Name: Isolamento e caratterizzazione di neutrofili con proprietà antitumorali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Scopri come isolare neutrofili con proprietà antitumorali mediante gradiente di densità e co-cultura con cellule tumorali marcate con luciferasi. Questo metodo consente di valutare la citotossicità senza radioattività.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I neutrofili sono la più abbondante di tutte le cellule bianche del sangue e sono i primi interventi in caso di infezioni e infiammazioni. Come tali, essi sono molto sensibili a segnali esterni e sono facilmente attivati. Inoltre, i neutrofili hanno una breve emivita e un rapido turnover. Insieme, queste caratteristiche sollevano varie difficoltà nel lavorare con neutrofili, tale che sono richieste uniche strategie sperimentali. Per esempio, ci sono diverse strategie di purificazione dei neutrofili, ognuno con i suoi pr...

I neutrofili sono stati inizialmente caratterizzati come le cellule immunitarie innate che servono come prima linea di difesa contro i microrganismi invasori. Oggi è noto che i neutrofili hanno più funzioni di vasta portata, essere coinvolti in montaggio le risposte immunitarie adattive contro antigeni estranei 1,2, regolando emopoiesi 3, l&#39;angiogenesi e la guarigione delle ferite 4 5. Inoltre, i neutrofili possono influenzare la crescita tumorale e nella progressione metastatica in virtù delle loro pro e anti-tumorali attività 6,7. I neutrofili sono caratterizzati da un nucleo segmentato polimorfico (quindi definito polimorfonucleati (PMN) leucociti) e contenere almeno tre sottoclassi distinte di granuli e vescicole secretorie 8 (Figura 1A-C). I neutrofili possiedono elevata capacità fagocitica e alta NADPH ossidasi critico per l&#39;eliminazione microbica, e secernono una vasta gamma di chemochine importanti da untrazione dei neutrofili supplementari e di altre cellule immunitarie al sito di infiammazione 8,9. I neutrofili si caratterizzano per l&#39;espressione di una grande quantità di recettori di superficie, tra cui i recettori Toll-like (TLR), C-type lectina recettori (CLR), completano il recettore 3 (CD11b / CD18) e altre molecole di adesione (per esempio, L-selectina, LFA-1, VLA-4 e Carcinoembrionario legati molecola di adesione delle cellule 3 (CEACAM3 / CD66b)), recettori per chemochine (ad esempio, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), i recettori chemotattiche (ad esempio, PAFR, LTB 4 R e C5aR) , i recettori delle citochine (ad esempio, G-Cecoslovacchia, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formil-peptidi recettori (ad esempio, FPR1-3) e recettori Fc (ad esempio, CD16 (FcγRIII ), CD32 (FcγRII) e CD64 (FcγRI) 10. Nei topi, i neutrofili sono solitamente identificati come CD11b + Ly6G +, mentre neutrofili umani vengono identificati utilizzando i marcatori di leucociti CD11b, CD15, CD16 e CD66b. Inoltre, è generalmente accettato di macchia per il proteine ​​granuli mieloperossidasi (MPO) e neutrofila (NE) per la rilevazione dei neutrofili nei tessuti. Non è ancora chiaro se le diverse funzioni dei neutrofili sono mediate dalla stessa cellula o di cellule distinte sottopopolazioni. Dati accumulando suggeriscono la presenza di una popolazione eterogenea neutrofili che presenta un elevato grado di plasticità colpiti da stimoli pro-infiammatori e il microambiente 11,12. Fridlender et al. 13 hanno grossolanamente diviso i neutrofili nel cancro in due grandi sotto-popolazioni chiamato N1 con proprietà anti-tumorali e N2 con proprietà pro-tumorali. Nel cancro, nonché in infiammazione cronica, vi è una sotto-popolazione supplementare composto di cellule mieloidi granulocitari derivate soppressori (G-MDSCs) che sopprimono le risposte delle cellule T 14. G-MDSCs sono considerati cellule mieloidi immature caratterizzate da un CD11b + Ly6Cbasso Ly6G fenotipo hi