Name: Istituzione di un segmentale femorale critico-size difetto del modello in topi stabilizzati da osteosintesi Piastra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Impara a creare un difetto osseo critico femorale in topi stabilizzato con osteosintesi a placca. Questo metodo riproducibile facilita la ricerca nell'ingegneria tissutale ossea e nelle applicazioni ortopediche.

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Gli autori desiderano ringraziare Rena Bizios per i suoi preziosi commenti sul manoscritto.

Etica Dichiarazione: I topi utilizzati nel presente studio sono stati trattati in conformità con le linee guida pubblicate dal Comitato europeo per la &quot;cura e l&#39;uso di animali da laboratorio&quot; (Direttiva 2010/63 / UE e la Convenzione europea ETS 123). Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato Etico della Facoltà di Medicina Lariboisière Saint-Louis (CEEA LV / 2010-01-04). 1. Gli animali <ol><li> Utilizzare topi atimici (10 settimane). Utilizzare un numero minimo di 6 topi con difetti lasciati vuoti come gruppo di controllo negativo. </li></ol> 2. Preparazione Ponteggi <ol><li> Singenici Graft Preparazione <ol><li> Utilizzare isograft osso per riempire il difetto di fornire gruppo di controllo con un numero minimo di 6 animali. </li><li> Ottenere isografts osso di raccolta escisse osso femorale da topo appartenenti a una &quot;difetti lasciati vuoti o&quot; difetti pieni di corallo impalcatura &quot;gruppi (THè evita l&#39;uso di animali in più per raccogliere isograft osso) 11. </li><li> Lavare l&#39;osso resecato con tampone fosfato (PBS) e mantenerlo sterile umida impacco di garza. </li></ol></li><li> Coral Ponteggio Preparazione <ol><li> Utilizzare impalcatura che sono fatti di corallo naturale: Acropora sp. cubi esoscheletro corallo, 3 x 3 x 3 mm, come potenziale sostituto osseo con un minimo di 6 animali. </li><li> Intagli a mano ogni cubo corallo alla forma del cilindro (3,5 altezza; diametro di 2 mm). </li><li> Sterilizzare ogni scaffold in autoclave (121 ° C per 20 min), lavare con PBS sterile, e immerso in mezzo di coltura completo (α-MEM) per 24 ore prima dell&#39;impianto in topi. </li></ol></li></ol> 3. procedure di anestesia e l&#39;analgesia <ol><li> Fornire analgesia preventiva, 15 min prima dell&#39;anestesia, per iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,1 mg / kg di peso corporeo dell&#39;animale). </li><li> Applicare una pomata nell&#39;animaleocchi per prevenire la secchezza ogni 30 minuti mentre gli animali sono sotto anestesia. </li><li> Mettere i topi su un blocco di riscaldamento per evitare l&#39;ipotermia. </li><li> Anestesia e Analgesia durante la procedura chirurgica <ol><li> Iniettare intraperitoneale una soluzione contenente xilazina (8 mg / kg) e ketamina (100 mg / kg). </li><li> Fornire ossigeno mediante flusso-by (50 ml / min). </li><li> Conferma adeguata profondità dell&#39;anestesia dalla presenza di buon rilassamento muscolare e mancanza di risposta animale ad uno stimolo nocivo (ad es., Società punta pinch). </li><li> Iniettare per via sottocutanea di una singola dose dell&#39;enrofloxacina (0,05 mg / kg) come profilassi microbici. </li></ol></li><li> Analgesia post-operatoria <ol><li> Fornire postoperatoria mediante iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,1 mg / kg) ogni 12 ore per 3 giorni consecutivi. </li></ol></li><li> Anestesia durante le procedure diagnostiche per immagini <ol><li> Mettere i topi in un anesthetizing-box, e quindi indurre e mantenere l&#39;anestesia con circa il 4% e il 2% isoflurano in ossigeno, rispettivamente. </li><li> Conferma un&#39;adeguata profondità dell&#39;anestesia dalla buona rilassamento muscolare animale e la mancanza di movimento. </li></ol></li><li> Condizioni di recupero <ol><li> Mantenere i topi sul pad riscaldamento fino al completo recupero </li><li> Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale dopo l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. </li></ol></li><li> Condizioni post-operatorie <ol><li> Ospitare i topi separatamente durante i primi 3 giorni ospiterà i topi da 4 nelle gabbie dopo giorno 3. </li><li> Fornire acqua e adattato libitum cibo annuncio. Lasciare i topi di peso-orso, senza alcuna restrizione di attività per tutto il periodo post-operatorio. </li></ol></li></ol> 4. Procedura chirurgica:Femorale segmentale Defect Modello 11,12 <ol><li> Dopo l&#39;anestesia, inserire ogni mouse in decubito ventrale con l&#39;arto posteriore sinistra in estensione. </li><li> Scrub l&#39;arto per la chirurgia asettica utilizzando 10% di povidone iodio per 5 minuti e poi posizionare una garza sterile sotto l&#39;arto