Preparazione Facile ed efficiente di Glycopolymers fluorescenti Tri-componenti tramite polimerizzazione RAFT controllata

L'obiettivo generale di questa procedura è la sintesi ben controllata di polimeri lineari statistici fluorescenti utilizzando la frammentazione per addizione reversibile, il trasferimento a catena o la polimerizzazione a zattera. Ciò si ottiene sintetizzando prima il glico monomero due latto-bio etil metanfetamina, o L-A-E-M-A. Il secondo passo consiste nell'utilizzare la polimerizzazione a zattera di L-A-E-M-A-N due amminoetilmetanfitamide, o A EMA e N due idrossietilacrilammide o un GAA per sintetizzare il corrispondente polimero di glico a bassa dispersione.

Successivamente, il glicopolimero viene modificato su una delle sue ammine primarie mediante reazione con carbossi fluoresceina xito estere medio per produrre un polimero di glico fluoresceinato . Il passaggio finale consiste nel legare il polimero di glico nativo della fluoresceina a perle di rosa rivestite di lectina con una nota specificità di legame dei carboidrati. In definitiva, la microscopia fluorescente viene utilizzata per analizzare il legame dei glicopolimeri alle perle di sorso, confermando che il glicopolimero possiede il carboidrato di interesse ed è etichettato con un tag fluorescente.

Il vantaggio della polimerizzazione RAF rispetto ai metodi esistenti che impiegano polimerizzazioni convenzionali di radicali liberi è che il processo di wrath è una tecnica di polimerizzazione di controllo che riduce al minimo il numero di catene derivate dall'iniziatore. Ciò si traduce in polimeri di pesi molecolari predeterminati e rack di polidispersione molto stretti. Le polimerizzazioni possono essere applicate a una miscela definita di monomeri per la preparazione di specifici polimeri di glico fluorescente.

Questi glicopolimeri hanno capacità di legame definite che possono essere verificate mediante l'uso di perle rivestite di lectina. La preparazione efficiente di glicopolimeri fluorescenti dovrebbe rivelarsi di grande valore per la ricerca sulla biologia del glico in futuro. Per iniziare, sciogliere due grammi di acido lattobionico in tre millilitri di metanolo anidro.

Quindi, aggiungi lentamente etanolo assoluto goccia per goccia alla soluzione fino a quando non diventa torbida. Utilizzare un evaporatore rotante per rimuovere tutti i solventi. Ripeti questo processo tre volte per produrre 1,94 grammi di latto, bioo uno, cinque lattone con una resa del 98%.

Aggiungere una soluzione di un grammo di lattobio lattone in tre millilitri di metanolo a una soluzione di A EMA e MEHQ in due millilitri di metanolo. Quindi, aggiungi un millilitro di trietilammina e mescola il composto a temperatura ambiente. Dopo 48 ore, aggiungere 20 millilitri di acqua deionizzata alla miscela e trasferirla in un evaporatore rotante.

Evaporare fino a completa asciugatura. Sciogliere il residuo in 20 millilitri di acqua deionizzata e applicare la soluzione sulla sommità di una colonna a scambio anionico di 10 x 20 millimetri. Posizionare un becher contenente un milligrammo di MEHQ sotto l'uscita ed eluire la colonna nel becher.

Dopo aver aspirato la soluzione in un evaporatore rotante, sciogliere il residuo in 20 millilitri di acqua deionizzata e aggiungere un milligrammo di aliquote di resina a scambio ionico. Fino a quando un test dell'idrante non è negativo, viene eseguito nei test dell'idrante rimuovendo un microlitro della soluzione e applicandolo su una piastra cromatografica a strato sottile. Spruzzare la piastra con una soluzione al 2% di anhy in etanolo e scaldare a 90 gradi Celsius per un minuto su una piastra calda.

Il punto finale è stato raggiunto quando non si forma alcun colore blu. Quindi, filtrare la soluzione attraverso un imbuto di vetro screpolato in una provetta. Congelare la soluzione a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius e poi trasferirla in un liofilizzatore per essere liofilizzata.

Sciogliere il residuo in una quantità minima di metanolo e far precipitare il prodotto aggiungendo meno 20 gradi Celsius e acetone anidro. Raccogliere l'L-A-E-M-A precipitato mediante filtrazione attraverso un imbuto di vetro fritte. Trasferire l'imbuto e precipitare in un essiccato sottovuoto per l'essiccazione prima a 0,5 grammi di circa 150 nanoparticelle di ossido di alluminio mesh in un millilitro di HEAA di grado commerciale in una provetta da due millilitri.

Centrifugare la provetta a 300 volte G per 30 secondi e utilizzare lo strato superiore come HEAA privo di inibitori, sciogliere con cura 32,8 milligrammi di L-A-E-M-A, 1,7 milligrammi di EMA e 27,5 microlitri di HEAA senza inibitori e 0,4 millilitri di acqua deionizzata e trasferire la soluzione in una provetta laterale da un millilitro ben pulita. Quindi, aggiungere 50 microlitri di reagente a zattera e 50 microlitri di reagente iniziatore alla provetta e mescolare picchiettando delicatamente il lato della provetta con la valvola chiusa. Collegare il tubo a una linea del vuoto e congelare il contenuto utilizzando un bagno di etanolo con ghiaccio secco.