nei topi 15, pur avendo una CD15 + / CD16 basso fenotipo in umano 16. G-MDSCs esprimono alti livelli di arginasi e mieloperossidasi, mentre bassi livelli di citochine e chemochine che normali neutrofili circolanti. Sono meno fagociti e migratoria, ma producono alti livelli di ROS 15,17,18. Nel presente lavoro descriveremo alcune metodologie di base per l&#39;isolamento e la caratterizzazione dei neutrofili con proprietà antitumorali. Mentre neutrofili costituiscono la più grande popolazione di tutte le cellule bianche del sangue nella circolazione umana (45 - 70%; 1.800 - 6.000 / ml), nei topi, in condizioni normali, sono piuttosto scarse (10 - 15%; 300-500 / ml ). La conta dei neutrofili aumenta costantemente su infiammazione e, occasionalmente, nel cancro, che rappresenta uno stato di infiammazione cronica 7. I neutrofili si sviluppano da multipotenti precursore mieloide comune (CMP) cells nel midollo osseo, attraverso un processo di differenziazione che passano le fasi di mieloblasti (MB), promielociti (PM), mielociti (MC), metamielociti (MM) e cellule della band (BC) 8. I maturi, neutrofili post-mitotico possono rimanere all&#39;interno del midollo osseo per 4-7 giorni prima di essere rilasciati alla circolazione 8. Fatturato dei neutrofili nel sangue è di solito rapido con una emivita media di 6-12 ore, che può essere prolungata in condizioni infiammatorie. Neutrofili non stimolate hanno limitato l&#39;attività anti-cancerogena, una caratteristica che può essere acquisita esponendo i neutrofili naïve alle chemochine IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 e CXCL5 6,19 o artificialmente, esponendoli a estere phorbol phorbol 12 -myristate 13-acetato (PMA) 6. La breve emivita di neutrofili nel sangue insieme con il basso numero di neutrofili (~ 3-5 x 10 5) ottenuto da 1 ml di sangue di un ingenuo 6-8 settimane di età del mouse, l&#39;hanno fattadifficile da esplorare la funzione di far circolare il mouse neutrofili in vitro. Per superare questa difficoltà, sono state utilizzate altre fonti. Per esempio, un gran numero di neutrofili possono essere ottenute dal midollo osseo 20 o il peritoneo dopo l&#39;induzione dell&#39;infiammazione sterile (ad esempio, dopo l&#39;iniezione intraperitoneale di tioglicolato brodo o Zymosan A). Va notato che i neutrofili ottenuti dalla cavità peritoneale non esercitano alcuna attività anti-cancerogena (osservazioni non pubblicate). . Granot et al 6 osservato che i topi BALB / c inoculati ortotopicamente con il mouse 4T1 seno linea cellulare di carcinoma sviluppare neutrofilia che aggrava con progressione tumorale 6 (Figura 2A), tale che 20-40.000.000 neutrofili sangue possono essere facilmente isolati da 1 ml di sangue 3 - 4 settimane dopo l&#39;inoculazione del tumore. Questi neutrofili hanno acquisito le attività anti-tumorali, e di conseguenza sono stati coineutrofili ned tumorali trascinato (TEN), al fine di distinguerli dai neutrofili naïve 6 (Figura 2B). Mentre neutrofili alta densità (HDN, Figura 1A) sono altamente anti-oncogeno, neutrofili a bassa densità (LDN, Figura 1B) generate nel contesto di cancro non sono 21. Inoltre, i neutrofili ad alta densità del midollo osseo e milza di topi portatori di tumore hanno attività anti-tumorale (dati non pubblicati). Va notato che, con progressione tumorale milza diventa gradualmente (splenomegalia), con quantità crescenti di neutrofili. Va notato che TEN vengono generati anche in altri modelli di cancro inclusi sia spontanei (MMTV-PyMT e MMTV-Wnt1 tumori mammari e k-Ras tumori polmonari motrice) e iniettato (AT-3 (MMTV-PyMT) e carcinoma mammario E0771 cellule, LLC Lewis cellule di carcinoma del polmone e cellule B16-F10 melanoma). Tuttavia, la misura di neutrofili mobilitazione in questi tumo modelli è molto meno di topi 4T1-inoculati, raggiungendo 5 - 10 x 10 6 neutrofili in 1 ml di sangue dopo 3 settimane.

