Preparazione di altamente poroso Coordinamento rivestimenti polimerici su macroporosi Polymer Monoliti di avanzata Arricchimento fosfopeptidi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di preparare un nuovo materiale di supporto con prestazioni migliorate nell'estrazione selettiva di fosfopeptidi. Ciò si ottiene mediante un'adeguata preparazione di un monolite capillare polimerico poroso con gruppi funzionali adeguati. In primo luogo, una specie metallica viene immobilizzata sui gruppi funzionali di un monolite polimerico, rendendo il supporto selettivo per l'estrazione dei fosfopeptidi.

Successivamente, viene eseguita la crescita graduale di più strati della struttura organica metallica al fine di aumentare la quantità di siti metallici, aumentando così la selettività per i fosfopeptidi. I risultati mostrano una migliore selettività per l'estrazione di peptidi fosfo da digestati proteici basati su ionizzazione a desorbimento laser assistita da matrice, spettrometria di massa a tempo di volo. L'arricchimento del peptide O viene solitamente effettuato mediante cromatografia di affinità di leone metallico, che viene eseguita su particelle di silice convenzionali o particelle polimeriche, che vengono impacchettate in una colonna cromatografica.

Il nostro materiale combina i vantaggi di un monolite polimerico macroporoso, che ha buone proprietà di trasporto di massa, con l'elevata capacità di legare di una struttura organica metallica. Il modo in cui otteniamo questo risultato è quello di far crescere in sequenza la struttura organica metallica dalla superficie del monolite, in modo che, alla fine, abbiamo più strati di linee metalliche disponibili per interagire con l'analita. La dimostrazione visiva della preparazione del monolite polimerico e la crescita della struttura organica metallica sono entrambe importanti perché sono molto difficili da imparare. Ci sono diversi passaggi importanti a cui bisogna prestare attenzione per ottenere un monolite con buone proprietà superficiali e porosità.

Per iniziare, tagliare due metri di un capillare di silice fusa rivestito in poliammide e con un diametro interno di 100 micron collegato a una siringa di vetro da 25 millilitri e lavare il capillare con acetone. Quindi rimuovere l'acetone sciacquando il capillare con acqua. Posizionare quindi una siringa di vetro da 250 microlitri riempita con un idrossido di sodio acquoso molare 0,2 molare sulla pompa a siringa e far scorrere la soluzione al punto 25 microlitri al minuto attraverso il capillare per 30 minuti per attivare il rivestimento interno di silice.

Dopo 30 minuti, sciacquare il capillare con acqua fino a quando l'effluente non è neutro. Utilizzare strisce di pH di carta per verificare il flusso di pH neutro. Quindi caricare la siringa con 0,2 molari di acido cloridrico acquoso e pompare la soluzione attraverso il capillare al punto 25 microlitri al minuto per protonare i gruppi ciol dopo 30 minuti di flusso, di nuovo, sciacquare il capillare con acqua fino a quando il flusso non è neutro.

Una volta che il pH è neutro, sciacquare i capillari con una siringa da 250 microlitri riempita con etanolo al 100%. Quindi pompare una soluzione al 20% di tre trimetilpropil metacrilato in etanolo al punto 25 microlitri al minuto per un'ora per funzionalizzare la superficie con gruppi vinilici. Successivamente, sciacquare i capillari con acetone e asciugarli con un getto di azoto.

Lasciare riposare i campioni a temperatura ambiente per una notte, quindi tagliarli in sezioni lunghe 20 centimetri. Preparare la miscela di polimerizzazione in una fiala di vetro da un millilitro con un setto di gomma come descritto nel protocollo di testo allegato. Aggiungere l'1% di IBN rispetto ai monomeri come iniziatore e sonicare la miscela per 10 minuti.

Successivamente, collegare un capillare di silice non funzionalizzato a un flusso di azoto e inserirlo attraverso il setto di gomma nella miscela di polimerizzazione. Allentare leggermente il tappo del flaconcino e far bollire lentamente l'azoto attraverso la miscela per 10 minuti. Dopo 10 minuti, sollevare il flusso di azoto capillare dalla miscela di polimerizzazione allo spazio di testa del flaconcino e chiudere bene il tappo.

Inserire uno dei capillari funzionalizzati attraverso il setto nella miscela di polimerizzazione. Utilizzare l'eccesso di pressione generato dall'azoto per pompare la miscela di polimerizzazione nel capillare funzionalizzato. Lasciare che diverse gocce della miscela di polimerizzazione fluiscano dall'effluente del capillare per assicurarsi che sia completamente riempito, quindi chiuderlo con un setto di gomma.