Quindi ridurre la pressione del tubo a tendere a 50 millitorr con una pompa e chiudere la valvola. Rimuovere il bagno di ghiaccio secco e lasciare scongelare il contenuto. Ripetere il ciclo di congelamento, aspirazione e scongelamento due volte con maggiore attenzione.

Ispezionare il tubo per assicurarsi che il contenuto sia completamente sciolto e, se necessario, agitare delicatamente. Prima di posizionarlo, rimuovere il tubo chiuso dalla linea del vuoto e inserirlo in un sacchetto di plastica trasparente. Evacuare l'aria dal sacchetto con una pompa a mano in plastica.

Quindi mettere il sacchetto in un bagnomaria coperto a 70 gradi Celsius per 24 ore. Quindi, rimuovere il tubo dalla sacca e trasferirne il contenuto in una sacca per dialisi con un taglio di peso molecolare di 3.500 Dalton. Posizionare la sacca per dialisi in un becher e dializzare con due litri di acqua deionizzata per 24 ore.

Trasferisci il contenuto della sacca per dialisi in una provetta e mettila in congelatore a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Una volta congelato, trasferire in un liofilizzatore e liofilizzare. Per ottenere prima il soffice polimero bianco glico PMA LA EMA, preparare una soluzione di cinque milligrammi di PMA LA EMA in 0,9 millilitri di PBS.

Successivamente, aggiungere lentamente 0,6 milligrammi di carbossi fluoresceina cin, etere medio in 100, microlitri di dimetilformammide alla soluzione rapidamente agitata, il microtubo e la lamina e mescolare lentamente per 16 ore a temperatura ambiente, trasferire la soluzione in una sacca per dialisi con un limite di peso molecolare di 3, 500 Dalton. Mettere la busta in un becher e dializzare con due litri di acqua deionizzata per 16 ore mantenendola al riparo dalla luce. Trasferire il contenuto della sacca per dialisi in una provetta.

Dopo aver congelato la soluzione a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius, liofilizzare. Per ottenere il soffice polimero di glico giallo marcato con fluorescenza P-M-A-L-A-E-M-A, determinare il peso molecolare medio del numero, il peso, il peso molecolare medio e la dispersione dei polimeri di glico con un sistema HPLC. Prima a 1,5 millilitri di PBS a una sospensione di 50 microlitri di perle aro rivestite di lectina di cambusa di Ery Krista in una provetta da centrifuga.

Quindi centrifugare la provetta a 300 volte G per un minuto. Quindi, scartare il surnatante e ripetere il lavaggio altre due volte prima di aggiungere finalmente 0,5 millilitri di PBS. Aggiungere una soluzione di tre microgrammi di fluoresceina marcata PMA LA EMA in sei microlitri di PBS al tubo contenente le perle rivestite di lectina.

Utilizzare la fluoresceina marcata P-M-A-G-A-E-M-A come controllo negativo. Quindi, avvolgere le provette in un foglio e incubarle a temperatura ambiente per un'ora. Centrifugare la provetta per un minuto ed eliminare il surnatante.

Quindi reus, sospendere le perle in 1,5 millilitri di PBS fresco e ripetere il lavaggio tre volte. Infine, sospendere le perle in 0,2 millilitri di PBS Trasferire quattro microlitri delle perle sospese in un pozzetto di un microscopio a immunofluorescenza. Far scorrere e coprire con un disco di vetro.

Immagini del vetrino utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo 10x, filtro FITC e fotocamera. I glicopolimeri sono stati analizzati mediante cromatografia a permeazione di gel. I polimeri sintetizzati senza l'uso di zattere hanno una dispersione molto più elevata rispetto a quelli realizzati con zattera.

Quando viene marcato con fluoresceina, l'aspetto fisico del polimero glico cambia dal bianco a un colore giallo intenso mostrato sotto la luce UV. Una soluzione di polimero non marcato rimane scura mentre il polimero marcato con fluoresceina si illumina Verde brillante che conferma la presenza dell'etichetta Il legame specifico alle perle rivestite di lectina si verifica solo con polimeri che trasportano residui di zucchero pendenti Le perle si illuminano di verde quando legate, mentre rimangono scure quando trattate con polimeri privi di residui di zucchero pendenti. Questa tecnica di polimerizzazione basata su raft consente una grande flessibilità nel tipo di glicopolimeri che possono essere sintetizzati.

La successiva marcatura dei glicopolimeri può essere ottenuta anche con una grande varietà di reagenti fluorescenti, in grado di reagire con mezzi primari in un ambiente acquoso. I ricercatori nel campo della biologia del glico possono utilizzare questa tecnica per ottenere facilmente polimeri di glico altamente versatili e definiti. Questi glicopolimeri possono essere utilizzati come strumenti per esplorare le specificità di legame dei carboidrati, come quelle osservate nel percorso respiratorio dei pazienti con fibrosi cistica o quelle coinvolte in molti tipi di tumori umani.