Name: Analisi qPCRTag - A High Throughput, Real Time PCR Assay per Sc2.0 genotipizzazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Scopri il metodo qPCRTag ad alto rendimento per la genotipizzazione nel progetto del genoma sintetico del lievito. Questa tecnica elimina l'elettroforesi su gel e riduce il tempo di analisi a circa un'ora.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Science Foundation sovvenzione MCB-0718846 e della Difesa Advanced Research Projects Agency Contratto N66001-12-C-4020 (per JDB). LAM è stato finanziato da una borsa di studio post-dottorato dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada. La pubblicazione di questo articolo è sponsorizzato da Roche.

1. Preparare lievito DNA genomico (gDNA) <ol><li> Preparare uno stock di lievito Lysis Buffer 9 contenente 50 mM Tris pH 8,0, NaCl 100 mM, 1% SDS (w / v), 2% Triton X-100 (v / v), 1 mM EDTA pH 8,0. </li><li> Come iniziare Uso dei materiali ~ 2 x 10 6 cellule, che corrisponde in genere a ~ 100 ml di cultura satura per i ceppi di laboratorio del 10 BY4741 sfondo. Cellule coltivate devono essere raccolte mediante centrifugazione a 1000 xg per 3 min a temperatura ambiente in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aspirare il surnatante. </li><li> Aggiungere 200 ml di lievito Lysis Buffer e risospendere il pellet cellulare pipettando. </li><li> Aggiungere ~ 300 microlitri di acido lavato perle di vetro tale che il livello di perline è di circa 1 mm al di sotto del livello della sospensione cellulare. </li><li> In una cappa aspirante aggiungere 200 ml di fenolo / cloroformio / alcool isoamilico (25: 24: 1). Tappare la provetta per microcentrifuga e accertarsi che non perle sono bloccati tra il tappo e il tubo come questo si tradurrà in perdite durante l&#39;agitazione(Passo 1.6). Invertire 3 volte per mescolare e verificare il tappo è sigillata. </li><li> Agitare la provetta per 10 min a temperatura ambiente utilizzando un mixer da banco come un Eppendorf 5432. </li><li> Centrifugare a 20.800 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Trasferimento 75 ml di fase acquosa in una nuova provetta da microcentrifuga contenente 1 ml di etanolo al 100%. Invertire 10 volte per mescolare. </li><li> Pellet il DNA mediante centrifugazione a 20.800 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Aspirare il surnatante, senza staccare il pellet di DNA. Lavare il pellet con 500 ml di etanolo al 70%. </li><li> Centrifugare a 20.800 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Aspirare il surnatante, senza staccare il pellet di DNA e aria asciugare il pellet con il tappo microcentrifuga aperto fino eccesso di etanolo evaporato, che di solito è di circa 10 min. </li><li> Risospendere il pellet di DNA in 75 ml di 10mM Tris pH 7.4 e agitare per miscelare. Conservare il campione a -20 ° C tempo indeterminato. Misurare la concentrazione di DNA nel campione utilizzando unBenchtop fluorimetro quali qubit, che distingue DNA da RNA. Assicurarsi che la concentrazione finale di gDNA è ~ 1-2 ng / ml. </li><li> Preparare una diluizione 1:10 di DNA genomico con acqua e agitare per miscelare. </li><li> Aliquotare 30 ml di gDNA diluito nel pozzetto di una piastra appropriata fonte che è compatibile con un dosatore acustica nanoscala (passaggio 3). Se si utilizza un Labcyte Echo 550, utilizzare una piastra in polipropilene 384 bene (targa 384PP). NOTA: quando sigillato appropriatamente questo piatto può essere conservato per almeno un mese a -20 ° C. </li></ol> 2. Preparare ed erogazione qPCR Master Mix in un piatto multiwell 1.536 <ol><li> Preparare 850 ml di qPCR master mix, come LightCycler 1536 DNA Verde Maestro, in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e agitare per miscelare. Centrifugare il master mix qPCR per 2 min a 20.800 xg a temperatura ambiente per eliminare eventuali bolle. I componenti della miscela master qPCR richiesto per una singola 1.536 piastra multipozzetto sono come seguonos: <ol><li> Combina 170 