Name: Preparazione Facile ed efficiente di Glycopolymers fluorescenti Tri-componenti tramite polimerizzazione RAFT controllata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Scopri la sintesi di glicopolimeri fluorescenti a bassa dispersità tramite polimerizzazione RAFT controllata. Questo metodo consente la preparazione efficiente di polimeri con proprietà fluorescenti per la ricerca in glicobiologia.

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Questo lavoro è stato supportato dai Laboratori Chimici della Stazione Sperimentale dell'Università del Missouri e dall'Associazione per la Fibrosi Cistica del Missouri.

1. Sintesi di 2-Glycomonomer Lactobionamidoethyl metacrilammide <ol><li> Sciogliere 2 g di acido lattobionico in 3,0 ml di metanolo anidro e aggiungere lentamente etanolo assoluto in maniera saggia goccia fino a quando la soluzione diventa torbida solo, quindi rimuovere i solventi via rotoevaporation. </li><li> Sciogliere il residuo, dal punto 1.1, in 3,0 ml di metanolo anidro e, ancora una volta, aggiungere lentamente etanolo assoluto fino a poco nuvoloso, poi evaporare i solventi via rotoevaporation. Ripetere questa operazione per 3 volte per ottenere lactobiono-1,5-lattone (1,94 g, il 98% di resa). Questo prodotto è di purezza sufficiente per essere utilizzato nei seguenti reazioni. </li><li> Aggiungere 1,0 g di lactobionolactone in 3.0 ml di metanolo per N - (2-amminoetil) metacrilammide (Aema, 0,58 g) e idrochinone monometil etere (MEHQ, 1,0 mg), un inibitore di auto-polimerizzazione, in 2,0 ml di metanolo, seguita da 1,0 ml di trietilammina. Mescolare a temperatura ambiente per 48 ore. </li><li> Aggiungere 20 ml di H 2 O deionizzata (DH 2 </sub&gt; O) al pallone di reazione, quindi rimuovere il metanolo e trietilammina gratuito per evaporazione a secchezza via rotoevaporation. </li><li> Per rimuovere qualsiasi lattobionico rimanente, aggiungere 20 ml di dH 2 O, quindi passare la soluzione acquosa attraverso una colonna a scambio anionico (OH - modulo 10 mm x 20 mm) in un bicchiere di ricezione contenente 1,0 mg di MEHQ. </li><li> Rimuovere trietilammina, prodotta nel passo 1.5, per evaporazione a secchezza tramite rotoevaporation. </li><li> Aggiungere 20 ml di dH 2 O e rimuovere reagito Aema aggiungendo lentamente 1 mg aliquote di resina a scambio cationico (forma H +) fino a quando non ninidrina materiali reattivi sono rilevabili. Monitorare la rimozione prendendo 1 microlitri aliquote della soluzione dopo ogni aggiunta resina, applicandola ad una piastra cromatografia su strato sottile, quindi spruzzando la piastra con ninidrina 2% in soluzione di etanolo. Quando nessun colore blu profondo è osservato lo sviluppo quando la piastra viene riscaldata a 90 ° C per 1 min, il punto finale è stato raggiunto. </li><li&gt; Filtrare la soluzione attraverso un imbuto di vetro sinterizzato, trasferire il filtrato in una provetta, congelare il campione a -80 ° C, e quindi liofilizzato. </li><li> Rimuovere MEHQ dal campione sciogliendo il materiale liofilizzato in una quantità minima di metanolo (~ 0,5 ml), quindi aggiungere acetone anidro freddo (-20 ° C, 15 ml) per precipitare il prodotto. Raccogliere il precipitato per filtrazione usando un imbuto di vetro sinterizzato, quindi asciugare il precipitato in un essiccatore sotto vuoto per ottenere 2-lactobionamidoethyl metacrilammide (LAEMA) come polvere bianca (0,94 g, 68% di resa). Questo prodotto è di purezza sufficiente per essere utilizzato nei seguenti reazioni. </li></ol> 2. Sintesi di monomero 2-Gluconamidoethyl metacrilammide Nota: La preparazione di 2-gluconamidoethyl metacrilammide (GAEMA), che non possiede uno zucchero pendente, è stato adattato da un metodo pubblicato 15. <ol><li> Aggiungere 2,0 g di Aema sciolti in 10 ml di metanolo ad una soluzionedi D-gluconolattone (1,6 g) in 30 ml di metanolo e, sotto agitazione, aggiungere lentamente 1,6 ml di trietilammina. </li><li> Mescolare la reazione a temperatura ambiente per 24 ore. </li><li> Filtrare il prodotto precipitato utilizzando un imbuto di vetro sinterizzato e lavare il precipitato tre volte con 10 ml ciascuna di isopropanolo, poi lavare con 10 ml di acetone secca. Essiccare il prodotto precipitato in un essiccatore sotto vuoto. </li></ol> 3. ZATTERA Glycopolymer Sintesi <ol><li> Per rimuovere il MEHQ inibitore presente in N commerciale - (2-idrossietil) acrilammide (HEAA), aggiungere 1 ml di HEAA in una provetta 2 ml microcentrifuga, seguita da aggiunta di 0,5 g di nanoparticelle di ossido di alluminio. Centrifugare la provetta a 300 xg per 30 sec, e utilizzare lo strato HEAA superiore nella seguente reazione. </li><li> Aggiungere con cautela 32,8 mg di LAEMA (70,0 mmol), 1.7 mg di Aema (10,5 mmol) e 27,5 ml di HEAA (270 mmol), tutti sciolti in 0,4 ml di dH 2 O, a un ben pulita tubo 1 ml Schlenk, quindi avendo un Monomer rapporto molare di 20: 3: 77. </li><li> In una reazione parallela, per produrre polimeri di controllo