<table><tbody><tr><td>LINEE CELLULARI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellule di carcinoma mammario di topo 4T1</td><td>ADCC</td><td>CRL-2539</td><td>Mezzo di crescita: DMEM + 10 % di prodotti e attrezzature in plastica FBS INATTIVATI</td></tr> A <tr><td></td> CALDO Piastra <td></td><td></td><td></td></tr> per <tr><td>coltura tissutale a 24 pozzetti&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td>Piastra sterile</td></tr><tr><td>per coltura tissutale da 100 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Pallone sterile per coltura tissutale da 25 cm2</td><td>Nunc</td><td>156340</td><td>Piatto sterile</td></tr><tr><td>per coltura di grado batterico da 90 mm.</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israele</td><td>20090-01-017</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 15 ml Sterile Conico Centrifuga Tubo&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israele</td><td>835015-40-111</td><td>Provetta</td></tr> da <tr><td>centrifuga conica sterile sterile da 50 ml&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israele</td><td>835050-21-111</td><td>Falcon sterile</td></tr><tr><td>12 x 75 mm Tubo in polistirene a fondo tondo&nbsp;</td>Piastra di migrazione <td>sterile Millicell 24 Becton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>con pori di 5&mu; m&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>PSMT010R1</td><td>Piastra Sterile</td></tr><tr><td>a 96 Pozzetti a Fondo Piatto Bianca</td><td>Costar</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per cellule sterili (40 mm)&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>Ago sterile</td></tr><tr><td>20G x 1,5"</td><td>BD Microlance 3&nbsp;</td><td>301300</td><td>Ago sterile</td></tr><tr><td>23G x 1"</td><td>BD Microlance 4</td><td>300800</td><td>Ago sterile</td></tr><tr><td>25G x 5/8"&nbsp;</td><td>BD Microlance 5</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Siringa sterile da 0,3 ml con ago da 30 G x 8 mm</td><td>BD Micro-Fine Plus Demi</td><td>320829</td><td>Clip sterili</td></tr><tr><td>da 9 mm.</td><td>BD, AutoClip&nbsp;</td><td>427631</td><td>Magnete EasySep sterile</td></tr><tr><td></td>Colonna di separazione <td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>Magnete</td></tr><tr><td>separatore MidiMACS</td> sterile <td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio&nbsp;</td><td>Menzel-Gl&auml; ser Superfrost&nbsp; Agitatore</td> orbitale Plus <td>Thermo J1800AMNZ</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>Sky line,</td> Lettore di piastre ELMI <td>S-3.02.10L</td><td></td></tr><tr><td></td><td>TECAN</td><td>InfiniteF200Pro</td><td></td></tr><tr><td>POWDER</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA), frazione V</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeossiuridina (BrdU)&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td>CFSE sterile</td></tr><tr><td>(5-(e 6-)-carbossifluoresceina diacetato, succinimidil estere)</td><td>Sonde molecolari</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>destrano T500</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td></td></tr><tr><td>eparina sale sodico dalla mucosa intestinale suina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>Altamente tossico, maneggiare con cura</td></tr><tr><td>Polvere di tioglicolato&nbsp;</td><td>Difco</td><td>225650</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan A</td><td>Sigma</td><td>Z4250</td><td></td></tr><tr><td>TERRENI E SUPPLEMENTI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg; Ho ridotto il siero medio&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Siero</td></tr><tr><td>bovino fetale sterile (FBS), inattivato termicamente</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>sterile</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israele</td><td>03-020-1A</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Sodium piruvato</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israele</td><td>03-042-1B</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina sterile Streptomicina x 1000 soluzione</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israele</td><td>03-031-5</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS) senza Mg2+ e Ca2+&nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israele</td><td>02-023-1</td><td>PBS sterile</td></tr><tr><td>x 10 senza Ca2+ e Mg2+&nbsp;</td><td>Industrie biologiche, Beth HaEmek, Israele</td><td>02-023-5A</td><td>Acqua sterile</td></tr><tr><td>di grado HPLC&nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>4218-03</td><td>Autoclave</td></tr><tr><td>SOLUZIONI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACK Tecnologie per la vita di ammonio-cloruro-potassio</td><td>&nbsp;</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di bromodeossiuridina (BrdU) (10 mg/ml) in PBS</td><td></td><td></td><td>Sciogliere 10 mg di BrdU in 1 ml di PBS e filtro sterile.</td></tr><tr><td>CFSE, 5 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Sciogliere 2,8 mg di CFSE in 1 ml di DMSO. Dividere in aliquote da 10 ml in provette sterili da 200 ml e conservare al buio a -20oC.</td></tr><tr><td>Soluzione di eosina Y</td><td>Sigma</td><td>HT110-2-32</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israele</td><td>02-016-1A</td><td>Eparina sterile</td></tr><tr><td>, 20 mg/ml in PBS</td><td></td><td></td><td>Sciogliere 100 mg di eparina in 5 ml di PBS sterile e filtrare sterile attraverso un filtro da 0,2 mm.</td></tr><tr><td>Histopaque-1119&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Filtro sterile attraverso un filtro da 0,2 mm.</td></tr><tr><td>Histopaque-1077&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>Filtro sterile attraverso un filtro da 0,2 mm.