ml di master mix enzima (metropolitana di Green Master 1, 5x concentrato), 42,5 ml di SYBR (Verde Maestro Provetta 4, 20x concentrata) e 637,5 ml di acqua. </li></ol></li><li> Dispensare 500 nl / bene in un piatto di 1.536 pozzetti utilizzando un distributore di rinfuse liquide, come l&#39;Arte Robbins Cobra. (Si noti che i passaggi 2.2.1-2.2.4 si riferiscono specificamente al Cobra.) <ol><li> Creare un programma di erogazione con le seguenti impostazioni: classe liquido, acqua; il volume aspirato, 800 ml; erogare il volume, 500 nl; lavare il tempo, 20 sec. Nelle impostazioni di erogazione, verificare la velocità di erogazione è impostato al 49,6 mm / sec, l&#39;offset di erogazione è di 0,25 mm, liquido aspirato eccesso verrà erogata indietro nella fonte bene. </li><li> Posizionare il tubo microcentrifuga contenente la master mix qPCR in pozzetto A1 del titolare provetta per microcentrifuga, che si trova in posizione di ponte 1. Tagliare il tappo della provetta per microcentrifuga o semplicemente lasciarla aperta. Impostare il &#39;Aspirare bene&#39; per A1 modificando il AspiratImpostazioni e. </li><li> Eseguire una fase di lavaggio prima di erogare qPCR master mix per primo de-selezionando l&#39;aspirare e dispensare fasi del programma creato nel passo 2.2.2 e premendo &#39;run&#39;. Una volta completato, riselezionare la aspirare e dispensare passaggi prima di eseguire il programma completo per erogare qPCR master mix. Se il Cobra è stato inattivo per meno di 10 minuti la fase iniziale di lavaggio, che serve per innescare il sistema, non è necessaria. </li><li> Hit &#39;run&#39; di dispensare qPCR Master Mix per ogni bene. </li></ol></li><li> Raccogliere il master mix qPCR in fondo a ogni bene da breve centrifugazione del 1536 piastra di pozzetti (30 sec con una bassa velocità PCR piatto ogiva). </li></ol> 3. Dispensare Template DNA e Primer nel 1.536 pozzetti Piastra <ol><li> Erogare 5 nl di gDNA diluito (passo 1.3) nei pozzetti desiderati della piastra multipozzetto 1536 utilizzando un sistema di trasferimento di liquido acustico, come l&#39;Echo 550. <ol><li> Per il Echo 550, utilizzare il software Piastra Reformat o, in alternativa fornire un foglio di calcolo Excel personalizzato per programmare il trasferimento. Assicurarsi che la sorgente selezionata bene per il gDNA nel programma corrisponde alla fonte ben in cui si è fisicamente erogato il gDNA (passo 1,3). Scegliere la targhetta fonte &#39;384PP_AQ_BP2&#39;, che indica il liquido nella piastra 384PP è un buffer senza tensioattivi. </li></ol></li><li> Erogare 10 nl di primer, pre-miscelati in avanti e inversa ad una concentrazione finale di 50 mM ciascuno, nei pozzetti desiderati della piastra multipozzetto 1536 utilizzando un sistema di trasferimento di liquido acustico, come l&#39;Eco 550. <ol><li> Per il sistema di trasferimento di liquido, utilizzare il software Piastra Reformat o, in alternativa fornire un foglio di calcolo Excel personalizzato per programmare il trasferimento. NOTA: Qui è possibile erogare primers tale che il layout sulla piastra multipozzetto 1.536 corrisponde all&#39;ordine cromosomico dei primer per cui è facile per ispezionare visivamente i risultati in tempo reale PCRsuccessivamente (fase 6). </li><li> Premiscelare i primer in una piastra che è compatibile con l&#39;erogatore liquido acustica. Per l&#39;Eco 550, utilizzare una piastra Labcyte 384LDV (volume morto) e scegliere il tipo di piatto di origine &#39;384LDV_AQ_B&#39; durante la programmazione l&#39;Eco per indicare il liquido è un semplice tampone senza proteine. </li></ol></li></ol> 4. Seal e Centrifuga 1536 pozzetti Piastra <ol><li> Utilizzando un sistema sigillante micropiastre come il Plateloc Microplate Sealer termica, sigillare immediatamente la piastra multipozzetto 1.536 utilizzando otticamente chiaro sigillo che è compatibile con lo strumento termosaldatrice. Non toccare la superficie della guarnizione per evitare delle macchie. <ol><li> Se si utilizza il Plateloc termica