per creare una superficie sterile (un telo trasparente sterile è utilizzato per essere in grado di monitorare il movimento respiratorio durante la procedura). Si ha cura di mantenere la sterilità del campo operatorio durante la procedura. </li><li> Fare un 15 - 17 mm incisione cutanea longitudinale sulla faccia antero-laterale del femore, che si estende dal anca al giunto ginocchio. </li><li> Incidere la fascia lata, dividere il muscolo vasto laterale e muscolo bicipite femorale per esporre l&#39;intera lunghezza della diafisi femorale. Si deve usare cautela per preservare il nervo sciatico caudalmente e la capsula articolare distale (Figura 1). </li><li> Per migliorare femorale expo diafisicerto, transetto il muscolo gluteo e bicipite femorale dal 3 trocantere. </li><li> Effettuare una dissezione circolare del femore al centro della diafisi. </li><li> Applicare una titanio piastra di micro-bloccaggio a 6 buche (10 mm di lunghezza; 1,5 mm di larghezza, peso: 30 mg) sul lato femorale anteriore. NOTA: I fori della piastra, che sono conicamente incassati con una porzione cilindrica, ospitare titanio autofilettanti viti di bloccaggio (lungo 2 mm, diametro esterno 0,47 millimetri, peso: 5 mg, con superficie inferiore della vite a testa filettata per consentire il bloccaggio entro il foro della placca) che sono collegati ad uno stelo, che torce quando bloccato. </li><li> Eseguire il foro più prossimale della piastra con una punta 0,3 mm e sia la potenza del motore dedicato o potenza motrice non dedicata funzionare a 2,500 rpm a circa 500 mW 12). </li><li> Inserire la prima vite con un cacciavite dedicato e quindi bloccarla (Figura 2). NOTA: Dato che l&#39;allineamento di tegli piastra è calcolato applicando questa prima vite, è importante posizionare la piastra parallela al femore durante l&#39;inserimento della vite. </li><li> Eseguire il foro più distale della piastra in modo simile, inserire e bloccare la vite (Figura 3). </li><li> Inserire, ma non fare blocco, le altre due viti esterne. </li><li> Posizionare il filo di 0,22 millimetri Gigli vide strettamente attorno all&#39;osso in un orientamento medio-laterale e quindi inserire nelle asole della dima (Figura 4). </li><li> Inserire la dima dedicato sul gambo delle ultime due viti e applicarlo sopra la piastra (Figura 5). </li><li> Eseguire un ostectomia femorale lunga 3,5 mm metà diafisario utilizzando il Gigli ha visto sotto irrigazione (mediante soluzione isotonica salina sterile) per evitare necrosi termica. Hanno l&#39;assistente del chirurgo prendere la maschera. Avere il chirurgo applica una tensione costante costante. Fare attenzione a non groviglio il filo sega e di utilizzare al centro due terzi del filo. Evitare exmovimento processo per ottenere un taglio dritto osso (Figura 6). </li><li> Dopo la ostectomia, rimuovere la Gigli ha visto. Per evitare danni dei tessuti molli, tagliare la sega a filo vicino al osso da un lato. </li><li> Rimuovere la dima e bloccare le ultime due viti (Figura 7). </li><li> O lasciare il difetto segmentale vuoto o chirurgicamente riempirlo mettendo materiali da testare all&#39;interno del difetto. </li><li> Abbondantemente risciacquare il campo chirurgico con soluzione isotonica salina sterile. </li><li> Posizionare il muscolo vasto laterale liberamente sopra la piastra. Chiudere la fascia e piani sottocutanei utilizzando un semplice modello di sutura continua e 5,0 glycomer 631 sutura; chiudere la pelle con un semplice modello di sutura interrotta usando 4.0 glycomer 631 sutura. In alternativa, è anche possibile chiudere la pelle con colla di pelle. </li></ol> 5. In Vivo valutazioni di rigenerazione ossea <ol><li> Con i topi sotto anestesia, eseguire radiograficovalutazioni in maniera longitudinale, utilizzando sia i raggi X convenzionali (26 kV, 10 sec; 2X ingrandimento; 20 linee / mm risoluzione spaziale) e ad alta risoluzione di micro-tomografia computerizzata (μCT). </li><li> Per l&#39;analisi μCT, acquisire immagini con una risoluzione di 36 micron (50 kV e 478 mA, a 40 msec tempo di esposizione, utilizzando una di filtro 0,5 millimetri di alluminio, fase di rotazione di 0,7 °, e la rotazione tomografica di 180 °). Analizzare le immagini utilizzando il software residente. </li></ol> 6. Le valutazioni ex vivo di rigenerazione ossea <ol><li> Dieci settimane dopo l&#39;intervento, indurre l&#39;anestesia con isoflurano in ossigeno, e quindi sacrificare i topi mediante iniezione intraperitoneale di una dose eccessiva di barbiturici (1 ml di pentobarbital). </li><li> Asportare le ossa femorali, rimuovere la sovrapposizione tessuto muscolare, e fissare i campioni di ossa in paraformaldeide al 4% (pH 7,4) per