che non possiedono lo zucchero pendente, al posto di usare LAEMA al punto 3.2, sostituire 21,4 mg di GAEMA (70,0 mmol) in reazione. </li><li> Per il rispettivo tubo Schlenk (ad esempio, 3.2 o 3.3), in sequenza aggiungere 50 ml di DMF contenente 0,53 mg di (acido 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate (1.9 mmol, agente ZATTERA), e 50 ml di DMF, contenente 250 mg di 4,4-azobis- (acido 4-cyanovaleric) (0,9 mmol, iniziatore). Mescolare delicatamente con le dita toccando. </li><li> Congelare i contenuti contenuti nel tubo Schlenk impiegano un ghiaccio secco: bagno di etanolo (75 g di ghiaccio secco in 100 ml di etanolo), applicare il vuoto entro 10-50 mTorr, quindi chiudere la valvola Schlenk e permettere la soluzione per scongelare lentamente per RT . Ripetere questo ciclo di gelo-disgelo evacuare-due volte. Assicurarsi che tutti i reagenti si dissolvono dopo l&#39;ultimo disgelo. </li><li> Posizionare il tubo Schlenk in un ba plastica richiudibileg, evacuare l&#39;aria della borsa, e poi sigillarlo. Trasferire il sacchetto contenente il tubo Schlenk ad un bagno di acqua preriscaldata a 70 ° C e incubare per 24 ore. </li><li> Trasferire accuratamente la soluzione nel tubo Schlenk ad un sacchetto di dialisi preparata (MWCO = 3,500), e dializza contro dH 2 O (10 x 2 L) per 24 ore, cambiando il dH 2 O ogni ora per le prime 8 ore. Dopo la dialisi, trasferire il campione dal tubo di dialisi in una provetta, congelare il campione a -80 ° C, e poi liofilizzare esso. </li></ol> Nota: Il risultante statistico poli-metacrilammide / acrilammide (PMA) copolimeri contenenti ciondolo 4- O -β-D-galattopiranosil-D-gluconamide (lactobionamide) (dal punto 3.2) o D-gluconamide (dal punto 3.3), rispettivamente, sono ottenuto. Per comodità di discussione, questi due glycopolymers sono abbreviati come PMA-LAEMA e PMA-GAEMA rispettivamente. 4. Postmodifica di Glycopolymers con Fluorofori </p&gt; <ol><li> Sciogliere 5.0 mg di glycopolymer PMA-LAEMA o PMA-GAEMA contenente ~ 0,9 micromol di gruppi funzionali amminici primari in 0,9 ml di tampone fosfato salino (PBS, 0,1 M fosfato di sodio, 0,15 M di NaCl, pH 7,5), rispettivamente. </li><li> Aggiungere lentamente 0,6 mg di estere carboxyfluorescein succinimidil in 100 ml di DMF alle soluzioni con una rapida agitazione. Mescolare delicatamente le reazioni di 16 ore al buio a temperatura ambiente. </li><li> Mentre riparo dalla luce, caricare il campione in un tubo di dialisi preparata (MWCO = 3.500) e dializza contro dH 2 O (2 L) per 16 ore, cambiando la soluzione di dialisi ogni ora per le prime 8 ore. Dopo la dialisi, trasferire il campione dal tubo di dialisi in una provetta, congelare il campione a -80 ° C, e poi liofilizzare esso. </li></ol> Nota: Dopo la liofilizzazione, glycopolymers fluorescenti PMA-LAEMA-fluoresceina e PMA-GAEMA-fluoresceina, rispettivamente, si ottengono. 5. Caratterizzazione del Glycopolimeri <ol><li> Determinare il peso molecolare medio numerico (M n), il peso molecolare medio ponderale (M w) e dispersità (M w / M n) delle glycopolymers su un sistema di HPLC commerciale dotato di cromatografia a permeazione di gel software (GPC), un GPC colonna adatto per il peso molecolare di interesse, e un rivelatore dell&#39;indice di rifrazione, con 0,1 M Tris / 0,1 M tampone di cloruro di sodio (pH 7) come eluente a una portata di 0,6 ml / min 14. Utilizzare standard di polietilene glicole come standard di peso molecolare (MW: 200-1,200,000 g / mol). </li><li> Quantificare le concentrazioni reali di gruppi funzionali amminici primario all&#39;interno delle glycopolymers 16. Analizzare il contenuto totale di carboidrati dei glycopolymers sintetizzati secondo un metodo pubblicato 17. </li><li> Eseguire prove di composizione strutturale e la purezza del glycomonomers LAEMA, GAEMA e glycopolymers PMA-LAEMA, PMA-GAEMA in D 2 O mediante spettroscopia NMR 14. </li></ol> 6. I test vincolante delle Glycopolymers sintetiche con lectina rivestite agarosio <ol><li> Aggiungere 1,5 ml di PBS per 50 ml di sospensione del crista-galli Erythrina lectina (ECL) agarosio Rivestiti, centrifugare a 300 xg per 1 minuto e rimuovere con attenzione e smaltire il surnatante. Ripetere questa operazione due volte, e poi risospendere le sfere in 0,5 ml di PBS. </li><li> Aggiungere 3 g di PMA-LAEMA-fluoresceina o PMA-GAEMA-fluoresceina (controllo negativo) in 6 ml di PBS alla sospensione perline, e incubare le miscele, al buio, a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare le miscele con 1,5 ml di PBS per tre volte, e perline risospendere in 0,2 ml di PBS. Caricare un aliquota (4 ml) in un pozzo su un vetrino da microscopio immunofluorescenza (rivestiti in teflon), coprire con un vetrino, e osservare al microscopio a fluorescenza utilizzando un filtro FITC (lunghezza d &#39;onda di eccitazione: 467-498 nm, lunghezza d&#39;onda di emissione: 513- 566 nm) e un obiettivo 10X per esaminare il legame di tegli fluorescente glycopolymers con le perline 14. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Un protocollo facile ed efficiente per glycopolymers fluorescenti basati ZATTERA tri-componente, con e senza un carboidrato pendente, e il loro utilizzo in un test-lectina legante, è dimostrato in questa relazione. Il protocollo inizia con la preparazione di glycomonomers LAEMA e GAEMA. Attraverso un one-step ZATTERA controllato copolimerizzazione, glycopolymers con resa riproducibile, prevedibile composizione monomero e basso dispersity, si ottengono. A seguito di post-modifica della glycopolymers con estere carboxyfluorescein succinimidil, il legame del rispettivo glycopolymer fluorescente marcato risulta è facilmente verificabile per la sua specificità-lectina legante. Nelle fasi preparative iniziali delle glycomonomers che devono essere impiegati nelle successive sintesi glycopolymer, prontamente disponibili lattobionico e gluconolattone stati utilizzati. In teoria, tutti i carboidrati di interesse, da monosaccaridi a oligosaccaridi complessi, può essere converted per glycomonomers coniugando zucchero destinazione sul gruppo ossidrilico primario C6 di glucosio. Dopo l&#39;ossidazione del residuo di glucosio riduzione, e la sua successiva disidratazione per un lattone, il prodotto può quindi essere facilmente fatto reagire con l&#39;ammina primaria Aema per formare il corrispondente glycomonomer. Ulteriori esempi di questo percorso può essere visto in un recente rapporto 14. Va notato che, prima di iniziare qualsiasi fase di polimerizzazione, MEHQ, un inibitore di polimerizzazione potenti, deve essere rimosso da tutte le preparazioni monomero e glycomonomer appena prima dell&#39;uso. Questo viene facilmente eseguita utilizzando la minima quantità di metanolo per sciogliere il glycomonomer che possiede MEHQ poi trattare immediatamente con acetone a -20 ° C per precipitare il prodotto senza inibitore in alto rendimento. Indispensabile in ogni schema di polimerizzazione radicale, l&#39;attenzione ai dettagli e monomeri purezze sono enfatizzati. Come è tipico di un sistema di polimerizzazione RAFT, si compone diuna fonte radicali, un reagente RAFT, un monomero e solvente. In questa presentazione visualizzata, un sistema di polimerizzazione RAFT passo singolo è descritto che si concentra sulla produzione di copolimeri statistici generati da una miscela di reazione che possiede tre differenti monomeri in soluzione acquosa. Due reazioni RAFT-mediata separati sono presentati in cui si utilizza un glycomonomer che possiede un pendente, non riducente terminus carboidrati (cioè, β-D-galattosio), e l&#39;altra, in possesso di un poliolo senza residuo carboidrato legato. Comune a entrambe le reazioni RAFT mediata erano monomeri che possiedono un gruppo ossidrile singolare che serve come una molecola distanziale, e un&#39;altra in possesso di una ammina libera per la post-modifica con un fluoroforo ammino-reattiva. Poiché la presenza di ossigeno nella miscela di reazione e l&#39;ambiente è dannoso per polimerizzazione RAFT-mediata, la sua rimozione a livello di tracce viene facilmente realizzata mediante vari freeze-evacicli cuate-disgelo mantenendo il recipiente di reazione tubo Schlenk sotto vuoto spinto. Va notato che il rapporto molare di differenti monomeri nella reazione può essere regolato secondo necessità. Inoltre, variando la quantità di agente RAFT utilizzato, la lunghezza dei polimeri risultanti può essere controllato 18. Tuttavia, il rapporto molare dell&#39;agente RAFT di iniziatore deve sempre essere maggiore di due per assicurare il basso dispersità del prodotto. In queste condizioni, l&#39;evoluzione della copolimerizzazione è costante, e la riproducibilità della reazione è molto elevata. Detto questo, è improbabile che si ottiene una distribuzione del tutto uniforme di tutti monomeri partecipanti entro un copolimero statistico, a causa delle loro diverse velocità di polimerizzazione. Caratterizzare la distribuzione dei diversi monomeri all&#39;interno del polimero è ancora molto impegnativo. Il metodo post-modifica, presentata qui, è al tempo stesso semplice e più amenable l&#39;uso di una più ampia selezione di etichette fluorescenti, rispetto ad altri protocolli applicati a glycopolymers etichetta 2,11. Questi includono molti dei fluorofori ammina reattiva idrosolubili, punti quantici, biotins, e altri. Le specificità di legame dei sintetizzati glycopolymers etichettati sono facilmente verificabili utilizzando lectine con note affinità di legame. PMA-GAEMA possiede senza zucchero ciondolo è un adeguato controllo negativo. Glycopolymers con etichette fluorescenti diversi preparati per questa via sono stati utilizzati con successo in ricerche di lectina-mediata batterica vincolante 14. Come presentato, questa preparazione facile ed efficiente glycopolymers fluorescenti statistici dovrebbe fornire un grande potenziale per una vasta gamma di ricerca glycobiological.