</td></tr><tr><td>Tampone per lisi per colture cellulari Luciferasi x5</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>Diluire 1:5 in acqua sterile appena prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Soluzione di saggio della luciferasi</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td>Contiene polvere di substrato del saggio della luciferasi (E151A) e tampone del saggio della luciferasi (E152A)</td></tr>Soluzione <tr><td>di ematossilina di Mayer&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>MHS-32</td><td></td></tr><tr><td>PBS + 0,5% BSA</td><td></td><td></td><td>Sciogliere 2,5 g di BSA in 500 ml di PBS e filtrare in modo sterile attraverso un filtro da 0,2 mm.</td></tr><tr><td>PBS + 1% BSA</td><td></td><td></td><td>Sciogliere 1 g di BSA in 100 ml di PBS e filtrare in modo sterile attraverso un filtro da 0,2 mm.</td></tr><tr><td>5x PBS con il 2,5% di BSA</td><td></td><td></td><td>Sciogliere 12,5 g di BSA in una miscela di 250 ml di acqua sterile di grado HPLC e 250 ml di PBSx10 e filtro sterile attraverso un filtro da 0,2 mm.</td></tr><tr><td>PBS contenente lo 0,5% di BSA e 2 mM di EDTA</td><td></td><td></td><td>Sciogliere 250 mg di BSA in 50 ml di PBS sterile e aggiungere 200 ml di EDTA 0,5M pH 8,0, filtro sterile attraverso un filtro da 0,2 mm.</td></tr><tr><td>Tampone FACS (PBS contenente 0,5% BSA, 2 mM EDTA e 0,02% NaN3)Sciogliere</td><td></td><td></td> <td>250 mg di BSA in 50 ml di PBS sterile e aggiungere 200 ml di EDTA 0,5M pH 8,0 e 500 ml di NaN3 filtro sterile attraverso un filtro da 0,2 mm.</td></tr><tr><td>Soluzione salina (0,9% NaCl)</td><td></td><td></td><td>Sciogliere 9 g di NaCl in 1.000 ml di ddw, autoclavare in autoclave</td></tr> la <tr><td>soluzione</td><td></td><td></td> di NaCl allo 0,2% <td>Sciogliere 2 g di NaCl in 1.000 ml di ddw, autoclavare in autoclave</td></tr> la <tr>soluzione <td></td><td></td> di<td>NaCl all'1,6%</td><td>Sciogliere 16 g di NaCl in 1.000 ml di ddw, autoclave</td></tr><tr><td>al 2% di azoturo</td><td></td><td></td><td>di sodio Sciogliere 1 g di azide di sodio in 50 ml di ddw sterile, conservare a 4oC. Altamente tossico.</td></tr><tr><td>Soluzione di tioglicolato</td><td></td><td></td> al 3<td>%&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Sciogliere 3 g di polvere di tioglicolato in 100 ml di ddw. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Far bollire fino a quando la soluzione diventa gialla e sterilizzare in autoclave.</td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Diluire 1:10 in PBS per ottenere una soluzione allo 0,04%.</td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina B&nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israele</td><td>03-046-1</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>1 mg/ml Zymosan A</td><td></td><td></td><td>Risospendere 1 mg di Zymosan A in 1 ml di PBS sterile in una provetta Eppendorf. Agitare energicamente e incubare la provetta a 37 oC per 30 minuti. Non sterilizzare in autoclave. Preparare la soluzione appena prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Kit di</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>selezione EasySep PE</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18557</td><td></td></tr><tr><td>EasySep PE cocktail di selezione&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18151</td><td></td></tr><tr><td>le nanoparticelle magnetiche EasySep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18150</td><td></td></tr><tr><td>Kit MicroBead per topi Anti-Ly6G</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-332</td><td></td></tr><tr><td>Kit per l'arricchimento dei neutrofili del topo EasySep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>Kit per l'arricchimento dei neutrofili umani EasySep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19257</td><td></td></tr><tr><td>Kit di flusso FITC BrdU</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td>Kit</tr> di <tr><td>isolamento dei neutrofili 559619 MACS Kit per</td> il test di fagocitosi <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-658</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Azienda chimica delle Cayman&nbsp;</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>ANTICORPI Anticorpi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anticorpi bloccanti FcR&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo purificato anti-Ly6G per ratti&nbsp;</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>551459</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>PE-coniugato ratto anti-topo anticorpo Ly6G&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>127608</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>FITC-coniugato ratto anti-topo Ly6G</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>551460</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 ratto anti-topo Ly6G&nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>65-1276</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>violetFluor 450-coniugato ratto anti-topo Ly6G&nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>75-1276</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>FITC-coniugato ratto anti-topo CD11b</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553310</td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>FITC-coniugato ratto anti-topo Ly-6G e Ly-6C (GR-1)</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553127</td><td>Clone RB6-8C5</td></tr><tr><td>PE-coniugato ratto anti-topo CD45</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553081</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Ratto coniugato FITC anti-topo F4/80&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab60343</td><td>Clone BM8</td></tr><tr><td>Mouse coniugato FITC anti-umano CD66b&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>305103</td><td>Clone G10F5</td></tr><tr><td>Anticorpo purificato per il controllo dell'isotipo di ratto (IgG2a, k)&nbsp;</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553927</td><td>Clone R35-95</td></tr><tr><td>LEAF criceto armeno purificato anticorpo CD3e anti-topo</td><td>BioLegend</td><td>100314</td><td>Clone 145-2C11</td></tr></tbody></table>

