Preparazione Facile ed efficiente di Glycopolymers fluorescenti Tri-componenti tramite polimerizzazione RAFT controllata

L'obiettivo generale di questa procedura è la sintesi ben controllata di polimeri lineari glicopolimerici statistici fluorescenti mediante polimerizzazione reversibile a trasferimento di catena mediante addizione-fragmentazione, nota come polimerizzazione RAFT. Questo risultato si ottiene innanzitutto sintetizzando il monomero glicomero due lattobio etil metacrilamide, o L-A-E-M-A. Il secondo passaggio consiste nell'utilizzare la polimerizzazione RAFT di L-A-E-M-A-N due amminoetil metacrilamide, o A EMA, e N due idrossietil acrilamide o a GAA per sintetizzare il corrispondente polimero glicopolimerico a bassa dispersità.

Successivamente, il glicopolimero viene modificato su una delle sue ammine primarie mediante reazione con il carbossifluoresceina xito estere medio per produrre un glicopolimero marcatto con fluoresceina. L'ultimo passaggio consiste nel legare il glicopolimero glicopolimero marcato con fluoresceina a microsferette rivestite di lectina con specificità nota per il legame di carboidrati. Infine, si utilizza la microscopia a fluorescenza per analizzare il legame dei glicopolimeri alle microsferette, confermando che il glicopolimero possiede il carboidrato di interesse ed è etichettato con un marcatore fluorescente.

Il vantaggio della polimerizzazione RAF rispetto ai metodi esistenti che impiegano polimerizzazioni radicaliche convenzionali è che il processo wrath è una tecnica di polimerizzazione controllata che minimizza il numero di catene derivate dall'iniziatore. Ciò consente di ottenere polimeri con pesi molecolari predeterminati e un'indice di polidispersione molto stretto. Le polimerizzazioni possono essere applicate a una miscela definita di monomeri per la preparazione di specifici glicopolimeri fluorescenti.

Questi polimeri glicidici possiedono capacità di legame definite, che possono essere verificate mediante l'utilizzo di microsferette rivestite con lectine. La preparazione efficiente di polimeri glicidici fluorescenti si rivelerà di grande valore per la ricerca in glicobiologia in futuro. Per iniziare, sciogliere due grammi di acido lattobionico in tre millilitri di metanolo anidro.

Successivamente, aggiungere lentamente etanolo assoluto goccia a goccia alla soluzione fino a quando non diventa appena torbida. Utilizzare un evaporatore rotante per rimuovere tutti i solventi. Ripetere questo processo tre volte per ottenere 1,94 grammi di lacto bioo one five lactone con una resa del 98%.

Aggiungere una soluzione di un grammo di lacto bio lactone in tre millilitri di metanolo a una soluzione di A EMA e MEHQ in due millilitri di metanolo. Successivamente, aggiungere un millilitro di trietilammina e agitare la miscela a temperatura ambiente. Dopo 48 ore, aggiungere 20 millilitri di acqua deionizzata alla miscela e trasferirla in un evaporatore rotante.

Evaporare fino a completa essiccazione. Sciogliere il residuo in 20 millilitri di acqua deionizzata e applicare la soluzione sulla sommità di una colonna a scambio anionico di 10 per 20 millimetri. Posizionare un becher contenente un milligrammo di MEHQ sotto l'uscita ed eluire la colonna nel becher.

Dopo aver evaporato la soluzione in un evaporatore rotante, sciogliere il residuo in 20 millilitri di acqua deionizzata e aggiungere aliquote di un milligrammo di resina a scambio ionico. Continuare fino a quando il test dell’anidride non risulti negativo, eseguendo i test dell’anidride prelevando un microlitro della soluzione e applicandolo su una piastra per cromatografia su strato sottile. Spruzzare la piastra con una soluzione al 2% di anidride in etanolo e riscaldare a 90 gradi Celsius per un minuto su una piastra riscaldata.

Il punto finale è stato raggiunto quando non si forma alcun colore blu. Successivamente, filtrare la soluzione attraverso un imbuto di vetro fritto in un tubo da saggio. Congelare la soluzione a meno 80 gradi Celsius e poi trasferirla in un liofilizzatore per l'essiccazione sotto vuoto.

Sciogliere il residuo in una quantità minima di metanolo e precipitare il prodotto aggiungendo acetone anidro a meno 20 gradi Celsius. Raccogliere il L-A-E-M-A precipitato per filtrazione attraverso un imbuto di vetro fritto. Trasferire l'imbuto e il precipitato in un essiccatore sotto vuoto per l'essiccazione, aggiungendo prima 0,5 grammi di nanoparticelle di ossido di alluminio di circa 150 mesh a un millilitro di HEAA di grado commerciale in un tubo da saggio da due millilitri.

Centrifugare il tubo a 300 ×g per 30 secondi e utilizzare lo strato superiore come HEAA privo di inibitore. Dissolvere con attenzione 32,8 milligrammi di L-A-E-M-A, 1,7 milligrammi di EMA, 27,5 microlitri di HEAA privo di inibitore e 0,4 millilitri di acqua deionizzata, quindi trasferire la soluzione in un tubo flask da un millilitro ben pulito. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di reagente raft e 50 microlitri di reagente iniziatore al tubo e mescolare dolcemente battendo sul lato del tubo con la valvola chiusa. Collegare il tubo a una linea sotto vuoto e congelare il contenuto utilizzando un bagno di etanolo e ghiaccio secco.