Microplate Sealer, utilizzare le seguenti impostazioni: sigillare tempo 2,0 sec, temperatura di saldatura 162 ° C, la pressione dell&#39;aria 82 psi. Questo strumento prende ~ 5 min a scaldarsi e quindi deve essere attivata in anticipo. </li><li> Se si utilizza il Plateloc micropiastre termico sigillante, un adapter deve essere utilizzato per aumentare l&#39;altezza del 1536 piastra multipozzetto sulla scena dello strumento per garantire una buona tenuta. NOTA: Anche se è preferibile acquistare un piattello per il Plateloc micropiastre termico sigillante, una soluzione alternativa è quella di inserire quattro ~ 2 mm di spessore rondelle standard disponibili in qualsiasi negozio di ferramenta negli angoli per aumentare l&#39;altezza della piastra pozzetti 1.536. </li></ol></li><li> Centrifugare immediatamente la piastra multipozzetto sigillato 1.536 a 2.000 xg per 3 minuti a temperatura ambiente per raccogliere tutti i reagenti sul fondo di ciascun pozzetto. </li></ol> 5. Real Time PCR <ol><li> Programma uno strumento 1.536 qPCR, come il LightCycler 1536, con un protocollo di amplificazione due fasi seguita da una analisi della curva di fusione. Utilizzando il software LightCycler 1.536 istituito un programma come segue: <ol><li> Pre-incubazione: 95 ° C, 1 min di attesa, velocità di rampa 4,8 ° C / sec, nessun acquisto. </li><li> Two Step Amplificazione: 30 cicli di [95 ° C, nessuna attesa,rampa tasso 4,8 ° C / sec, nessuna acquisizione; 64 ° C, 30 sec attesa, velocità di rampa 2.5 ° C / sec, singola acquisizione]. </li><li> Melt curva: 95 ° C, 10 sec, velocità di rampa 4,8 ° C / sec, nessuna acquisizione; 60 ° C, 1 min, velocità di rampa 2.5 ° C / sec, senza acquisizione; 97 ° C, velocità di rampa di 0,1 ° C / sec, 5 acquisizioni / ° C (continuo). </li><li> Raffreddare: 40 ° C, 30 sec, velocità di rampa 2.5 ° C / sec, senza acquisizione. </li></ol></li><li> Impostare il formato di rilevamento di &#39;Green intercalando Dye&#39; nella scheda Run Definizione. </li><li> Impostare il controllo di pipettaggio di &#39;Master Control&#39; nella scheda Run Definizione. Questa funzione serve come controllo interno e rileva la presenza di qPCR master mix in ciascun pozzetto della piastra multipozzetto 1.536, che è utile identificare putativi falsi negativi. </li><li> Inserire la piastra di 1.536 pozzetti preparato in passi 2-4 nello strumento 1.536 qPCR ed eseguire il programma. </li></ol> Analisi 6. Dati <ol><li> Perform ispezione visiva dei dati all&#39;interno del software qPCR. NOTA: Il software 1.536 permette la visualizzazione sia amplificazione e fondere curve, così come una mappa di calore che mostra la chiamata (positivo, negativo, non valida, N / A, figura 2), il valore del punto di attraversamento (scorrevole scala colori per positiva o grigio per negativo; Figura 3), o una fluorescenza endpoint (EPF) valore (scalare colore). </li><li> Esportare dati dal software 1.536 sotto forma di un file txt (tabella dei risultati) o un file .xml sia con i dati grezzi o dati calcolati per l&#39;elaborazione offline dallo strumento. NOTA: Il proprietario punto di attraversamento automatizzato (Cp) algoritmo chiamando integrato nel software 1.536 prende in considerazione la forma e la pendenza della curva di amplificazione durante la determinazione / chiamate valore negativo e Cp positive con fiducia alta, a volumi di reazione microlitro basso sub con relativamente basso valori di fluorescenza. </li><li> Se il DNA LightCycler Verde Maestro era usod per qPCR, verificare che tutti i pozzetti superato il &#39;controllo master&#39;. Un fail indica il bene non ha ricevuto qPCR master mix e il punto di dati mancanti dovrebbe essere considerata un potenziale falso negativo. Verificare che tutti i pozzetti superato il &#39;controllo master&#39;. Un fail indica il bene non ha ricevuto Mastermix DNA e considerare il punto di dati mancanti un potenziale falso negativo. </li></ol>

<ol><li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li>
