esecuzione della procedura di trasduzione. È importante considerare sempre la vitalità delle cellule staminali, includere l'inibitore di ROCK nella miscela di reazione e utilizzare una quantità ottimale di virus per cellula nei primi tre giorni.Dopo la trasduzione, possono essere eseguiti metodi come l'immunomarcatura, il saggio di formazione di colonie e la citometria a flusso, al fine di rispondere a domande riguardo l'efficienza della differenziazione e al tipo di malattia ematica indotta. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come dimensionare e infettare cellule staminali pluripotenti umane e di cosa aspettarsi nelle colture in differenziazione nei primi sette-dieci giorni. Dopo che i fattori di trascrizione sono stati consegnati con successo nelle cellule staminali umane, le cellule perdono la loro pluripotenza e si impegnano gradualmente verso un destino ematopoietico.Pertanto, i ricercatori disporranno di un pratico modello in vitro per studiare i meccanismi molecolari della transizione da endoteliale a ematopoietica. Non dimenticare che lavorare con regioni contenenti lentivirus può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale e smaltire correttamente i virus contenenti tali regioni, durante l'esecuzione di questa procedura.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Qui mostriamo un protocollo semplice ed efficace per la generazione di iPSCs umani da 3-4 ml di sangue periferico utilizzando un singolo vettore lentivirale riprogrammazione. La riprogrammazione delle cellule del sangue prontamente disponibili promette di accelerare l'utilizzo della tecnologia iPSC rendendola accessibile ad una comunità di ricerca più ampio.

Generazione di cellule pluripotenti indotte umane staminali da sangue periferico mediante il STEMCCA lentivirale Vector

Un metodo è stato sviluppato per derivare direttamente le cellule staminali neurali umane da cellule progenitrici ematopoietiche arricchite da cellule del sangue periferico.

Induzione diretta di cellule staminali neurali umane da cellule periferiche del sangue emopoietiche progenitrici

Il protocollo qui descritto descrive in dettaglio l'induzione di un programma emogenico nei fibroblasti embrionali di topo attraverso la sovraespressione di un insieme minimo di fattori di trascrizione. Questa tecnologia può essere tradotta nel sistema umano per fornire piattaforme per studi futuri sull'emopoiesi, la malattia ematologica e il trapianto di cellule staminali ematopoietiche.

Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con fattori di trascrizione per indurre un programma Hemogenic

Proponiamo un protocollo per la riprogrammazione delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Placcando le cellule del sangue trasdotte su piastre rivestite di matrice con centrifugazione, le iPSC vengono indotte con successo da cellule galleggianti. Questa tecnica suggerisce un protocollo di riprogrammazione semplice ed efficace per cellule come PBMC e CBMC.

Pluripotenti indotte generazione di cellule staminali da cellule del sangue Utilizzando Sendai Virus e centrifugazione

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la generazione efficiente di iPSC prive di integrazione da cellule del sangue periferico adulto umano. Con l'uso di quattro vettori episomiali basati su oriP/EBNA per esprimere i fattori di riprogrammazione, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 e SOX2, è possibile ottenere migliaia di colonie di iPSC da 1 mL di sangue periferico.

Generazione di integrazione-liberi cellule staminali pluripotenti indotte dalle cellule mononucleari di sangue periferico umano Utilizzando episomiale Vettori

Qui, presentiamo pluripotenti umane protocolli di coltura della cellula formativa (hPSC), utilizzata per differenziare hPSCs in CD34+ progenitori ematopoietici. Questo metodo utilizza la modifica di fase-specifici di Canonica WNT segnalazione per specificare le celle esclusivamente al programma ematopoietica sia definitiva o primitivo.

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

Qui, presentiamo un protocollo per formare con precisione l'endotelio emogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione senza alimentatore e xeno. Questo metodo avrà ampie applicazioni nella modellazione della malattia e nello screening per i composti terapeutici.

Differenziazione dell'endotelio endogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione definita senza alimentatore e Xeno

Questo protocollo dimostra l'induzione di un programma emogenico nei fibroblasti dermici umani mediante l'espressione forzata dei fattori di trascrizione GATA2, GFI1B e FOS per generare cellule staminali e progenitrici ematopoietiche.

Riprogrammazione emogenica dei fibroblasti umani mediante l'espressione forzata dei fattori di trascrizione

Presentato qui è un semplice protocollo per la differenziazione diretta delle cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane in circa 1 settimana.

Differenziazione diretta di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane

Questo protocollo descrive la generazione di vasi sanguigni auto-organizzanti da cellule staminali pluripotenti e pluripotenti indotte umane. Queste reti di vasi sanguigni mostrano una rete endoteliale estesa e connessa circondata da periciti, actina muscolare liscia e una membrana basale continua.

Generazione di organoidi dei vasi sanguigni umani da cellule staminali pluripotenti

Di seguito è descritto un semplice flusso di lavoro per differenziare le cellule endoteliali dalle cellule staminali pluripotenti umane, seguito da un protocollo dettagliato per la loro stimolazione meccanica. Ciò consente lo studio della meccanobiologia dello sviluppo delle cellule endoteliali. Questo approccio è compatibile con i saggi a valle di cellule vive raccolte dal chip di coltura dopo la stimolazione meccanica.

In vitro Modello di vaso umano fetale su chip per studiare la meccanobiologia dello sviluppo

Scopri come indurre endotelio emogenico e cellule ematopoietiche da cellule staminali pluripotenti umane mediante sovraespressione di fattori di trascrizione. Questo metodo consente di studiare la transizione endotelio-ematopoietica in vitro.

Induzione diretta di Hemogenic endotelio e Sangue da sovraespressione di fattori di trascrizione in cellule staminali pluripotenti umane (Video) | JoVE Journal

Induzione diretta di Hemogenic endotelio e Sangue da sovraespressione di fattori di trascrizione in cellule staminali pluripotenti umane

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