Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays

L'obiettivo generale di questa procedura è semplificare la lettura dei saggi digitali delle goccioline utilizzando uno strumento PCR convenzionale in tempo reale per misurare la fluorescenza di massa del saggio. Ciò si ottiene preparando prima le reazioni di amplificazione dei campioni di interesse, due standard e formando goccioline per partizionare ciascuno in reattori di migliaia di nanolitri. Il secondo passo consiste nell'incubare le goccioline per amplificare gli acidi nucleici all'interno di ciascuna gocciolina.

Successivamente, la fluorescenza di massa di ciascun campione o standard viene misurata con un QPC standard o un termociclatore. Il passaggio finale consiste nel prevedere la frazione di goccioline fluorescenti nei campioni di interesse utilizzando una curva standard generata dai campioni standard. Per verificare le prestazioni di questo metodo, la microscopia a fluorescenza può essere utilizzata per valutare in modo indipendente le prestazioni di quantificazione del saggio di fluorescenza di massa.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il conteggio delle gocce, è che non richiede strumentazione specializzata Prima di iniziare questa riparazione del saggio. Sono necessari tutti i reagenti necessari, come descritto nel testo del protocollo, due standard. Uno, nessun controllo del modello, come l'acqua priva di nucleasi e un'alta concentrazione del modello come lambda, DNA, denaturare 3,3 microlitri di ogni standard con 3,3 microlitri di tampone di denaturazione in provetta A-Q-P-C-R.

Incubarlo a temperatura ambiente per tre minuti. Temprare ciascuno con 3,3 microlitri di tampone di neutralizzazione. Allo stesso modo, denaturare 3,3 microlitri del modello di interesse con 3,3 microlitri di tampone di denaturazione incubati a temperatura ambiente per tre minuti.

Temprare con 3,3 microlitri di tampone di neutralizzazione. Preparare 11 microlitri di miscela master per campione per ottenere un numero inferiore di falsi positivi. Esporre la miscela master alla luce UV prima di formare goccioline.

Per prima cosa, preparare 10 microlitri di miscela premiscelata per campione in una provetta trasparente da 0,5 millilitri o 1,5 millilitri su ghiaccio. La miscela premiscelata è costituita da oligo randomizzato, tampone di reazione della polimerasi B-S-A-D-N-A, DN, NTP e acqua priva di nucleasi. Immergere il tubo in acqua su ghiaccio ed esporlo alla luce UV dopo l'esposizione ai raggi UV.

Colorante legante A-D-S-D-N-A e dieta di riferimento alla miscela premiscelata. Aggiungere la DNA polimerasi PHI 29 per ultima per garantire che la polimerasi non incontri livelli di pH molto più alti o più bassi di 7,5. Mescolare bene, unire 10 microlitri di dima denaturata o standard e 10 microlitri della miscela master, mescolare bene.

Poiché le goccioline possono essere molto sensibili all'elettricità statica e allo stress puro, lo sperimentatore dovrebbe rimuovere i vestiti che possono causare elettricità statica e radicarsi in posizione prima di formare goccioline. Il dispositivo microfluidico utilizzato per questa dimostrazione è stato prodotto internamente e dispone di un ingresso dell'olio e due ingressi acquosi con una giunzione di focalizzazione del flusso per la generazione di goccioline. Utilizzare due pompe a siringa per controllare le portate di 55 microlitri di olio con tensioattivo e 20 microlitri di miscela di reazione attraverso il chip microfluidico.

Per generare 20.001 goccioline di nanolitri, uno dei passaggi più difficili è raccogliere le goccioline senza disturbare l'emulsione. È importante pipettare lentamente e preferibilmente. Usa una punta larga.

Raccogliere tutte le goccioline in provette PCR per ogni campione. Aliquotare 30 microlitri di olio in provette PCR fresche con tappi ottici utilizzando una punta a foro largo e pipettando molto lentamente. Trasferire 20 microlitri di goccioline sopra l'olio.

I volumi costanti garantiscono che il test sia il più accurato possibile. Chiudere bene i tappi delle provette, poiché i tappi allentati consentiranno all'olio di evaporare, maneggiare le provette di emulsione dalla parte superiore della provetta il più lontano possibile dall'emulsione. Per l'amplificazione isotermica è possibile utilizzare un termociclatore per PCR, un termociclatore A-Q-P-C-R o una piastra riscaldante.

In questa dimostrazione viene utilizzato il termociclatore A-Q-P-C-R. Incubare i campioni per sette ore a 30 gradi Celsius e inattivarli per un minuto a 75 gradi Celsius. Immediatamente dopo la reazione e l'attivazione.

Misurare i livelli di fluorescenza per tutti i campioni utilizzando il termociclatore QPCR. Per ogni campione. Dividere l'intensità di fluorescenza del colorante legante il DNA DS DS per l'intensità di fluorescenza del colorante di riferimento.

Sottrarre la fluorescenza di fondo o la fluorescenza normalizzata del controllo senza modello da tutti i campioni. Crea una curva standard lineare utilizzando le misure correttive di fluorescenza degli standard. Lo standard di controllo senza stampo rappresenta la fluorescenza per un campione con goccioline fluorescenti allo 0% e l'alta concentrazione di modello.

La misurazione della fluorescenza è la fluorescenza prevista per un campione con goccioline fluorescenti al 100% utilizzando la curva standard corrispondente. Prevedi i rapporti intermedi delle goccioline positive e negative in base alla loro fluorescenza di massa. Questo metodo utilizza uno strumento PCR convenzionale in tempo reale per misurare la fluorescenza di massa di saggi digitali basati su goccioline.

Le goccioline fluorescenti e non fluorescenti sono state premiscelate in diversi rapporti e sono state effettuate un confronto tra la fluorescenza di massa e la frazione di goccioline positive. Come previsto, la fluorescenza di massa e il conteggio delle goccioline positive scalano linearmente con la frazione di input delle goccioline fluorescenti. I rapporti previsti basati sugli standard sono stati confrontati con le frazioni di input fluorescenti previste.

La linea indica il valore atteso data una relazione lineare. I risultati mostrano buone prestazioni nella quantificazione del rapporto di goccioline su due log di gamma dinamica. Per testare questo metodo in un vero e proprio saggio quantitativo di amplificazione dell'intero genoma, livelli di fluorescenza e frazioni di goccioline positive di una gocciolina digitale.

Sono stati misurati il test MDA con concentrazioni crescenti di DNA Lambda stampo. La linea indica la frazione fluorescente prevista utilizzando la distribuzione del poissant per modellare i dati dell'esperimento. Le immagini fluorescenti rappresentative delle goccioline vengono mostrate sia la frazione fluorescente di massa che quella positiva della scala dei campioni MDA digitali come previsto con il modello medio per gocciolina, indicando che la lettura di massa può catturare fedelmente il risultato di un saggio digitale.

Questo metodo può avvantaggiare altri saggi digitali come la PCR digitale, accelerando la parallelizzazione e semplificando la lettura dei saggi.