<li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li>
<li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+6000+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li>
<li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li>
<li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li>
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<li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li>
<li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome%3A+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li>
<li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li>
<li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C%3A+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li>
</ol>

LAM, NAP, JAM e JDB hanno nulla da rivelare. RC e AL sono impiegati da Roche Life Science, Stati Uniti e ha lavorato sullo sviluppo della applicazione con LAM come parte di una prova di principio dell&#39;esperimento.

Incorporazione di tempo reale di rilevamento PCR nel test di genotipizzazione PCRTag è uno sviluppo importante per il progetto Sc2.0 in quanto consente un throughput significativamente più alto. Il flusso di lavoro precedente specificato di 2,5 microlitri reazioni in 384 piatti ben PCR, 1,5 ore di runtime cicli termici, elettroforesi gel, e annotazione manuale del gel. Il flusso di lavoro qui presentato, chiamata analisi qPCRTag, supera diversi grandi colli di bottiglia. In primo luogo, una corsa qPCRTag condensa 4 x 384 pozzetti in un singolo esperimento che può essere elaborato, dall&#39;inizio alla fine (targa impostare più il tempo di esecuzione), in circa un&#39;ora. E &#39;significativo notare che il costo dei reagenti per pozzetto per l&#39;analisi qPCRTag è alla pari con l&#39;approccio basato gel agarosio rendimento inferiore. Tuttavia, eludendo elettroforesi su gel e annotazione manuale, il flusso di lavoro qPCRTag permette notevoli risparmi di tempo e manodopera, che sono i principali vantaggi. È importante sottolineare che il flusso di lavoro qPCRTag è enramente compatibile con l&#39;automazione. Una preoccupazione principale con l&#39;uso della rilevazione in tempo reale come uscita del test PCRTag è il tasso di falsi positivi e falsi negativi. Poiché i primers PCRTag non sono stati originariamente progettati per l&#39;utilizzo in tempo reale PCR, si prevede che non tutte le coppie di primer sarà appropriato per l&#39;uso con questa uscita. A tal fine è importante per convalidare la funzione e la specificità di tutte le coppie di primer PCRTag escludere il sottoinsieme che non funzionano nel reale test basato sul tempo davanti. Per esempio, cromosoma 3 PCRTag falsi positivi e negativi sono by-e-grandi riproducibile in tempo reale di dati PCR (figure 2 e 3), e questi possono essere esclusi da ulteriori analisi. Inoltre, coppie di primer noti per fallire (valutato mediante elettroforesi su gel e riportati nelle figure S6 e S7 di Annaluru et al. 1) può anche essere esclusa. Questo è facilmente realizzabile semplicemente excluding le coppie di primer difettosi durante la configurazione del protocollo di trasferimento acustico. Come la maggior parte saggi ad alto rendimento, abbiamo intenzione di utilizzare il rilevamento PCRTag tempo reale come schermo primario per identificare trasformanti che meritano ulteriore convalida valle. Successivamente, il gold standard per lo screening secondario rimarrà analisi PCRTag con elettroforesi su gel come la lettura. Al di là l&#39;applicazione dell&#39;analisi PCRTag per Sc2.0, combinando sistemi di manipolazione su scala nanometrica liquido state-of-the-art, con un throughput elevato tempo reale tecnologia PCR consente analisi rapide e automatizzato e ha il potenziale per influenzare molti campi. Ad esempio, questo flusso di lavoro potrebbe essere applicata ad alto throughput screening biblioteca, la diagnosi delle malattie infettive, l&#39;analisi microbioma e all&#39;avanguardia di editing genoma approcci di tentare di modificare simultaneamente loci multipli.

