Registrazione potenziale evocato visivo in un modello murino di sperimentale del nervo ottico demielinizzazione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è monitorare la demielinizzazione del nervo ottico in vivo. Questo risultato si ottiene innanzitutto impiantando microelettrodi sulla corteccia visiva. In un secondo passaggio, la lina viene microiniettata nel nervo ottico, inducendo una lesione focale di demielinizzazione.

Successivamente, è possibile effettuare registrazioni dei potenziali evocati visivi. Infine, l'analisi di regressione mostra una forte correlazione lineare tra il ritardo della latenza del potenziale evocato visivo e il volume. Questo video illustrerà la nostra tecnica per la registrazione dei potenziali evocati visivi nei ratti.

Utilizzando elettrodi impiantati nel cranio, mostreremo anche una tecnica di demielinizzazione focale del nervo ottico mediante una tecnica di microiniezione. Tutti gli esperimenti vengono condotti presso il nostro laboratorio della Facoltà di Medicina della Macquarie University. La tecnica sarà dimostrata da Nitin Chichi, nostro studente di dottorato. Per iniziare, anestetizzare un ratto adulto di età superiore a 12 settimane mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina prima di iniziare l'intervento chirurgico.

Verificare l'assenza di riflessi di ritrazione. Essere pronti ad amministrare dosi del 10% di chetamina secondo necessità per gestire eventuali riflessi che dovessero ripresentarsi nell'animale durante l'intervento chirurgico. Successivamente, rasare la cute nell'area chirurgica e quindi posizionare l'animale su un tappetino riscaldante per completare le preparazioni.

Scrubbing della cute con iodopovidone, drappeggiare l'animale e applicare un unguento oftalmico. Inoltre, assicurarsi di mantenere l'asepsi utilizzando strumenti sterili. Per iniziare l'intervento chirurgico, effettuare un'incisione cutanea longitudinale lungo la linea mediana della testa.

Quindi rimuovere il tessuto connettivo per ottenere una buona esposizione del cranio. Successivamente, utilizzando un trapano manuale microscopico, praticare con attenzione piccoli fori di trapanazione, sette millimetri al di dietro del bgma e tre millimetri laterali rispetto alla linea mediana. Implantare elettrodi a vite attraverso il cranio e per circa 0,5 millimetri nella corteccia.

Quindi impiantare un elettrodo a vite di riferimento sulla linea mediana, tre millimetri in senso rostrale rispetto al bgma secondo necessità. Applicare del cemento dentale per incapsulare e fissare le viti elettrode. Infine, suturare la pelle.

Gli elettrodi possono essere lasciati esposti in modo che la pelle non debba essere riaperta per ogni registrazione. Ora, somministrare rapidamente un farmaco antinfiammatorio non steroideo o FANS, oppure un analgesico oppioide, prima che l'animale riprenda conoscenza dall'anestesia. Per concludere, trattare la pelle con un unguento antibiotico.

Posizionare l'animale in una gabbia di recupero con un tappetino riscaldante e monitorarlo costantemente finché non sarà completamente deambulante. Successivamente, permettergli di riprendersi per almeno una settimana. Prima di effettuare le registrazioni di PVE, preparare l'animale per l'intervento chirurgico come descritto in precedenza ed eseguire un'incisione cutanea lunga da uno a 1,5 centimetri sopra l'orbita dell'occhio, utilizzando pinzette da iride fini.

Aprire il tessuto sottocutaneo ed accedere alla cavità orbitaria. Quindi, sotto uno stereomicroscopio, aprire la capsula dei tendini anteriori e la congiuntiva. Successivamente, retrarre i muscoli estrinseci dell'occhio e le ghiandole lacrimali intraorbitali.

Per esporre circa tre millimetri del nervo ottico intorno al nervo ottico, utilizzare una lama oftalmica per aprire longitudinalmente i foglietti della dura madre e della sostanza aracnoidea. Quindi inserire una micropipetta di vetro collegata a una siringa Hamilton nel nervo, due millimetri a valle del bulbo oculare. Per un periodo di 30 secondi, iniettare una bolla di lisina con colorante per completare la procedura.

Suture l'incisione cutanea. Applicare un unguento antibiotico per prevenire infezioni. Spostare l'animale su un tappetino riscaldante e monitorarlo fino al completo recupero.

Dopo aver anestetizzato l'animale e preparato la cute come in precedenza, trasferirlo in una stanza buia. Mantenere la temperatura corporea entro mezzo grado rispetto ai 37 gradi Celsius, utilizzando un sistema di coperta termica e una sonda di temperatura, mentre si effettua il monitoraggio al buio. Adattare l'animale per cinque-trenta minuti.

Dopo mezz'ora, dilatare le pupille con colliri oftalmici al 1% di tropicamide. Quindi, utilizzando forbici e pinze, aprire la cute sopra il cranio e accedere ai due elettrodi a vite NC precedentemente posizionati.

Collegare le viti al misuratore di impedenza. Quindi misurare e mantenere l'impedenza dell'elettrodo al di sotto di cinque kilo ohm. Collegare ora la vite sopra la corteccia visiva controlaterale dell'occhio stimolato.

Successivamente, inserire un elettrodo a ago nella coda per ottenere il contatto di massa. Posizionare ora un mini stimolatore ganzfeld calibrato sulla pelle intorno alle palpebre per migliorare l'isolamento oculare. Quindi applicare una stimolazione fotica utilizzando 100 lampi a un hertz con filtro passa-basso a un hertz e il filtro passa-banda alto.

Filtrare a 100 hertz. Al termine, suturare la pelle e mantenere l'animale su un tappetino riscaldante per favorirne il risveglio dall'anestesia. Sono possibili registrazioni ripetute, da alcune ogni settimane a una ogni poche settimane.

Con l'intercessione, i tracciati VEP mostrano un ritardo significativo nella latenza di N uno. Dopo l'iniezione nel nervo ottico, le registrazioni sono state effettuate giornalmente per dimostrarne la riproducibilità. Lesioni parziali del nervo ottico con demielinizzazione sono state osservate in sezioni di tessuto colorate con blu lussino rapido.

Dopo la misurazione del volume della lesione, è divenuta evidente una correlazione tra il ritardo di latenza e l'estensione della lesione. Questa tecnica può essere utilizzata per indurre lesioni nel nervo ottico e per correlare tali lesioni con modifiche nel potenziale visivo (VP); può essere impiegata come modello di demielinizzazione focale. Poiché l'estensione delle lesioni indotte è piuttosto variabile, è importante confermare le modifiche mediante analisi istologica.