Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays

L'obiettivo generale di questa procedura è semplificare la lettura dei saggi con goccioline digitali utilizzando uno strumento PCR in tempo reale convenzionale per misurare la fluorescenza complessiva del saggio. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando reazioni di amplificazione dei campioni di interesse, due standard e formando goccioline per suddividere ciascuno in migliaia di reattori di dimensioni nanolitriche. Il secondo passaggio consiste nell'incubare le goccioline per amplificare gli acidi nucleici all'interno di ciascuna gocciolina.

Successivamente, la fluorescenza totale di ogni campione o standard viene misurata mediante un QPC standard o un termociclatore. L'ultimo passaggio consiste nel prevedere la frazione di goccioline fluorescenti nei campioni di interesse utilizzando una curva standard generata a partire dai campioni standard. Per verificare le prestazioni di questo metodo, la microscopia fluorescente può essere utilizzata per valutare in modo indipendente l'accuratezza della quantificazione ottenuta con il saggio di fluorescenza totale.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il conteggio delle goccioline, è che non richiede strumentazione specializzata prima di iniziare la riparazione del saggio. Tutti i reagenti necessari, come descritto nel testo del protocollo, richiedono due standard. Uno, un controllo senza stampo, ad esempio acqua priva di nucleasi, e uno con elevata concentrazione di stampo, ad esempio lambda DNA. Denaturare 3,3 microlitri di ciascuno standard con 3,3 microlitri di buffer di denaturazione in un tubo A-Q-P-C-R.

Incubare a temperatura ambiente per tre minuti. Neutralizzare ciascuno con 3,3 microlitri di tampone di neutralizzazione. Analogamente, denaturare 3,3 microlitri del template di interesse con 3,3 microlitri di tampone di denaturazione, incubato a temperatura ambiente per tre minuti.

Quench con 3,3 microlitri di tampone di neutralizzazione. Preparare 11 microlitri di miscela master per campione per ridurre falsi positivi o risultati negativi. Esporre la miscela master alla luce UV prima della formazione delle goccioline.

Preparare innanzitutto 10 microlitri di miscela premiscelata per campione in un tubo trasparente da 0,5 millilitri o 1,5 millilitri su ghiaccio. La miscela premiscelata è composta da oligo randomizzato, buffer di reazione della polimerasi B-S-A-D-N-A, dn, NTP e acqua priva di nucleasi. Posizionare il tubo in acqua su ghiaccio ed esporlo alla luce UV dopo l'esposizione ai raggi UV.

Aggiungere al mix premiscelato il colorante legante A-D-S-D-N-A e la dieta di riferimento. Aggiungere per ultimo la DNA polimerasi PHI 29 per garantire che la polimerasi non entri in contatto con valori di pH molto superiori o inferiori a 7,5. Mescolare accuratamente. Combinare 10 microlitri di template denaturato o standard e 10 microlitri del mix master, quindi mescolare accuratamente.

Dato che le goccioline possono essere molto sensibili all'elettricità statica e alle sollecitazioni di taglio, l'operatore dovrebbe indossare abiti che potrebbero generare elettricità statica e mettersi a terra prima di formare le goccioline. Il dispositivo microfluidico utilizzato per questa dimostrazione è stato prodotto in laboratorio ed è dotato di un ingresso per l'olio e due ingressi acquosi con una giunzione a focalizzazione del flusso per la generazione di goccioline. Utilizzare due pompe per siringhe per controllare le portate di 55 microlitri di olio con surfattante e 20 microlitri di miscela di reazione attraverso il chip microfluidico.

Per generare 20.001 droplet di nanolitri, uno dei passaggi più difficili consiste nel raccogliere le goccioline senza alterare l'emulsione. È importante pipettare lentamente e preferibilmente utilizzare una punta larga.

Raccogliere tutte le goccioline in provette PCR per ogni campione. Aliquotare 30 microlitri di olio in provette PCR nuove con tappi ottici utilizzando una punta larga e pipettando molto lentamente. Trasferire 20 microlitri di goccioline sopra l'olio.

I volumi costanti garantiscono che il saggio sia il più accurato possibile. Chiudere bene i tappi dei tubi, poiché tappi allentati permetterebbero all'olio di evaporare; maneggiare i tubi dell'emulsione tenendoli dalla parte superiore, il più lontano possibile dall'emulsione. Per l'amplificazione isoterma si può utilizzare un termociclatore PCR, un termociclatore A-Q-P-C-R o una piastra riscaldante.

Viene utilizzato un termociclatore A-Q-P-C-R in questa dimostrazione. Incubare i campioni per sette ore a 30 gradi Celsius e inattivare per un minuto a 75 gradi Celsius. Immediatamente dopo la reazione e l'attivazione.

Misurare i livelli di fluorescenza per tutti i campioni utilizzando il termociclatore QPCR. Per ogni campione, dividere l'intensità di fluorescenza del colorante per legame del DNA a doppio filamento (D DS DNA) per l'intensità di fluorescenza del colorante di riferimento.

Sottrarre la fluorescenza di fondo o la fluorescenza normalizzata del controllo senza stampo da tutti i campioni. Creare una curva standard lineare utilizzando le misurazioni di fluorescenza corrette ottenute dagli standard. Il controllo senza stampo rappresenta la fluorescenza di un campione con il 0% di goccioline fluorescenti e con alta concentrazione di stampo.

La misurazione della fluorescenza corrisponde alla fluorescenza attesa per un campione con il 100% di goccioline fluorescenti, utilizzando la curva standard corrispondente. Prevedere i rapporti intermedi di goccioline positive e negative in base alla loro fluorescenza globale. Questo metodo utilizza uno strumento convenzionale di PCR in tempo reale per misurare la fluorescenza globale di saggi digitali basati su goccioline.

Gocce fluorescenti e non fluorescenti sono state pre-miscelate in diversi rapporti ed è stata effettuata una comparazione tra la fluorescenza complessiva e la frazione di gocce positive. Come previsto, la fluorescenza complessiva e il numero di gocce positive aumentano linearmente con la frazione in ingresso di gocce fluorescenti. I rapporti previsti, basati su standard, sono stati confrontati con le frazioni di ingresso fluorescenti attese.

La linea indica il valore atteso in caso di relazione lineare. I risultati mostrano una buona prestazione nella quantificazione del rapporto tra goccioline su due ordini di grandezza di intervallo dinamico. Per testare questo metodo in un reale saggio quantitativo di amplificazione dell'intero genoma, livelli di fluorescenza e frazioni di goccioline positive di una gocciolina digitale.

Sono state effettuate misurazioni con l'assay MDA utilizzando concentrazioni crescenti di DNA Lambda come template. La linea indica la frazione fluorescente attesa, calcolata impiegando la distribuzione di Poisson per modellare i dati dell'esperimento. Sono mostrate immagini fluorescenti rappresentative delle goccioline, sia la fluorescenza complessiva che la frazione di goccioline positive, che variano in modo proporzionale al numero medio di template per gocciolina, indicando che la lettura complessiva può riprodurre fedelmente il risultato di un assay digitale.

Questo metodo può essere vantaggioso per altri saggi digitali, come la PCR digitale, accelerando il parallelismo e semplificando la lettura del saggio.