Sc2.0, o il Progetto Genoma lievito sintetico ( <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.org</a> ), ha fissato l&#39;obiettivo di progettare e costruire un genoma eucariote completamente sintetico. Utilizzando la sequenza del genoma estremamente curata di Saccharomyces cerevisiae 3 come punto di partenza, ciascuno dei cromosomi lineari sedici è stato ri-progettato per soddisfare una serie di principi di progettazione che specificano mantenersi in forma delle cellule, migliorando la stabilità del genoma, e aumentando la flessibilità genetica. Ad esempio, gli elementi destabilizzanti come ripetizioni vengono cancellati dal cromosomi Sc2.0. Tutte le istanze di codoni di stop TAG sono ri-codificati per TAA a &#39;liberare&#39; un codone nel ceppo finale per l&#39;introduzione di un amminoacido non geneticamente codificato. Inoltre un sistema di evoluzione inducibile, Scramble, consentito dal sistema Cre-lox, permette la capacità senza precedenti di generare genomi derivati ​​con nuove strutture 4. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Un altro importante elemento di design nel genoma Sc2.0 è l&#39;introduzione di PCRTags, che servono come filigrane DNA per attivare il rilevamento di sintetico e selvaggio tipo DNA. PCRTags sono brevi segmenti ri-codificati in ORF sui cromosomi sintetici; mentre le sequenze PCRTag differiscono a livello di DNA tra i cromosomi tipo sintetico e selvatici, le proteine ​​codificate sono identici in sequenza aminoacidica e, quindi, presumibilmente, funzione. Sequenze PCRTag sono specificamente progettati come Primer siti di legame per facilitare l&#39;amplificazione selettiva (Figura 1A). Disegno PCRTag viene effettuata utilizzando l&#39;algoritmo &#39;più diversa&#39; in GeneDesign 5,6, cedevole ricodificati sequenze sintetiche che sono tipicamente ~ 60% diversa dalle sequenze native (minimo 33%) con temperature di fusione tra 58 ° C e 60 ° C e amplicon lunghezze tra 200-500 coppie di basi 2. Ricodifica non è consentito ai primi 100 bp di ciascuna ORF, come queste regioni sono noti perhanno preferenze particolari in termini di utilizzo codone 7. Insieme, queste regole di progettazione favoriscono alte prestazioni di quasi tutti i PCRTags sotto un unico insieme di condizioni di PCR quale tipo PCRTag coppie di primer di sintesi e selvaggi legano esclusivamente e amplificano DNA sintetico e nativo, rispettivamente (Figura 1B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> Figura 1:. PCRTag schema (A) PCRTags sono sequenze all&#39;interno di lettura aperta (ORF) dei geni sui cromosomi Sc2.0 ri-codificati. (B) sintetico (SYN) e wild type (WT) primer PCRTag legano esclusivamente e amplificano tipo sintetico e selvaggio DNA genomico (gDNA), rispettivamente. Qui è l&#39;analisi di un segmento ~ 30 kb del braccio sinistro del cromosoma sei, prova tredici PCRTag coppie di primer utilizzando sia WT o semi-synVIL2 gDNA come modello. In molti casi un singolo ORF codifica più PCRTag. Presenza / assenza di ampliconi PCRTag viene valutata mediante elettroforesi su gel di agarosio. Ampliconi PCRTag variano nel formato da 200 bp a 500 bp. Le specie più veloce migrano nella parte inferiore dei pannelli sono dimeri di primer. Analisi PCRTag ha dimostrato di essere uno strumento importante per l&#39;assemblaggio di cromosomi Sc2.0. In un tipico esperimento 30-50 kb di DNA sintetico, che codifica 20-30 PCRTags, si trasforma in cellule di lievito per sostituire il corrispondente tipo selvaggio 1,2,8 DNA. Analisi PCRTag viene poi utilizzato per identificare trasformanti che codificano PCRTags sintetici ma non selvaggio di tipo abbracciano quel segmento di DNA, o cosiddetti &quot;vincenti&quot;. Di solito è necessario