isolamento e caratterizzazione di neutrofili con proprietà antitumorali

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrofili, il più abbondante di tutte le cellule bianche del sangue nella circolazione umana, svolgono un ruolo importante nella difesa dell&#39;ospite contro microrganismi invasori. Inoltre, i neutrofili giocano un ruolo centrale nella sorveglianza immunitaria di cellule tumorali. Essi hanno la capacità di riconoscere le cellule tumorali e indurre la morte delle cellule tumorali tramite un meccanismo di contatto-dipendente delle cellule coinvolgono il perossido di idrogeno o attraverso citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente (ADCC). I neutrofili con attività anti-tumorale possono essere isolate dal sangue periferico di pazienti affetti da cancro e di topi portatori di tumore. Questi neutrofili sono chiamati neutrofili tumore trascinato (TEN) per distinguerli dai neutrofili di soggetti sani o topi ingenua che non mostrano una significativa attività citotossica tumorale. Rispetto ad altri globuli bianchi, neutrofili mostrano diversa galleggiabilità rendendo così possibile ottenere a&gt; 98% popolazione neutrofili puro quando sottoposto ad un gradiente di densità. Tuttavia, in aggiuntaalla popolazione normale neutrofili alta densità (HDN), in pazienti affetti da cancro, in topi portatori di tumore, come pure in condizioni infiammatorie croniche, popolazioni neutrofili bassa densità distinti (LDN) appaiono nella circolazione. LDN co-purificare con la frazione mononucleare e può essere separato dalle cellule mononucleari utilizzando sia strategie di selezione positiva o negativa. Una volta che la purezza dei neutrofili isolati è determinata mediante citometria di flusso, possono essere utilizzati per in vitro e in vivo saggi funzionali. Descriviamo tecniche per il monitoraggio dell&#39;attività antitumorale di neutrofili, la loro capacità di migrare e per produrre specie di ossigeno reattive, così come il controllo della loro capacità fagocitica ex vivo. Descriviamo ulteriormente le tecniche per etichettare i neutrofili per il monitoraggio in vivo, e di determinare la loro capacità anti-metastatica in vivo. Tutte queste tecniche sono essenziali per capire come ottenere e caratterizzare neutrofili con antitumoralefunzione.

In un recente studio abbiamo identificato una funzione anti-metastatico per i neutrofili 6. I neutrofili da topi portatori di tumore acquisire un fenotipo citotossico e hanno la capacità di uccidere le cellule tumorali 6. Questo è in contrasto con neutrofili da topi naive che non hanno alcun significativo effetto antitumorale 6. Molte delle tecniche descritte nella sezione protocollo sono stati utilizzati per studiare la funzione dei neutrofili antitumorale in vitro e in viv...

I neutrofili svolgono un ruolo importante non solo nella difesa dell'ospite contro i microrganismi invasori, ma sono anche coinvolti nella sorveglianza immunitaria delle cellule tumorali. Qui, descriviamo le tecniche relative all'isolamento di neutrofili con proprietà antitumorali e i metodi per monitorare la funzione dei neutrofili antitumorali in vitro e in vivo.