Negli ultimi due decenni, le indagini con glycopolymers sintetici hanno subito uno sviluppo lento ma continuo, dimostrando un notevole potenziale in esame i meccanismi infettivi che comprendono la ricerca che si concentra sul riconoscimento lectina processi 1-3. Poiché glycopolymers sintetici possiedono frazioni di zucchero polivalenti presentano efficacies lectina vincolante molto più elevati, rispetto ai carboidrati monovalenti, sono di grande richiesta nel campo glycobiology 3. Di particolare interesse per la ricerca clinica è l&#39;uso di glycopolymers fluorescenti per caratterizzare il legame con carboidrati disponibili sulla superficie delle cellule respiratorie umane e glicoproteina mucose batterica lectina-mediata. All&#39;inizio studi in vitro impiegato in commercio glycopolymers basato poliacrilammide-in batteriche prove vincolanti. Molte di queste sonde hanno mostrato risultati promettenti, ma ha sollevato preoccupazioni per quanto riguarda, obtainability, e da lotto a lotto variazioni sia in polpeso molecolare Ymer e contenuti glycoepitope. Un protocollo economico in laboratorio è stato sviluppato che fornirebbe un controllo soddisfacente di contenuti la struttura, le dimensioni, e la purezza di glycopolymers sintetiche destinate lectine batteriche. Alla ricerca di un approccio sintetico atto a glycopolymers, una tecnica relativamente nuova di polimerizzazione è stata testata utilizzando un tipo di polimerizzazione radicale controllato che ha impiegato oltre reversibile-frammentazione catena di trasferimento (RAFT) agenti 4. Tali reagenti RAFT sono state recentemente utilizzate in alcune preparazioni glycopolymer 5-7. Rispetto ad altri protocolli di preparazione glycopolymer, polimerizzazioni RAFT-mediata dimostrano diversi vantaggi, tra cui la tolleranza ad una varietà di strutture monomeriche e condizioni di reazione, potenzialità compatibilità con le soluzioni acquose, e basso dispersity dimensioni dei prodotti polimerici desiderati 8,9. Di notevole interesse sono i protocolli per la preparazione di RAFT-baglycopolymers tri-componente sed che consente il controllo di composizioni di monomeri diversi, ciascuno dei quali può avere funzioni distinte 10-13. Tuttavia, la maggior parte dei precedenti sforzi di ricerca sia mancavano anomerico carboidrati pendente 10, o impiegati intensificati polimerizzazioni conseguente copolimeri tri-blocco, che consistono di omopolimeri covalentemente legate, che spesso servono scopi diversi polimeri che sono copolimeri statistici in cui la sequenza di monomero residui seguono una regola statistica 9-13. Recentemente, impiegando il composto RAFT thiocarbonylthio (acido 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate in ambiente acquoso, la preparazione di un gruppo di RAFT-basato glycopolymers statistici tri-componente lineari contenenti specifici zuccheri sospensione e loro applicazione in lectina-mediata batterica vincolante test è stato segnalato 14. L&#39;obiettivo generale di questo metodo, presentato in modo visivo, è quello di preparare tri-componenteglycopolymers fluorescenti statistici tramite copolimerizzazione ZATTERA controllata. A causa della facilità del protocollo polimerizzazione di uno stadio, il controllo fine della lunghezza polimero e composizioni, e l&#39;elevata riproducibilità della reazione, questo protocollo può essere facilmente applicato ad altre sintesi basata RAFT-di glycopolymers con strutture desiderati.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>Acido lattobionico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>D-Gluconolattone&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2164</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-idrossietil) acrilammide (HEAA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>697931</td><td></td></tr><tr><td>Orange II sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O8126</td><td></td></tr><tr><td>Idrochinone monometil etere (MEHQ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54050</td><td>Inibitore della polimerizzazione</td></tr><tr><td>N-(2-amminoetil) metacrilammide cloridrato (AEMA)</td><td>Polysciences, Inc</td><td>24833-5</td><td></td></tr><tr><td>Trietilammina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-616</td><td></td></tr><tr><td>Resina a scambio anionico IRN-78 forma di idrossido, 80 mesh</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10343-U</td><td></td></tr><tr><td>Resina a scambio cationico 50Wx8, 200 mesh</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>217514</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di alluminio, ~150 mesh&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1522</td><td>Tipo WN-6, neutro, grado di attività Super I</td></tr><tr><td>ninidrina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4876</td><td>Nel test è stata utilizzata una soluzione di etanolo allo 0,2% di ninidrina nel test</td></tr><tr><td>acido 4-ciano-4-(fenilcarbonotiotioiltio)pentanoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>722995</td><td>agente RAFT</td></tr><tr><td>4,4&prime;-Azobis(acido 4-cianovalerico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11588</td><td>Iniziatore di polimerizzazione</td></tr><tr><td>Carbossifluoresceina succinimidil estere&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Erythrina Cristagalli perlina di agarosio rivestita di lectina</td><td>Vector Laboratories</td><td>AL-1143</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Solvent</td></tr><tr><td>dH2O</td><td></td><td></td><td>Prodotto