Estrarre il capillare dalla fiala con molta attenzione e chiudere l'ingresso con un setto di gomma posto una miscela contenuta nel capillare in un bagno d'acqua riscaldata a 60 gradi Celsius per sei ore per polimerizzare. Al termine, raffreddare il capillare a temperatura ambiente e poi tagliare alcuni millimetri da entrambe le estremità del capillare. Successivamente, utilizzare una pompa HPLC per lavare la colonna con acetonitrile a quattro microlitri al minuto per 30 minuti.

Questo rimuoverà tutti i monomeri non reattivi, i monomeri e gli agenti formanti scadenti. Controllare la contropressione della colonna capillare. Quindi, lavare il monolite capillare in cicli con i reagenti mostrati qui per far crescere il rivestimento organico metallico finale.

Lo spessore del rivestimento è determinato dal numero di cicli eseguiti. Lavare i capillari con il rivestimento organico metallico preparato utilizzando 100 microlitri di una miscela quattro a uno di acetonide di prova e acido trior acetico acquoso allo 0,1%. Quindi pompare un digestato proteico attraverso la colonna a due microlitri al minuto.

Per 30 minuti, lavare nuovamente i peptidi non fosforilati con una miscela quattro a uno di acetil NI trial e acido acetico Tri Fluor acquoso allo 0,1% per 10 minuti a una velocità di flusso di un microlitro al minuto. Lavare con acqua per 10 minuti alla portata di un microlitro al minuto. Eluire i fosfopeptidi utilizzando una soluzione tampone fosfato da 250 micromolari a pH sette pompandola attraverso il capillare a un microlitro al minuto per 15 minuti, raccogliere l'ellu in una fiala e desalinizzare la soluzione utilizzando un protocollo standard.

Quindi, preparare una soluzione di due milligrammi per millilitro di acido benzoico a due cinque diidrossi in metanolo e mescolare due microlitri di questa soluzione con due microlitri della soluzione di peptide fosfomico allusa. All'interno di una punta di pipetta, posizionare questa miscela direttamente sulla piastra di ionizzazione a desorbimento laser assistita da matrice e lasciare asciugare completamente lo spot. Analizzare i punti mediante laser assistito da matrice, desorbimento, ionizzazione, tempo di volo, spettrometria di massa, infine rigenerare la colonna lavandola accuratamente con acqua, seguita da capillari di metanolo modificati con più strati di ferro disponibile.

Tre gruppi sono ideali per l'uso nella cromatografia di affinità con ioni metallici immobilizzati, mostrati qui sono spettri ottenuti da proteine digerite prima e dopo l'arricchimento, che mostrano una notevole selettività per 12 diversi peptidi fosfo. Gli esperimenti di caratterizzazione rappresentativa forniscono informazioni preziose sull'emergere di nuovi pori. Ecco un'immagine di un monolite in polvere sfusa dopo 30 cicli di polimeri di coordinazione porosi, noti come cicli PCP, utilizzando un microscopio elettronico a scansione.

Dopo 30 cicli di PCP, la dimensione delle larghezze dei pori nel materiale è risultata inferiore a tre nanometri di diametro rispetto al polimero sfuso. L'ibrido ha una grande quantità di area incrementale con pori piccoli. Ciò porta ad un aumento dell'assorbimento di azoto attraverso una gamma di pressioni utilizzando la spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier.

L'incorporazione iniziale dei gruppi funzionali carbossilici era visibile così come la crescita del rivestimento dopo 10, 20 e 30 cicli di PCP. Infine, l'analisi termogravimetrica è stata utilizzata per misurare la quantità di siti metallici aggiuntivi che si accumulavano ad ogni ciclo. Di seguito è illustrata l'analisi gravimetrica attraverso un intervallo di temperature, che conferma la presenza di un numero maggiore di siti metallici con un numero di cicli aumentato.

Seguendo questo protocollo, una procedura simile può essere sviluppata per diversi centri metallici in leganti organici al fine di ottenere separazioni efficienti di diversi analiti in base alla loro affinità per un particolare framework. Credo che i materiali compositi come il nostro, che combinano polimeri macroporosi con strutture metalliche organiche, siano molto promettenti nel campo della scienza della separazione perché possono migliorare notevolmente la selettività, la capacità di legame e l'efficienza complessiva delle separazioni, sia su scala analitica che preparativa.