quattro giorni. </li><li> Rimuovere la placca e le viti da ogni campione di osso asportati dopo paraformaldeide FIXAzione. </li><li> Ex Vivo μ Analisi CT <ol><li> Mettere ogni osso asportato e fissati in tubi di polietilene riempito con il 75% di alcol e analizzarli utilizzando ex vivo μCT. </li><li> Acquisire le immagini a 80 kV e 100 mA (tempo di esposizione di 1.000 msec, alluminio 0,5 filtro e 4 micron dimensione del pixel fotocamera (2.400 x 4.000 con una dimensione voxel di 7 micron), media quattro fotogrammi per ogni incremento di rotazione di 0,9 °. </li><li> Ricostruire le immagini in 3 dimensioni (dimensione media voxel di 13 micron) con un back-proiezione Hamming-filtrata con il software residente. </li><li> Per l&#39;analisi quantitativa della formazione ossea, utilizzare software residente per ottenere il volume di tessuto mineralizzato (soglia inferiore grigia 45 indici scala di grigi e la soglia grigio superiore 240 indici scala di grigi) in una regione determinata e coerente di interesse corrispondente al difetto. </li><li> Eseguire analisi nello stesso modo per ogni mouse con la stessa regione di interesse. </li><li> Utilizzare il test unidirezionale analisi (intervallo di confidenza - al 95% e il livello significativo con p &lt;0,05) per confrontare il tasso unione ossea e il volume di tessuto mineralizzato nella regione di interesse tra i gruppi. </li></ol></li><li> analisi istologica <ol><li> Incorpora ogni asportato e fissato osso femorale in resina di metacrilato di metile e di processo per l&#39;istologia undecalcified. </li><li> Tagliare ciascun campione osso longitudinalmente in sezione di spessore (200 micron) con un raffreddamento ad acqua sega circolare diamantata. </li><li> Macinare ogni sezione campione osseo fino a uno spessore di 100 micron, lucidare e macchiare utilizzando Stevenel macchie blu e van Gieson picrofuchsin. NOTA: Dopo la colorazione, le cellule appaiono in blu, osso in rosa, e corallo in marrone al microscopio ottico. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Impiantazione ectopica di materiali e dispositivi in topi ortopedici specifici è comunemente eseguita per valutare l&#39;osso formando funzioni di vari ponteggi 13,14. tuttavia esistono importanti differenze tra i modelli ectopiche e ortotopico, compresi i fattori di segnalazione osteogenic nativi e le interazioni con le cellule paracrini che formano l&#39;osso ospite. Il presente studio stabilisce un riproducibile grande segmentale murino, critico-size difetti femorale (3,5 mm, circa il 20-25% della lunghezza del femore). Considerando le dimensioni di tale difetto e la stabilità fornita dalla osteosintesi piatto risultante, questo modello imita l&#39;osso atrofica non-union clinicamente incontrato. Il periodo di tempo post-operatorio scelto nel presente studio, è in linea con i topi modelli non sindacali precedentemente descritti, mostrando una mancanza di un&#39;adeguata guarigione dopo 8 a 12 settimane 4,9,15,16. Ancora più importante, reproducible e stabile osteosintesi, nonché stabilità dei sostituti ossei impiantati sono stati ottenuti senza morbilità e mortalità 1,2 con l&#39;uso di entrambe piastra di bloccaggio e una maschera per eseguire l&#39;osteotomia. Questo risultato contrasta anche i risultati riportati in cui sia un fissatore esterno o un chiodo endomidollare sono stati utilizzati 4,5,17-24. Per i fissatori esterni potenziali svantaggi includono: variabilità in rigidità, infezioni delle vie perni, allentando i perni, potenziali lesioni dovute ai perni e il peso dei materiali (da 4 a 20% del peso corporeo del mouse). Per il chiodo endomidollare potenziali svantaggi includono: riempimento della cavità midollare con il chiodo e danni iatrogeni delle superfici articolari. Altri murino segmentale, critica size difetti femorali stabilizzate mediante piastra osteosintesi sono state descritte con difetto osseo creato da una fresa e da 1,5 a 2 mm di lunghezza 16,25. in the presente modello, l&#39;uso di una maschera e un filo sega permesso una precisa osteotomia 3,5 millimetri a lungo senza muscoli significativi traumi. Tuttavia, per riuscire a eseguire la procedura si dovrebbe prendere in considerazione alcuni punti chiave: non utilizzare piccolo topo (topi nudi o con un peso di meno di 25 grammi o di età inferiore a 8 settimane) altrimenti il ​​piatto dovrebbe essere troppo lungo. Quando si avvicina l&#39;osso femorale, fare attenzione a preservare sia il nervo sciatico caudalmente e la capsula articolare distale. Applicare la piastra sul lato anteriore dell&#39;osso femorale e poiché l&#39;allineamento della piastra è calcolato applicando questa prima vite, avere cura di