dal sistema di purificazione dell'acqua Barnstead, 18 megaOhm-cm</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A461-4</td><td>grado ACS o superiore</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>grado ACS o superiore</td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td>ACS grado o superiore</td></tr><tr><td>Dimetilformammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22705</td><td>Grado ACS o superiore</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td>Grado ACS o superiore</td></tr><tr><td colspan="4">EquipmentDialysis</td></tr> <tr><td>membrane (MWCO: 3,500)</td><td>Spectrum Labs</td><td>132720</td><td></td></tr><tr><td>Standard analitico di polietilenglicole</td><td>Standard Sigma-Aldrich</td><td>O2393</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Schlenk, 1 ml</td><td>Vetro</td><td></td> Quark <td>Personalizzato</td></tr><tr><td>TSK-GEL G4000 PWxl&nbsp;</td><td>Tosoh Bioscience&nbsp;</td><td>8022</td><td>Utilizzato per l'analisi GPC dei glicopolimeri</td></tr><tr><td>Empower 3 con pacchetto GPC/SEC</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters Alliance HPLC system&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td>Dotato di rivelatore di indice di rifrazione (Waters 2414) e rivelatore di fluorescenza (Waters 2475)</td></tr><tr><td>Spettrometro NMR Avance III 800 MHz</td><td>Microscopio</td> a fluorescenza BX43 di Bruker Corporation <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Utilizzato con filtro FITC nel test di legame del glicopolimero</td></tr><tr><td>Rotavap / Rotoevaporatore</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fritted imbuto a disco</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-310-109</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio in immunofluorescenza</td><td>Polysciences</td><td>18357-1</td><td></td></tr><tr><td>Revco Ultima Plus -80&nbsp; &#176; C Congelatore</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacchetto a vuoto in plastica e pompa a mano</td> Pompa a vuoto <td>Ziploc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, azionamento diretto, Maxima C Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuometro</td><td>Sargent-Welch</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione facile ed efficiente di glycopolymers fluorescenti tri-componenti tramite polimerizzazione raft controllata

Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization

Glycopolymers sintetici sono strumenti strumentali e versatili utilizzati in vari campi di ricerca biochimici e biomedici. Un esempio di una sintesi facile ed efficiente glycopolymers statistici fluorescenti ben controllati utilizzando reversibile addizione frammentazione chain-trasferimento (RAFT) polimerizzazione sede è dimostrata. La sintesi inizia con la preparazione di β-galattosio contenenti glycomonomer 2-lactobionamidoethyl metacrilammide ottenuto per reazione del lactobionolactone e N - (2-amminoetil) metacrilammide (Aema). 2-Gluconamidoethyl metacrilammide (GAEMA) è usato come un analogo strutturale manca un terminale β-galactoside. Il seguente reazione di copolimerizzazione RAFT-mediata coinvolge tre differenti monomeri: N - (2-idrossietil) acrilammide come distanziale, Aema come obiettivo per ulteriore etichettatura fluorescenza, e le glycomonomers. Tollerante di sistemi acquosi, l&#39;agente RAFT utilizzato nella reazione è (acido 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate.Bassa dispersities (≤1.32), composizioni copolimero prevedibili, e l&#39;alta riproducibilità delle polimerizzazioni sono state osservate tra i prodotti. Polimeri fluorescenti sono ottenuti modificando i glycopolymers con estere carboxyfluorescein succinimidil mira i gruppi funzionali amminici primari sulla Aema. Specificità lectina legante dei glycopolymers risultanti sono verificati da test con corrispondenti agarosio rivestite con specifici lectine glycoepitope riconoscimento. Grazie alla facilità di sintesi, il controllo stretto delle composizioni di prodotto e la buona riproducibilità della reazione, questo protocollo possono essere tradotti verso preparazione di altri glycopolymers basato RAFT-con strutture e composizioni specifiche, come desiderato.

Sintesi di glycomonomer Lattobionico è stato utilizzato qui come esempio per la preparazione di glycomonomers. Utilizzando metodi nel rapporto iniziale sulla sintesi di LAEMA 11, sono stati osservati i rendimenti varie in preparazione con la purezza insoddisfacente. Il metodo di purificazione modificata con resine cationiche e scambio anionico per rimuovere il materiale di partenza non reagito offerto resa del prodotto stabile e elevata purezza, che è confermato da 1 H e 13 C spettroscopia NMR (figura 1). ZATTERA sintesi glycopolymer e post-modifica di glycopolymers con fluorofori In contrasto con i blocchi-glycopolymers preparati tramite polimerizzazione RAFT gradini, questo protocollo copolimerizzazione one-step fornisce una distribuzione uniforme glycomonomer catena polimerica. I glycopolymers indicati qui contengono il 20% in moli di glycomonomer, 77% in moli di HEAA come distanziatore, e 3% in moli di Aema come bersaglio per la post-modifiche (vedere Figura 2). 