Isolamento e caratterizzazione di neutrofili con proprietà antitumorali

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la funzione dei neutrofili nel cancro. Questo viene raggiunto innanzitutto ottenendo il sangue periferico. Nel secondo passaggio, i neutrofili vengono purificati mediante gradiente di densità seguito da una co-coltura notturna.Con cellule tumorali marcate con luciferasi, l'attività della luciferasi nelle cellule viene quindi quantificata. In definitiva, la quantità di luciferasi in ciascuna co-coltura può essere inversamente correlata alla citotossicità dei neutrofili presenti in ogni co-coltura. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la separazione dei neutrofili mediante anticorpi e altri metodi per la valutazione della vitalità cellulare, è che questa procedura minimizza l'attivazione non specifica dei neutrofili e consente la misurazione della vitalità cellulare senza l'uso di marcatori radioattivi.Dimostreranno questa procedura un allievo specializzando del mio laboratorio e il dottor Simoni, un ricercatore post-dottorato del mio laboratorio. Per isolare i neutrofili da un topo con tumore, iniziare diluendo un millilitro di sangue ottenuto mediante puntura cardiaca in PBS contenente lo 0,5% di BSA fino a un volume finale di sei millilitri. Successivamente, aggiungere tre millilitri di soluzione di saccarosio sterile filtrata a 1,119 grammi per millilitro sul fondo di una provetta conica in polipropilene da 15 millilitri. Poi inclinare lentamente e con attenzione la provetta.Aggiungere tre millilitri di soluzione sterile di saccarosio filtrata a 1,077 grammi per millilitro sopra la soluzione di saccarosio a 1,119 grammi per millilitro, seguiti da sei millilitri di sangue diluito. Separare le cellule mediante centrifugazione su gradiente di saccarosio per 30 minuti a 700 G a temperatura ambiente. Al termine della separazione, la maggior parte degli eritrociti si troverà sul fondo del tubo.I neutrofili ad alta densità si troveranno intorno al segno di tre millilitri, nell'anello bianco-rosso all'interfaccia tra gli strati di saccarosio. I leucociti a bassa densità si troveranno invece nell'anello bianco all'interfaccia tra lo strato di 1,077 grammi per millilitro e il PBS contenente BSA, intorno al segno di sei millilitri; aspirare lo strato P-B-S-B-S-A fino a cinque millimetri sopra lo strato di cellule a bassa densità. Quindi, utilizzando una punta di pipetta da un millilitro, rimuovere le cellule a bassa densità mediante aspirazione lenta, agitando lentamente le cellule.Distribuire le cellule in 30 millilitri di PBS con 0,5% di BSA. Successivamente, trasferire i neutrofili ad alta densità in un tubo separato con 30 millilitri di PBS aggiunto di BSA. Allo stesso modo, centrifugare entrambi i campioni di cellule, quindi risospendere i pellet in 36 millilitri di acqua sterile di grado HPLC.Dopo 30 secondi, ripristinare l'isotonicità delle cellule aggiungendo nove millilitri di PBS 5X integrato con BSA al 2,5% e centrifugare le cellule. Successivamente, risospendere le cellule in 10 millilitri di P-B-S-B-S-A e determinare il numero di cellule vitali mediante esclusione del blu di trian. Dopo un'ulteriore centrifugazione, risospendere i neutrofili nel mezzo di incubazione alla densità cellulare finale appropriata.Per isolare i neutrofili circolanti da un paziente affetto da cancro. Iniziare mescolando 10 millilitri di sangue umano eparinizzato con un volume uguale di 3% DExT strand T 500 in soluzione salina, lasciando incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per sedimentare gli eritrociti. Una volta che i globuli rossi si sono depositati, stratificare lentamente il sopranatante ricco di leucociti su 10 millilitri di soluzione di saccarosio a 1,077 grammi per millilitro, quindi separare le cellule mediante centrifugazione. Come appena dimostrato, i neutrofili umani ad alta densità si troveranno nel pellet, mentre i neutrofili a bassa densità si purificheranno insieme ai monociti e ai linfociti all'interfaccia tra lo strato di saccarosio a 1,077 grammi per millilitro e il plasma.Dopo aver raccolto i neutrofili come appena dimostrato, diluire le cellule in 10 millilitri di cloruro di sodio allo 0,2% per 30 secondi al fine di lisare gli eritrociti contaminanti. Quindi aggiungere 10 millilitri di cloruro di sodio all'1,6% per ripristinare l'isotonicità delle cellule e capovolgere il tubo una volta per