posizionare la piastra parallela al femore durante l&#39;inserimento questa prima vite. Prima di effettuare il ostectomia, aver cura di effettuare una dissezione circolare del femore al centro della diafisi per evitare traumi muscolari. Quando si esegue l&#39;osteotomia, l&#39;assistente del chirurgo deve tenere saldamente la guida e il surgeon deve essere attento (i) non aggrovigliare il filo sega, (ii) utilizzare mezzo due terzi del filo durante l&#39;applicazione di una tensione costante costante, e (iii) per evitare il movimento in eccesso per ottenere un taglio dritto osso. guarigione ossea è possibile nella presente modello fornito un innesto osseo viene utilizzato. Inoltre, questo modello consente ulteriori studi dei meccanismi coinvolti nelle strategie di sostituzione delle ossa quando sia innesti o cellule umane di origine vengono utilizzati in un ben standardizzata grande, segmentale, difetti, osso. Inoltre, in linea alle tendenze attuali che richiedono la raffinatezza e la riduzione di utilizzo di animali nella ricerca ortopedia legati, questo modello può essere utilizzato in combinazione con in vivo tecniche di imaging come la bioluminescenza. Tali tecniche non invasive permettono di monitorare sia la sopravvivenza delle cellule impiantate e la guarigione dei tessuti senza richiedere il sacrificio di animali 26. Le principali limitazioni del presente modello sono sia lacondizioni portanti e il volume del difetto osseo creato perché non imitano completamente quelli incontrati clinicamente nell&#39;uomo. Le limitazioni del modello sono (i) la radio-opacità del piatto che può richiedere la rimozione della piastra prima ex vivo μCT analisi e possono complicare l&#39;interpretazione dei longitudinali risultati degli esami radiografici e, (ii) l&#39;impossibilità di modulare piastra rigidezza può essere un parametro chiave meccanica nella formazione dell&#39;osso 27-30. Si deve tenere a mente anche, quando si utilizza isograft osso o altre impalcature che contengono una componente minerale (in particolare carbonato di calcio), che alcuni pregiudizi vengono introdotti nel processo di segmentazione delle analisi micro-CT, perché la densità ossea di nuova costituzione in parte sovrapposto con sia la densità isograft o densità patibolo. Per questo motivo il volume osseo ottenere dall&#39;analisi micro-CT sono relativi principalmente il volume del tessuto mineralizzato (osso neoformato piùsostituto osseo) 11,26,31.

Massive difetti ossei diafisarie sono una grande sfida per il chirurgo ortopedico. la sostituzione ossea con innesto osseo autologo, attualmente considerato come il trattamento gold-standard, è in quantità limitata ed è associata a morbidità raccolta legate. Per queste ragioni, costrutti osso tissutale, che conciliano cellule staminali mesenchimali del midollo osseo con ponteggi osteoconduttive sono stati esplorati come alternativa per autotrapianti in chirurgia ortopedica. Fino ad oggi, la maggior parte degli studi sono stati condotti in modelli animali clinicamente rilevanti, quali cani, maiali e pecore 1-3, ma la valutazione preliminare di questi costrutti in ortotopico, segmentale, difetti ossei critico-size in modelli animali di piccola (come topi) potrebbe avere diversi vantaggi: (i) le spese basse, (ii) un gran numero di animali possono essere azionati; (Iii) in contrasto con grandi modelli animali, omogeneità dei ceppi di topi limita variazioni individuali scaffold riassorbimento unND formazione ossea e; (Iv) soprattutto, la disponibilità di anticorpi specifici e animali gene targeting consentono la valutazione del processo biologico coinvolto nella guarigione ossea. Ultimo ma non meno importante, l&#39;uso di ceppi di topi immunodeficienti consente anche studi usando sia innesti o cellule di origine umana senza risposte immunitarie avverse nei topi. Nonostante i vantaggi di cui sopra, enormi modelli difetto osseo diafisarie nei topi sono scarsi. La maggior parte di tali modelli utilizzano fissaggio osseo con un perno intramidollare che riempie la cavità del midollo osseo (limitando così il volume di materiale da testare) e ostacola anche la riproducibilità non fornendo rotazione ed assiale stabilità 2,4-7. Gli obiettivi di questo studio sono: (i) simulando una situazione di non-union ossa clinica, per descrivere un riproducibili, critica-size, segmentale, modello di difetto femorale in topi, che è stabilizzata da accurate e riproducibili osteosynth bloccaggio a lamelleESIS che fornisce un ambiente biomeccanico altamente stabile 8-10; (Ii) illustrare il modello presente con due potenziali sostituti ossei e descrivere analisi formazione ossea che potrebbe essere utilizzato.