1 H- 13 e spettroscopia C-NMR confermano le strutture di PMA-LAEMA e PMA-GAEMA (figure 3 e 4). Come mostrato in figura 5, quando tracciata contro i profili di eluizione GPC del glycopolymer sintetizzato senza RAFT, sia PMA-LAEMA e PMA-GAEMA hanno bassi dispersities, dimostrando l&#39;efficacia dell&#39;approccio RAFT. Come previsto, PMA-GAEMA ha una M n inferiore a quella di PMA-LAEMA causa della mancanza di uno zucchero pendente del PMA-GAEMA. Analisi dei carboidrati e amminici primari gruppi funzionali contenuto delle glycopolymers RAFT rivelato che il rapporto di monomeri nelle glycopolymers prodotto è coerente con il rapporto stechiometrico di monomeri impiegati nella reazione di polimerizzazione RAFT-mediata (Tabella 1) a partire. Questo significa uno stretto controllo del compositio monomerons nelle glycopolymers sintetizzati, come progettato. Reazione di gruppi funzionali amminici primari con fluorofori attivate è una tecnica largamente usata in etichettatura proteine. Questa tecnica è stata impiegata qui per etichettare glycopolymers purificati con carbossifluoresceina. Dopo postmodifica, polimeri fluorescenti sono stati ottenuti (Figura 6). Nessuna degradazione dei polimeri fluoresceina nella reazione è stata rilevata mediante analisi GPC (dati non mostrati). Binding prove dei glycopolymers sintetici con agarosio perline lectina rivestite Per valutare la specificità-lectina legante dei glycopolymers sintetizzati, è stato utilizzato lectina rivestito agarosio con carboidrati nota specificità di legame. Crista-galli lectina Erythrina (ECL), impiegati negli esperimenti, ha una specificità di legame verso β-D-galactoside. Figura 7A dimostra chiaramente che PMA-LAEMA-Flfluoresceina, che contiene β-D-galattoside come carboidrato pendente, espone forte legame con la lectina ECL. Al contrario, il legame al ECL della glycopolymer PMA-GAEMA-fluoresceina, che non possiede uno zucchero pendente negativo, è mostrato in Figura 7B. Questo risultato esemplifica l&#39;efficacia di legame e l&#39;affinità del glycopolymer fluorescenti sintetizzato. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig1.jpg" /> Figura 1. assegnato 1 H (a), e 13 C-NMR (b) gli spettri (D 2 O) per LAEMA. (Questo dato è stato modificato da Wang et al. 14) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questo figura.</a> &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig2.jpg" /> Figura 2. Rappresentazione schematica della sintesi di glycopolymer fluorescente PMA-LAEMA contenenti β-galattoside come lo zucchero ciondolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig3.jpg" /> Figura 3. assegnato 1 H (A) e 13 C-NMR (B) spettri (D 2 O) per PMA-LAEMA glycopolymer. (Questo dato è stato modificato da Wang et al. 14) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig3large.jpg" target="_blank">Plea</a>SE Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig4.jpg" /> Figura 4. assegnato 1 H (A) e 13 C-NMR (B) spettri (D 2 O) per PMA-GAEMA. (Questo dato è stato modificato da Wang et al. 14) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig5.jpg" /> Figura 5. gel cromatografia a permeazione di tracce di base-ZATTERA PMA-GAEMA e PMA-LAEMA preparati con e senza l&#39;utilizzo di agenti ZATTERA. In contrasto con il PMA-LAEMA preparato senza RAFT agente (blu), il rafting<html> basata PMA-LAEMA (verde) ha un dispersity molto inferiore (M w / M n). A base di ZATTERA PMA-GAEMA (rosso) e PMA-LAEMA hanno profili simili GPC, ma il primo ha una più piccola M n causa della mancanza di zuccheri pendenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig6.jpg" /> Figura 6. PMA-LAEMA prima e dopo la post-modifica con fluoroforo. (A) Rispetto bianco-etichettato glycopolymer (tubo a sinistra), marcato con fluoresceina PMA-LAEMA presenta con un colore giallo forte (tubo a destra). (B) Sotto UV, non marcato PMA-LAEMA (tubo sinistro, 1 mg / ml in PBS) è scuro e presenta alcuna fluorescenza, mentre fluoresceina PMA-LAEMA (tubo a destra, 1 mg / ml in PBS) spettacoli forte fluorescenza verde.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig7.jpg" /> Figura 7. Erythrina crista-galli lectina (ECL) agarosio Rivestiti legano β-D-galattoside contenenti glycopolymers, e non quelli che non possiedono uno zucchero ciondolo. (A) PMA-LAEMA-fluoresceina (3 mg) ha dimostrato forte legame con ECL , mentre in (B) PMA-GAEMA-fluoresceina, che possiede nessun residuo ciondolo β-D-galattoside, non hanno mostrato associazione con le perline lectina rivestite. Barra di scala = 100 micron. Tabella 1. Valori rivolge ad un dei parametri sintetici e composizioni reali delle glycopolymers. A) Targeting valori, valori chesono desiderata dei prodotti; b) DP, grado di polimerizzazione; c) NA, non disponibile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody style="vertical-align:middle;text-align:center"><tr><td style="width:120px"></td><td style="width:40px"> DP b </td><td style="width:70px"> Dispersità </td><td style="width:120px"> Il contenuto effettivo di glycomonomers mol% </td><td> Il contenuto effettivo di ammina primaria mol% </td></tr><tr><td> Targeting valori </td><td> 100 </td><td> &lt;1.3 </td><td> 20 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> PMA-LAEMA </td><td> 99 </td><td> 1.26 </td><td> 19 </td><td> 3.2 </td></tr><tr><td> PMA-GAEMA </td><td> 89 </td><td> 1.32 </td><td> NA c </td><td> 2.7 </td></tr></tbody></table>

Viene dimostrata un'efficiente sintesi in tre fasi di glicopolimeri fluorescenti basati su RAFT, consistente nella preparazione di glicomonomeri, copolimerizzazione e post-modifica. Questo protocollo può essere utilizzato per preparare glicopolimeri statistici basati su RAFT con le strutture desiderate.