mescolare. Centrifugare le cellule e lavare il pellet tre volte in 20 millilitri di HBSS.Quindi conta le cellule e sospendile in RPMI 1640, integrato con FBS al 2%, alla densità cellulare appropriata. Per isolare i neutrofili indotti da thi glyco o Xan, utilizza una siringa tubercolinica con un ago da 23 gauge di un pollice per somministrazione intraperitoneale.Iniettare un millilitro della soluzione appropriata nell'addome del topo. Da quattro a 24 ore dopo, iniettare cinque millilitri di PBS sterile nel peritoneo dell'animale eutanasizzato utilizzando una siringa da cinque millilitri dotata di un ago da 25 gauge e cinque ottavi di pollice. Massaggiare delicatamente il peritoneo, quindi reimmettere il liquido nella siringa per raccogliere le cellule dell'esudato peritoneale.Lavare le cellule in RPMI 1640, un mezzo integrato con FBS al 10%. Quindi, per rimuovere i macrofagi, incubare un milione di cellule per millilitro in una piastra per colture cellulari contenente mezzo integrato con FBS per due ore a 37 gradi Celsius. Per colorare i neutrofili isolati, risospendere un centomila di cellule in aliquote di 50 microlitri di PBS e centrifugare le sospensioni cellulari in un adattatore per preparazione di strato sottile di cellule a 150 G. Dopo cinque minuti, separare i vetrini pre-etichettati dall'adattatore, fissare e colorare le cellule.Successivamente, lavare i vetrini 15 volte con acqua del rubinetto. Lasciare asciugare i vetrini all'aria e quindi osservare le cellule al microscopio ottico per valutare l'attività antitumorale dei neutrofili. Diluire cinque volte 10 alla quarta cellule tumorali marcate con luciferasi per millilitro in un mezzo con siero ridotto ottimizzato, integrato con 0,5% di FBS.Quindi seminare cinque volte 10 alla terza cellule tumorali in 100 microlitri di mezzo ottimizzato con siero ridotto contenente 0,5% di FBS in ciascun pozzetto di una piastra da coltura tissutale bianca a 96 pozzetti con fondo piatto. Quattro ore dopo, aggiungere in ciascun pozzetto un milione di neutrofili in 50 microlitri di mezzo ottimizzato con siero ridotto contenente 0,5% di FBS per un'incubazione notturna. La mattina seguente, aspirare delicatamente il sopranatante e lavare ogni pozzetto con 200 microlitri di PBS.Quindi aspirare il PBS e aggiungere 50 microlitri di tampone di lisi passiva in ogni pozzetto. Successivamente, incubare la piastra coperta con pellicola in un agitatore orbitale a 150 giri al minuto a temperatura ambiente. Dopo 20 minuti, caricare la piastra nel lettore di luminescenza.Iniettare 50 microlitri di soluzione per saggio della luciferasi in ogni pozzetto e leggere la chemiluminescenza per 10 secondi per pozzetto. Infine, utilizzare la formula per calcolare la percentuale di lisi tumorale al fine di verificare il grado di citotossicità dei neutrofili in questo esperimento rappresentativo di uno virgola zero per dieci alla quinta. I neutrofili sono stati coltivati in co-coltura con cellule bersaglio 4T1 che esprimono luciferasi, come appena dimostrato, in co-colture con neutrofili purificati da topi liberi da tumore.È stata osservata una minima uccisione delle cellule tumorali. Tuttavia, i neutrofili purificati da topi con tumore hanno mostrato un livello significativo di citotossicità per testare le proprietà immunosoppressive dei neutrofili a bassa e alta densità. Il numero di cellule T spleniche CD8 positive dopo stimolazione con anti-CD3 o anti-CD3 più neutrofili a bassa o alta densità è stato valutato dopo l'attivazione con anti-CD3.È stato osservato un aumento significativo delle cellule positive per CD8. Tuttavia, la co-coltura con neutrofili a bassa densità ha indotto una riduzione evidente delle cellule positive per CD8, un effetto che non è stato osservato in presenza di neutrofili ad alta densità. L'estensione del mantenimento del CFSE è stata inoltre valutata come indicatore di proliferazione.Si noti lo spostamento verso sinistra nella popolazione cellulare trattata con anti-CD3 e nelle cellule trattate con anti-CD3 coltivate in presenza di neutrofili ad alta densità, che in entrambi i casi dimostrano un aumento della proliferazione delle cellule CD8 positive. Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la misurazione dei burst ossidativi, della fagocitosi o della migrazione, per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio: come viene influenzata la funzione dei neutrofili in diversi scenari patologici?