<table><tbody><tr><td>&alpha;-MEM , Minimo Essenziale Medio Eagle</td><td>Sigma-Aldrich, Francia</td><td>M4526</td><td>500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Acropora sp. cubi di esoscheletro di corallo, Biocoral&reg;</td><td>Biocoral&reg;, Inoteb, Francia</td><td></td><td>cubi 3 x 3 x 3 mm, autoclave (121 &deg; C per 20 min) sterilizzazione</td></tr><tr><td>Buprenorfina, Buprecare&reg;</td><td>Axience, Pantin, Francia</td><td></td><td>0,3 mg/ml</td></tr><tr><td>Xilazina, Rompun&reg; 2%</td><td>Bayer HealthCare, Puteaux, Francia</td><td>20 mg/ml</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina, Ketamina 500&reg;</td><td>Virbac, Carros, Francia</td><td></td><td>50 mg/ml</td></tr><tr><td>Isoflurano, For' egrave; ne&reg;</td><td>Abbott, Arcueil, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacine, Baytril&reg; 5%</td><td>Bayer HealthCare, Puteaux, Francia</td><td>50 mg/ml</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital, Dolethal&reg;</td><td>V&eacute; toquinol, Lure, Francia</td><td></td><td>182,2 mg/ml</td></tr><tr><td>Scatola per anestesia</td><td>Ugo Basile, Gemonio, Italia</td><td>7900/10</td><td></td></tr><tr><td>Telo sterile in plastica trasparente, BusterOpCover 30 x 45 cm</td><td>Buster, Coveto, Montagu, Francia</td><td>613867</td><td></td></tr><tr><td>10% iodio povidone, V&eacute; t&eacute; cena&reg; Soluzione</td><td>V&eacute; toquinol, Lure, Francia</td><td></td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Piastra di microbloccaggio in titanio, MouseFix Plate XL</td><td>RISystem AG, Davos, Svizzera, http://www.risystem.com/</td> <td>RIS.401.120</td><td>6 fori, 10 mm di lunghezza e 1,5 mm di larghezza, sterilizzazione in autoclave (121 &deg; C per 20 min) sterilizzazione o sterilizzazione a freddo (ossido di etilene)</td></tr> <tr><td>Punta da 0,3 mm, Punta da trapano 0,30 mm</td><td>RISystem AG, Davos, Svizzera, http://www.risystem.com/</td> <td>RIS.592.200</td><td>in autoclave (121 &deg; C per 20 min) sterilizzazione o sterilizzazione a freddo (ossido di etilene)</td></tr><tr><td>Potenza del motore</td><td>RISystem AG, Davos, Svizzera, http://www.risystem.com/</td> <td>AccuPen</td><td>Sterilizzazione a freddo (ossido di etilene)</td></tr><tr><td>Cacciavite, Handrill</td><td>RISystem AG, Davos, Svizzera, http://www.risystem.com/</td> <td>RIS.390.130</td><td>autoclave (121 &deg; C per 20 min) sterilizzazione o sterilizzazione a freddo (ossido di etilene)</td></tr><tr><td>Viti di bloccaggio autofilettanti, MouseFix Screw 2 mm</td><td>RISystem AG, Davos, Svizzera, http://www.risystem.com/</td> <td>RIS.401.100</td><td>2 mm di lunghezza, 0,47 mm di diametro esterno e 0,34 mm di diametro del nucleo, sterilizzazione in autoclave (121 °; C per 20 min) sterilizzazione o sterilizzazione a freddo (ossido di etilene)</td></tr><tr><td>Jig, MouseFix XL Guida per trapano e sega</td><td>RISystem AG, Davos, Svizzera, http://www.risystem.com/</td> <td>RIS.301.103</td><td>3,5 mm tra le fessure, sterilizzazione in autoclave (121 &deg; C per 20 min) sterilizzazione o sterilizzazione a freddo (ossido di etilene)</td></tr><tr><td>Seghe Gigli da 0,22 mm (seghe da 0,22 mm)</td><td>RISystem AG, Davos, Svizzera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5,0 glicomero 631, Biosyn</td><td>Covidien, V&eacute; toquinolo, esca, Francia</td><td></td><td>Ago taglio a spillo</td></tr><tr><td>4.0 glicomero 631, Biosyn</td><td>Covidien, V&eacute; toquinol, Lure, France</td><td></td><td>Tapper-cut needle</td></tr><tr><td>X-ray, MX20</td><td>Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>In vivo tomografia microcomputerizzata ad alta risoluzione, Skyscan 1176</td><td>Skyscan, Aartselaar, Belgio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ex vivo tomografia microcomputerizzata ad alta risoluzione, Skyscan 1172</td><td>Skyscan, Aartselaar, Belgio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software residente: Nrecon (v1.6.9) / Ctan (v.1.14.4)</td><td>Skyscan, Aartselaar, Belgio</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

istituzione di un segmentale femorale critico-size difetto del modello in topi stabilizzati da osteosintesi piastra

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

L'uso di costrutti ossei di ingegneria tissutale è una strategia interessante per superare gli inconvenienti degli autotrapianti per il trattamento di difetti ossei massicci. Come organismo modello, il topo è già stato ampiamente utilizzato nella ricerca sulle ossa. I modelli di difetti ossei diafisari di grandi dimensioni nei topi, tuttavia, sono scarsi e spesso utilizzano la fissazione ossea che riempie la cavità del midollo osseo e non fornisce una stabilità meccanica ottimale. Gli obiettivi del presente studio erano di sviluppare un difetto femorale segmentale di dimensioni critiche nei topi nudi. Un'ostectomia femorale diafisaria media di 3,5 mm (circa il 25% della lunghezza del femore) è stata eseguita utilizzando una maschera dedicata ed è stata stabilizzata con una piastra di bloccaggio posizionata anteriormente e 4 viti di bloccaggio. Il difetto osseo è stato successivamente lasciato vuoto o riempito con un sostituto osseo (innesto osseo singenico o scaffold corallino). La guarigione ossea è stata monitorata in modo non invasivo mediante radiografia e microtomografia computerizzata in vivo ed è stata successivamente valutata mediante microtomografia computerizzata ex vivo e istologia non decalcificata dopo il sacrificio animale, 10 settimane dopo l'intervento. Il recupero di tutti i topi è stato eccellente, è stato osservato un pieno carico entro un giorno dalla procedura chirurgica. Inoltre, in tutti gli animali testati durante lo studio, è stata raggiunta una fissazione ossea stabile e una fissazione coerente dei materiali impiantati. Quando i difetti ossei sono stati lasciati vuoti, la non unione è stata costantemente ottenuta. Al contrario, quando i difetti ossei sono stati riempiti con innesti ossei singenici, è stata sempre osservata l'unione ossea. Quando i difetti ossei sono stati riempiti con scaffold corallina, è stato osservato osso di nuova formazione nell'interfaccia tra i bordi di resezione ossea e lo scaffold, nonché entro una breve distanza all'interno dello scaffold. 