Preparazione Facile ed efficiente di Glycopolymers fluorescenti Tri-componenti tramite polimerizzazione RAFT controllata

Synthetic glycopolymers are instrumental and versatile tools used in various biochemical and biomedical research fields. An example of a facile and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è la sintesi ben controllata di polimeri lineari glicopolimerici statistici fluorescenti mediante polimerizzazione reversibile a trasferimento di catena mediante addizione-fragmentazione, nota come polimerizzazione RAFT. Questo risultato si ottiene innanzitutto sintetizzando il monomero glicomero due lattobio etil metacrilamide, o L-A-E-M-A. Il secondo passaggio consiste nell'utilizzare la polimerizzazione RAFT di L-A-E-M-A-N due amminoetil metacrilamide, o A EMA, e N due idrossietil acrilamide o a GAA per sintetizzare il corrispondente polimero glicopolimerico a bassa dispersità.Successivamente, il glicopolimero viene modificato su una delle sue ammine primarie mediante reazione con il carbossifluoresceina xito estere medio per produrre un glicopolimero marcatto con fluoresceina. L'ultimo passaggio consiste nel legare il glicopolimero glicopolimero marcato con fluoresceina a microsferette rivestite di lectina con specificità nota per il legame di carboidrati. Infine, si utilizza la microscopia a fluorescenza per analizzare il legame dei glicopolimeri alle microsferette, confermando che il glicopolimero possiede il carboidrato di interesse ed è etichettato con un marcatore fluorescente.Il vantaggio della polimerizzazione RAF rispetto ai metodi esistenti che impiegano polimerizzazioni radicaliche convenzionali è che il processo wrath è una tecnica di polimerizzazione controllata che minimizza il numero di catene derivate dall'iniziatore. Ciò consente di ottenere polimeri con pesi molecolari predeterminati e un'indice di polidispersione molto stretto. Le polimerizzazioni possono essere applicate a una miscela definita di monomeri per la preparazione di specifici glicopolimeri fluorescenti.Questi polimeri glicidici possiedono capacità di legame definite, che possono essere verificate mediante l'utilizzo di microsferette rivestite con lectine. La preparazione efficiente di polimeri glicidici fluorescenti si rivelerà di grande valore per la ricerca in glicobiologia in futuro. Per iniziare, sciogliere due grammi di acido lattobionico in tre millilitri di metanolo anidro.Successivamente, aggiungere lentamente etanolo assoluto goccia a goccia alla soluzione fino a quando non diventa appena torbida. Utilizzare un evaporatore rotante per rimuovere tutti i solventi. Ripetere questo processo tre volte per ottenere 1,94 grammi di lacto bioo one five lactone con una resa del 98%.Aggiungere una soluzione di un grammo di lacto bio lactone in tre millilitri di metanolo a una soluzione di A EMA e MEHQ in due millilitri di metanolo. Successivamente, aggiungere un millilitro di trietilammina e agitare la miscela a temperatura ambiente. Dopo 48 ore, aggiungere 20 millilitri di acqua deionizzata alla miscela e trasferirla in un evaporatore rotante.Evaporare fino a completa essiccazione. Sciogliere il residuo in 20 millilitri di acqua deionizzata e applicare la soluzione sulla sommità di una colonna a scambio anionico di 10 per 20 millimetri. Posizionare un becher contenente un milligrammo di MEHQ sotto l'uscita ed eluire la colonna nel becher.Dopo aver evaporato la soluzione in un evaporatore rotante, sciogliere il residuo in 20 millilitri di acqua deionizzata e aggiungere aliquote di un milligrammo di resina a scambio ionico. Continuare fino a quando il test dell’anidride non risulti negativo, eseguendo i test dell’anidride prelevando un microlitro della soluzione e applicandolo su una piastra per cromatografia su strato sottile. Spruzzare la piastra con una soluzione al 2% di anidride in etanolo e riscaldare a 90 gradi Celsius per un minuto su una piastra riscaldata.Il punto finale è stato raggiunto quando non si forma alcun colore blu. Successivamente, filtrare la soluzione attraverso un imbuto di vetro fritto in un tubo da saggio. Congelare la soluzione a meno 80 gradi Celsius e poi trasferirla in un liofilizzatore per l'essiccazione sotto vuoto.Sciogliere il residuo in una quantità minima di metanolo e precipitare il prodotto aggiungendo acetone anidro a meno 20 gradi Celsius. Raccogliere il L-A-E-M-A precipitato per filtrazione attraverso un imbuto di vetro fritto. Trasferire l'imbuto e il precipitato in un essiccatore sotto vuoto per l'essiccazione, aggiungendo prima 0,5 grammi di nanoparticelle di ossido di alluminio di circa 150 mesh a un millilitro di HEAA di grado commerciale in un tubo da saggio da due millilitri.Centrifugare il tubo a 300 ×g per 30 secondi e utilizzare lo strato superiore come HEAA privo di inibitore. Dissolvere con attenzione 32,8 milligrammi di L-A-E-M-A, 1,7 milligrammi di EMA, 27,5 microlitri di HEAA privo di inibitore e 0,4 millilitri di acqua deionizzata, quindi trasferire la soluzione in un tubo flask da un millilitro ben pulito. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di reagente raft e 50 microlitri di reagente iniziatore al tubo e mescolare dolcemente battendo sul lato del tubo con la valvola chiusa. Collegare il tubo a una linea sotto vuoto e congelare il contenuto utilizzando un bagno di etanolo e ghiaccio secco.Quindi ridurre la pressione nel tubo fino a raggiungere circa 50 millitorr utilizzando una pompa e chiudere la valvola. Rimuovere il bagno di ghiaccio secco e lasciare scongelare il contenuto. Ripetere con attenzione il ciclo di congelamento, vuoto e scongelamento altre due volte.Ispezionare il tubo per assicurarsi che il contenuto sia completamente disciolto ed eseguire una leggera vortexazione se necessario. Prima di sigillare, rimuovere il tubo chiuso dalla linea sotto vuoto e collocarlo in un sacchetto di plastica trasparente per vuoto. Aspirare l'aria dal sacchetto utilizzando una pompa manuale in plastica.Quindi, posizionare il sacchetto in un bagno d'acqua coperto a 70 gradi Celsius per 24 ore. Successivamente, rimuovere il tubo dal sacchetto e trasferirne il contenuto in un sacchetto da dialisi con cutoff di peso molecolare di 3.500 Dalton. Posizionare il sacchetto da dialisi in un becher e dializzare contro due litri di acqua deionizzata per 24 ore.Trasferire il contenuto del sacchetto da dialisi in una provetta e collocarla in un congelatore a meno 80 gradi Celsius. Una volta congelato, trasferire in un liofilizzatore ed eseguire l'essiccazione sotto vuoto. Per ottenere il polimero glicosidico bianco soffice PMA LA EMA, preparare innanzitutto una soluzione di cinque milligrammi di PMA LA EMA in 0,9 millilitri di PBS.Successivamente, aggiungere lentamente 0,6 milligrammi di carbossi fluoresceina cin, etere medio in 100 microlitri di dimetilformammide alla soluzione in rapida agitazione, nel microtubo e avvolto nella stagnola, e agitare lentamente per 16 ore a temperatura ambiente. Trasferire la soluzione in un sacchetto da dialisi con cutoff di peso molecolare di 3.500 Dalton. Porre il sacchetto in un becher e dializzare contro due litri di acqua deionizzata per 16 ore, proteggendolo dalla luce. Trasferire il contenuto del sacchetto da dialisi in un provetta.Dopo aver congelato la soluzione a meno 80 gradi Celsius, effettuare la liofilizzazione. Per ottenere il polimero glicidico P-M-A-L-A-E-M-A etichettato con fluorescenza gialla e soffice, determinare il peso molecolare medio numerico, il peso molecolare medio ponderale e la dispersità dei polimeri glicidici mediante un sistema HPLC. Aggiungere innanzitutto 1,5 millilitri di PBS a una sospensione di 50 microlitri di perle Aro rivestite con lectina di Erythrina cristagalli in un tubo da centrifuga.Quindi centrifugare il tubo a 300 ×g per un minuto. Successivamente, eliminare il soprannatante e ripetere il lavaggio altre due volte prima di aggiungere finalmente 0,5 millilitri di PBS. Aggiungere al tubo contenente le perle rivestite con lectina una soluzione di tre microgrammi di PMA LA EMA marcata con fluoresceina in sei microlitri di PBS.Utilizzare P-M-A-G-A-E-M-A marcato con fluoresceina come controllo negativo. Successivamente, avvolgere le provette nella stagnola e incubarle a temperatura ambiente per un'ora. Centrifugare la provetta per un minuto e scartare il soprannatante.Quindi, riutilizzare, sospendere le perle in 1,5 millilitri di PBS fresco e ripetere il lavaggio per tre volte. Infine, riutilizzare, sospendere le perle in 0,2 millilitri di PBS. Trasferire quattro microlitri delle perle sospese in una pozzetta di un microscopio a immunofluorescenza, posizionare su un vetrino e coprire con un coprioggetto in vetro e registrare.Immagini del vetrino acquisite con un microscopio a fluorescenza dotato di obiettivo 10x, filtro FITC e fotocamera. I glicopolimeri sono stati analizzati mediante cromatografia a permeazione di gel. I polimeri sintetizzati senza l'uso della tecnica raft presentano una dispersità molto più elevata rispetto a quelli ottenuti utilizzando raft.Quando marcato con fluoresceina, l'aspetto fisico del glicopolimero cambia da bianco a un colore giallo intenso visibile sotto luce UV. Una soluzione di polimero non marcato rimane scura, mentre il polimero marcato con fluoresceina emette una luce verde brillante, confermando la presenza dell'etichetta. Il legame specifico con le microsfere rivestite di lectina avviene solo con polimeri portatori di residui zuccherini pendenti; le microsfere emettono luce verde quando legate, mentre rimangono scure se trattate con polimeri privi di residui zuccherini pendenti. Questa tecnica di polimerizzazione basata su raft consente una notevole flessibilità nel tipo di glicopolimeri che possono essere sintetizzati.La successiva marcatura dei glicopolimeri può essere inoltre ottenuta con una vasta gamma di reagenti fluorescenti, in grado di reagire con gruppi primari in un ambiente acquoso. I ricercatori nel campo della glicobiologia possono utilizzare questa tecnica per ottenere in modo semplice glicopolimeri altamente versatili e ben definiti. Questi glicopolimeri possono essere impiegati come strumenti per esplorare le specificità di legame dei carboidrati, come quelle osservate nelle vie respiratorie di pazienti affetti da fibrosi cistica o coinvolte in molti tipi di tumori umani.

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