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

In questo rapporto, descriviamo un protocollo per isolare popolazioni altamente purificate di leucociti che infiltrano i tumori. Questo protocollo è stato adattato dal Miltenyi Biotech protocollo per migliorare la resa e la purezza per isolare cellule dal tessuto tumorale complessa.

Isolamento di cellule immunitarie di tumori primari

In questo video, dimostriamo l'isolamento di neutrofili citotossici ad alta densità e neutrofili a bassa densità dal sangue di un topo portatore di tumore mediante centrifugazione discontinua in gradiente di saccarosio.

Isolamento di neutrofili citotossici dal sangue di topo portatore di tumore

Questo video dimostra un test per generare neutrofili associati al tumore (TAN) anti-angiogenici. Dopo l'assunzione di un tumore di melanoma murino contenente TAN pro-angiogenici, le singole cellule vengono isolate utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) e trattate con un inibitore della nicotinammide fosforibosiltransferasi (NAMPT) per ridurre la capacità di stimolare l'angiogenesi.

Generazione di neutrofili anti-angiogenici associati al tumore

I neutrofili sono il tipo più abbondante di globuli bianchi. L'isolamento dei neutrofili dal sangue umano mediante il metodo di separazione del gradiente di densità e la differenziazione delle cellule promielocitiche umane (HL60) lungo la via granulocitaria sono descritti qui; testare il loro ruolo sulla sensibilità delle cellule di linfoma agli agenti anti-linfoma.

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Nuovi protocolli sono descritti qui per isolare e caratterizzare microparticelle derivate dall'essere umano e del mouse neutrofili. Questi protocolli utilizzano ultracentrifugazione, citometria a flusso e tecniche di immunoblotting per analizzare il contenuto di microparticelle, e sono utilizzabili per studiare il ruolo delle microparticelle derivate da vari tipi di cellule nella funzione cellulare.

Isolamento e caratterizzazione delle microparticelle neutrofilo per studi funzionali

Qui descriviamo un metodo per separare e arricchire i componenti del microambiente tumorale immuni e non immuni in tumori sottocutanei stabiliti. Questa tecnica permette l'analisi separata di tumore immuni si infiltra in e frazioni non immune tumore che possono consentire la caratterizzazione completa del microambiente tumorale immuni.

Arricchimento e caratterizzazione dei tumore immuni e Non immuni microambienti in tumori murini sottocutanei stabiliti

Qui, presentiamo un metodo in cui i neutrofili a bassa densità umani (LDN), recuperati dal liquido di lavaggio peritoneale postoperatoria, producono massicce trappole extracellulari del neutrofilo (reti) e intrappolano efficientemente le cellule del tumore libero che successivamente crescono.

Trappole extracellulari del neutrofilo generati dai neutrofili bassa densità ottenuta dal liquido di lavaggio peritoneale mediata allegato e crescita delle cellule tumorali

Qui, mostriamo il potenziale terapeutico dei neutrofili anti-angiogenici associati al tumore dopo il loro trasferimento in topi portatori di tumore. Questo protocollo può essere utilizzato per manipolare l'attività dei neutrofili ex vivo e successivamente valutare la loro funzionalità in vivo nello sviluppo di tumori. È un modello appropriato per studiare potenziali immunoterapie a base di neutrofili.

Trasferimento di neutrofili associati al tumore manipolati in topi che portano il tumore per studiare il loro potenziale angiogenico In Vivo

Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento dei neutrofili dal sangue intero, dai cappotti buffy o dalle membrane di leucaferesi, ottenendo una buona resa, un'elevata purezza e un'attivazione cellulare minima. Utilizziamo la purificazione a gradiente, la sedimentazione dei globuli rossi (RBC) e la lisi dei globuli rossi per ottenere una preparazione neutrofila di alta qualità / purezza.

Isolamento dei neutrofili umani da Whole Blood e Buffy Coats

Questo protocollo definito descrive un approccio di microscopia ad alto rendimento in tempo reale per visualizzare e quantificare il rilascio di trappole extracellulari (NET) di neutrofili umani in vitro. Il metodo riproducibile consente di studiare le caratteristiche e la cinetica del rilascio di NET dopo stimolazione con induttori distinti di NETosi e consente di valutare la farmacologia degli antagonisti di NETosi.

Quantificazione microscopica in tempo reale e ad alto rendimento del rilascio di trappole extracellulari di neutrofili umani e valutazione della farmacologia degli antagonisti

In questo caso, forniamo un approccio affidabile per isolare neutrofili a bassa e normale densità dal sangue intero utilizzando l'isolamento magnetico (selezione negativa) e il mezzo a gradiente di densità discontinuo. Garantisce l'isolamento intatto di cellule ad alta purezza (≥93%), facilitando un'analisi accurata a valle delle sottopopolazioni di neutrofili, fondamentale per comprendere il loro ruolo nella salute e nella malattia.

L'isolamento e la caratterizzazione di neutrofili a bassa e normale densità da sangue intero

Scopri come isolare neutrofili con proprietà antitumorali mediante gradiente di densità e co-cultura con cellule tumorali marcate con luciferasi. Questo metodo consente di valutare la citotossicità senza radioattività.

Isolamento e caratterizzazione di neutrofili con proprietà antitumorali

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