Il presente modello descrive un difetto femorale riproducibile di dimensioni critiche stabilizzato dall'osteosintesi di placche con bassa morbilità nei topi. Il nuovo modello di difetto osseo segmentale portante potrebbe essere utile per studiare i meccanismi sottostanti alla rigenerazione ossea pertinenti alle applicazioni ortopediche.

Le suddette procedure chirurgiche durate dal 45 a 60 min. Ostectomia e osteosintesi erano facili da eseguire con l&#39;aiuto di assistente di un chirurgo ma senza usare alcun sistema di ingrandimento. Non si sono verificate complicanze intraoperatorie. In uno studio preliminare su 18 topi 11, radiografie postoperatorie fornito prove che la lunghezza difetto osseo (3,43 ± 0,12 millimetri) e il posizionamento piastra (distanza tra la cavità articolare soffocare e la parte distale della piastra = 2,65 ± 0,56 millimetri) erano riproducibili. Il tasso di mortalità correlata all&#39;anestesia era di circa il 5%. Il recupero funzionale dell&#39;arto operato era eccellente in tutti gli animali e pieno portante è stata osservata entro un giorno dopo l&#39;intervento chirurgico (Animated Figura 1). Il peso del osteosintesi (placca e viti) utilizzato nella pstudio resent era circa 0,1% del peso corporeo mouse. Non ci sono complicanze postoperatorie (ad esempio, infezione della ferita, fallimento dell&#39;impianto, migrazione innesto osseo, ecc) si sono verificati. No autolesionismo o lesioni causate da cagemates si è verificato. Quando i difetti ossei chirurgicamente indotte sono stati lasciati vuoti, senza significativa formazione ossea è stata osservata con l&#39;osso coerente non-union. Al contrario, quando i difetti sono stati riempiti sia con un isograft o uno scaffold di corallo, osso neoformato estende dal bordo prossimale e distale dell&#39;osso è stato osservato. Inoltre, considerando che la formazione ossea permesso ripristino della continuità ossea in molte difetti trattati con isografts (figura 8), è stato osservato solo all&#39;interno del ponteggio corallo difetti riempiti con questo materiale. Infatti, nessun osso è stata osservata una distanza superiore a 1 mm dai bordi ossei. Assenza di cartilagine in tutta istologico analizza i risultati forniti prova dellastabilità del osteosintesi raggiunto (Figura 9, Figura 10). Le radiografie e microCT analisi fornite prove del fatto che l&#39;unione delle ossa non si è verificato in tutti gli animali del gruppo di difetto di-sinistra-vuoto, 10 settimane dopo l&#39;impianto. Il volume di tessuto mineralizzato valutati da analisi microCT era 0,8 ± 0,3 mm 3 ed è stato rappresentante del-tessuto osseo formatosi di recente. Nei gruppi impalcatura isograft e corallo, l&#39;unione delle ossa è stato ottenuto in 4 e 4 animali, rispettivamente. Il volume di tessuto mineralizzato valutati da analisi microCT era 4.4 ± 0.9 mm 3 e 8.9 ± 0.7 mm 3. In questi gruppi, tuttavia, perché sia ​​la isograft e il patibolo coralli contenevano minerali, formazione di nuovo osso non poteva essere veramente distinto dal materiale impiantato restante (isograft o impalcatura di corallo). Sia il tasso di unione bon e il volume del tessuto mineralizzato ottenuto dal gruppo isograft edal gruppo scaffold corallo erano significativamente (p &lt;0,001) superiori a quelli ottenuti dal gruppo difetto-sinistra-vuoto. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52940/52940fig1.jpg" /> Figura 1:. L&#39;esposizione chirurgica per la creazione della femorale segmentale Defect A 15 - 17 mm incisione cutanea longitudinale, che si estende dal anca al giunto ginocchio, è stata fatta sulla faccia antero-laterale del femore. La fascia lata è stato inciso; il muscolo vasto laterale e muscolo bicipite femorale sono stati divisi per esporre l&#39;intera lunghezza della diafisi femorale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/52940/52940fig2.jpg" /> Figura 2: PiastraPosizionamento e prossimale vite Placement. La targa è stata applicata sul lato femorale anteriore. Il foro più prossimale della placca è stato perforato; la prima vite è stato inserito e, quindi, chiusa a chiave. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52940/52940fig3.jpg" /> Figura 3:. Distal Screw Placement Il foro più distale della placca è stato perforato e la vite è stato inserito e bloccato. (Ristampato con il permesso di tessuto Eng parte C 2013, 19 (4), 271-280) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52940/52940fig4.jpg" /> Figura 4: </strong&gt; Gigli Sega di posizionamento. Gli altri due viti esterne sono state inserite ma non bloccate e il filo dei 0,22 mm seghe Gigli era legata stretta intorno all&#39;osso in un orientamento medio-laterale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52940/52940fig5.jpg" /> Figura 5: La maschera di posizionamento La maschera è stato inserito sullo stelo degli ultimi due viti e applicato sopra la piastra e il filo della lama è stata quindi inserita nelle scanalature della dima.. (Ristampato con il permesso di tessuto Eng parte C 2013, 19 (4), 271-280) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt= &quot;Figura 6&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52940 / 52940fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6:. Osteotomia ostectomia è stata eseguita e la sega Gigli è stata ritirata. (Ristampato con il permesso di tessuto Eng parte C 2013, 19 (4), 271-280) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52940/52940fig7.jpg" /> Figura 7:. Viti interne Chiusura La maschera è stata rimossa e le ultime due viti bloccato. I difetti segmentale erano poi o lasciati vuoti o riempiti con i materiali testati. (Ristampato con il permesso di tessuto Eng parte C 2013, 19 (4), 271-280) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img al<html> t = &quot;Figura 8&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52940 / 52940fig8.jpg&quot; /&gt; Figura 8: Rappresentante postoperatoria radiografie e sagittale μCT ricostruzione dell&#39;osso femorale di topi osso femorale con il rispettivo difetto sia lasciato vuoto (AE), o pieni di enorme osso singenici trapianto (FJ), o pieni di enormi ponteggi corallo Acropora (KO. ); immediatamente dopo l&#39;intervento (A, F, K), 4 settimane dopo l&#39;intervento (B, G, L), 6 settimane dopo l&#39;intervento (C, H, M), e 10 settimane dopo l&#39;intervento (D, E, I, J, N , O) (lamiere di lunghezza = 10 mm). (Ristampato con il permesso di tessuto Eng parte C 2013, 19 (4), 271-280) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> file / ftp_upload / 52940 / 52940fig9.jpg &quot;/&gt; . Figura 9: Rappresentante Radiografia, μCT Ricostruzione e Istologia di un difetto Riempito con il corallo Patibolo Testato nel presente studio Una grande quantità di osso neoformato è stata osservata in-tra le circostanti bordi ossee e l&#39;impalcatura del corallo; in contrasto, piccolo osso era presente all&#39;interno del ponteggio. Macchie: Stevenel blu e von Gieson picrofuchsin. In queste condizioni, l&#39;osso, le cellule, e corallo macchiate di rosso, blu e marrone, rispettivamente. Barra di scala = 500 micron. ACS = Acropora patibolo corallo; BN = osso. (Ristampato con il permesso di tessuto Eng parte C 2013, 19 (4), 271-280) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52940/52940fig10.jpg" /> Figura 10: rappre<html> presentante Istologia di un difetto lasciato vuoto (A), pieno di Massive singenici innesto osseo (B), e riempito di corallo Scaffold (C). In difetto lasciato vuoto, l&#39;arrotondamento del ossea bordi con ripieno canale midollare e abbondante tessuto fibroso profondo in difetto sono stati osservati. In difetto riempito con enorme innesto osseo singenici, è stata osservata una continuità ossea tra il trapianto e le circostanti bordi ossei; midollo osseo era presente in tutta la cavità originaria. In difetto pieno di impalcatura corallo, è stata osservata osso neoformato tra le circostanti bordi ossee e il patibolo corallo, ma poco osso era presente all&#39;interno del patibolo. Macchie: Stevenel blu e von Gieson picrofuchsin. In queste condizioni, l&#39;osso, le cellule, e corallo macchiate di rosso, blu e marrone, rispettivamente. Barra di scala = 500 mm. ACS, impalcatura di corallo; BN, osso; BM, del midollo osseo; FT, tessuto fibroso. (Ristampato con il permesso dal tessuto Eng parte C 2013, 19 (4), 271-280)OAD / 52940 / 52940fig10large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura animata 11" src="/files/ftp_upload/52940/52940animfig1.jpg" /> Animato / video Figura 1: il video rappresentante l&#39;andatura di un mouse a un post-operatorio giorno. Peso è stata osservata cuscinetto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/Animated_Figure1.MOV" target="_blank">Cliccate qui per vedere il video.</a>

Sebbene i modelli murini siano strumenti inestimabili per l'ingegneria del tessuto osseo, i modelli di difetti delle ossa lunghe sono scarsi. Questa necessità ha motivato lo sviluppo del presente protocollo che utilizza una piastra di bloccaggio con quattro viti e una maschera dedicata per eseguire e stabilizzare un difetto riproducibile, femorale, di dimensioni critiche con bassa morbilità.