Quindi ridurre la pressione nel tubo fino a raggiungere circa 50 millitorr utilizzando una pompa e chiudere la valvola. Rimuovere il bagno di ghiaccio secco e lasciare scongelare il contenuto. Ripetere con attenzione il ciclo di congelamento, vuoto e scongelamento altre due volte.

Ispezionare il tubo per assicurarsi che il contenuto sia completamente disciolto ed eseguire una leggera vortexazione se necessario. Prima di sigillare, rimuovere il tubo chiuso dalla linea sotto vuoto e collocarlo in un sacchetto di plastica trasparente per vuoto. Aspirare l'aria dal sacchetto utilizzando una pompa manuale in plastica.

Quindi, posizionare il sacchetto in un bagno d'acqua coperto a 70 gradi Celsius per 24 ore. Successivamente, rimuovere il tubo dal sacchetto e trasferirne il contenuto in un sacchetto da dialisi con cutoff di peso molecolare di 3.500 Dalton. Posizionare il sacchetto da dialisi in un becher e dializzare contro due litri di acqua deionizzata per 24 ore.

Trasferire il contenuto del sacchetto da dialisi in una provetta e collocarla in un congelatore a meno 80 gradi Celsius. Una volta congelato, trasferire in un liofilizzatore ed eseguire l'essiccazione sotto vuoto. Per ottenere il polimero glicosidico bianco soffice PMA LA EMA, preparare innanzitutto una soluzione di cinque milligrammi di PMA LA EMA in 0,9 millilitri di PBS.

Successivamente, aggiungere lentamente 0,6 milligrammi di carbossi fluoresceina cin, etere medio in 100 microlitri di dimetilformammide alla soluzione in rapida agitazione, nel microtubo e avvolto nella stagnola, e agitare lentamente per 16 ore a temperatura ambiente. Trasferire la soluzione in un sacchetto da dialisi con cutoff di peso molecolare di 3.500 Dalton. Porre il sacchetto in un becher e dializzare contro due litri di acqua deionizzata per 16 ore, proteggendolo dalla luce. Trasferire il contenuto del sacchetto da dialisi in un provetta.

Dopo aver congelato la soluzione a meno 80 gradi Celsius, effettuare la liofilizzazione. Per ottenere il polimero glicidico P-M-A-L-A-E-M-A etichettato con fluorescenza gialla e soffice, determinare il peso molecolare medio numerico, il peso molecolare medio ponderale e la dispersità dei polimeri glicidici mediante un sistema HPLC. Aggiungere innanzitutto 1,5 millilitri di PBS a una sospensione di 50 microlitri di perle Aro rivestite con lectina di Erythrina cristagalli in un tubo da centrifuga.

Quindi centrifugare il tubo a 300 ×g per un minuto. Successivamente, eliminare il soprannatante e ripetere il lavaggio altre due volte prima di aggiungere finalmente 0,5 millilitri di PBS. Aggiungere al tubo contenente le perle rivestite con lectina una soluzione di tre microgrammi di PMA LA EMA marcata con fluoresceina in sei microlitri di PBS.

Utilizzare P-M-A-G-A-E-M-A marcato con fluoresceina come controllo negativo. Successivamente, avvolgere le provette nella stagnola e incubarle a temperatura ambiente per un'ora. Centrifugare la provetta per un minuto e scartare il soprannatante.

Quindi, riutilizzare, sospendere le perle in 1,5 millilitri di PBS fresco e ripetere il lavaggio per tre volte. Infine, riutilizzare, sospendere le perle in 0,2 millilitri di PBS. Trasferire quattro microlitri delle perle sospese in una pozzetta di un microscopio a immunofluorescenza, posizionare su un vetrino e coprire con un coprioggetto in vetro e registrare.

Immagini del vetrino acquisite con un microscopio a fluorescenza dotato di obiettivo 10x, filtro FITC e fotocamera. I glicopolimeri sono stati analizzati mediante cromatografia a permeazione di gel. I polimeri sintetizzati senza l'uso della tecnica raft presentano una dispersità molto più elevata rispetto a quelli ottenuti utilizzando raft.

Quando marcato con fluoresceina, l'aspetto fisico del glicopolimero cambia da bianco a un colore giallo intenso visibile sotto luce UV. Una soluzione di polimero non marcato rimane scura, mentre il polimero marcato con fluoresceina emette una luce verde brillante, confermando la presenza dell'etichetta. Il legame specifico con le microsfere rivestite di lectina avviene solo con polimeri portatori di residui zuccherini pendenti; le microsfere emettono luce verde quando legate, mentre rimangono scure se trattate con polimeri privi di residui zuccherini pendenti. Questa tecnica di polimerizzazione basata su raft consente una notevole flessibilità nel tipo di glicopolimeri che possono essere sintetizzati.

La successiva marcatura dei glicopolimeri può essere inoltre ottenuta con una vasta gamma di reagenti fluorescenti, in grado di reagire con gruppi primari in un ambiente acquoso. I ricercatori nel campo della glicobiologia possono utilizzare questa tecnica per ottenere in modo semplice glicopolimeri altamente versatili e ben definiti. Questi glicopolimeri possono essere impiegati come strumenti per esplorare le specificità di legame dei carboidrati, come quelle osservate nelle vie respiratorie di pazienti affetti da fibrosi cistica o coinvolte in molti tipi di tumori umani.