Istituzione di un segmentale femorale critico-size difetto del modello in topi stabilizzati da osteosintesi Piastra

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

L'obiettivo generale di questo intervento chirurgico è creare un difetto osseo critico a livello femorale stabilizzato mediante osteosintesi con piastra nei topi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ingegneria tissutale ossea riguardo alle capacità di guarigione ossea di specifici sostituti ossei o ai processi coinvolti nella rigenerazione ossea. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di ottenere un difetto osseo riproducibile in un osso portante, rilevante per applicazioni ortopediche del modello.Dopo la detersione asettica dell'arto, si posiziona un telo chirurgico sterile trasparente di plastica che ricopre il topo, praticando un piccolo foro nel telo per isolare la zampa. Con il topo anestetizzato in posizione prona e l'arto posteriore sinistro in estensione, effettuare un'incisione cutanea longitudinale lunga da 15 a 17 millimetri sulla faccia anteriolaterale del femore, estendendola dall'articolazione dell'anca fino all'articolazione del ginocchio. Successivamente, incidere la fascia lata e dividere i muscoli vasto laterale e bicipite femorale per esporre l'intera lunghezza della diafisi femorale.Per migliorare l'esposizione della diafisi femorale, sezionare i muscoli gluteo e bicipite femorale dal terzo trocantere ed effettuare una dissezione circolare del femore nella parte media della diafisi. Successivamente, applicare una piastra microbloccante in titanio a sei fori sulla faccia anteriore del femore. Utilizzare quindi una punta da trapano da zero virgola tre millimetri per forare il foro più prossimale della piastra.Utilizzare un cacciavite dedicato per inserire la prima vite mantenendo la piastra parallela al femore. Successivamente, mantenendo la piastra in posizione, praticare il foro più distale della piastra e inserire e bloccare la seconda vite. Inserire le due viti finali senza bloccarle.Ora, posizionare il filo di una sega oscillante di zero virgola due millimetri intorno al femore in un'orientamento mediale-laterale. Inserire l'apposito calibro sui fusti delle ultime due viti ed applicare il calibro sopra la piastra. Quindi, sotto irrigazione sterile con soluzione fisiologica isotonica, eseguire una femorolistesi lunga tre virgola cinque millimetri a livello medio-diafisario utilizzando i due terzi centrali del filo, applicando una tensione costante e uniforme contro l'osso.Quando l'osso è stato reciso, tagliare il filo della sega vicino all'osso da un lato ed estrarre il dispositivo di guida. Fissare le ultime due viti, quindi risciacquare abbondantemente il campo chirurgico con soluzione fisiologica sterile isotonica. Successivamente, riempire chirurgicamente il difetto segmentario con il materiale in esame, posizionando in modo lasso il muscolo vasto laterale sulla piastra.Infine, utilizzare suture in glicomero 631 cinque-zero con un modello continuo semplice per chiudere il piano fasciale e sottocutaneo, chiudendo la cute con suture in glicomero 631 quattro-zero e un modello di sutura semplice interrotto. Il peso dell'osteosintesi utilizzata nel presente studio era circa lo zero virgola uno percento del peso corporeo del topo e non si sono verificate complicazioni post-operatorie, autolesioni o lesioni provocate dai compagni di gabbia. Il recupero funzionale dell'arto operato è stato eccellente in tutti gli animali e il carico completo è stato osservato entro un giorno dall'intervento chirurgico.Quando i difetti ossei indotti chirurgicamente sono stati lasciati vuoti, non è stata osservata una formazione ossea significativa, con una mancata unione ossea costante in tutti gli animali. Al contrario, quando i difetti sono stati riempiti con un isotrapianto o con un'impalcatura di corallo, è stato osservato un nuovo tessuto osseo che si estendeva dai margini ossei prossimali e distali.Tuttavia, mentre la formazione ossea ha permesso il ripristino della continuità ossea, nella maggior parte dei difetti trattati con isotrapi, il ripristino osseo è stato osservato soltanto tra lo scaffold e i margini ossei dei difetti riempiti con corallo. Nessuna unione ossea si è verificata in alcun animale del gruppo con difetto vuoto a dieci settimane dall'impianto. Nei gruppi con isotrapi e scaffold di corallo, l'unione ossea è stata raggiunta nella maggior parte degli animali, con pochissime ossa osservate all'interno dello scaffold stesso.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 45-60 minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la stabilità ossea viene raggiunta mediante osteosintesi con piastra, e pertanto la piastra deve essere applicata nella posizione corretta sul femore. Dopo questa procedura, altri metodi come la micro-TC e l'imaging con bioluminescenza possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande sulla formazione ossea e sugli impianti in caso di sopravvivenza, quando viene utilizzata una scala autoseminata come materiale di riempimento della lesione.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria dei tessuti ossei per esplorare i processi di rigenerazione ossea. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare un difetto osseo riproducibile in un osso portante di un roditore, stabilizzato mediante osteosintesi con piastra. Non dimenticare che lavorare con animali e strumenti chirurgici può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come il mantenimento della sterilità, l'uso accurato dell'anestesia e l'attenzione al benessere degli animali devono sempre essere osservate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Istituzione di un segmentale femorale critico-size difetto del modello in topi stabilizzati da osteosintesi Piastra

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