testare più trasformanti per identificare &quot;vincitori&quot;, così la produttività e costi di analisi PCRTag sono considerazioni importanti. Attualmente due cromosomi Sc2.0 sono stati completati (synIII 1 e synIXR 2), che rappresentano meno del 10% del genoma Sc2.0, although più della metà dei rimanenti cromosomi sono attualmente in fase di sintesi e l&#39;assemblaggio. La scala di analisi PCRTag necessaria per questo progetto sta rapidamente superando la possibilità di eseguire i gel e manualmente segnare la presenza di DNA sintetico e l&#39;assenza di selvaggio tipo DNA. Per migliorare il throughput del test PCRTag abbiamo sviluppato un flusso di lavoro mediante PCR in tempo reale per aggirare l&#39;uso di gel di agarosio. Il flusso di lavoro si avvale di un distributore di rinfuse liquide distribuire qPCR mastermix in ciascun pozzetto di una piastra multipozzetto 1.536, un distributore di liquido acustico nanoscala per trasferire DNA stampo e primer, e un termociclatore 1.536 qPCR, che ci permette di miniaturizzare le reazioni di 500 nl e massimizzare il throughput. Inoltre l&#39;analisi può essere automatizzata. Questo tipo di protocollo di genotipizzazione high throughput dovrebbe essere generalizzabili a qualsiasi progetto che richiede analisi di molti cloni di loci multipli.

<table><tr><tbody><td colspan="4">Lievito gDNA preparazione</td></tr> lievito <tr><td>gDNA</td><td>modello personalizzato</td><td></td><td>personalizzato per PCR in tempo reale</td></tr><tr><td>Perle di vetro lavate con acido (0,5 mm)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>lisi cellulare di lievito</td></tr><tr><td>Fenolo ultrapuro:Cloroformio:Alcool isoamilico (25:24:1, v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>lisi cellulare di lievito</td></tr><tr><td>5432 Mixer</td><td>Eppendorf</td><td>5432</td><td>lisi cellulare di lievito</td></tr><tr><td>Microcentrifuga 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td>lisi cellulare di lievito</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorimetro</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td>Quantificazione del gDNA</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>Quantificazione del gDNA</td></tr><tr><td>Labcyte 384PP piastra</td><td>Labcyte</td><td>P-05525</td><td>gDNA sourceplate</td></tr><tr><td colspan="4">DNA Green Mastermix prep e dispensazione</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 DNA Green</td><td>Roche</td><td>5573092001</td><td>mastermix PCR in tempo reale</td></tr><tr><td>1,5 ml Supporto per provette microfuge</td><td>ARI</td><td>EST BD060314-1</td><td>supporto per provette microfuge per ponte di Cobra</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 Multiwell Plate</td><td>Roche</td><td>5358639001</td><td></td></tr><tr><td>Cobra sistema di gestione dei liquidi</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>630-1000-10</td><td>eroga qPCR master mix in 1536 piastra</td></tr><tr><td>PCR Plate Spinner</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>cenrifugazione di 1536 plate</td></tr><tr><td colspan="4">Template e primer erogazione primer</td></tr><tr><td>PCRTag</td><td>IDT</td><td>personalizzato</td><td>premiscelato in avanti e indietro, 50 &mu; M ogni</td></tr><tr><td>TempPlate, foglio sigillante perforabile, sterile</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0110</td><td>sigillo temporaneo per piastre di primer PCRTag</td></tr><tr><td>Labcyte LDV Piastra a 384 pozzetti</td><td>Labcyte</td><td>LP-0200</td><td>Piastra sorgente di primer premiscelato</td></tr><tr><td>Echo 550 Liquid Handler</td><td>Labcyte</td><td></td><td>trasferisce 2,5 nl di gocce di primer e DNA modello in piastra 1536</td></tr><tr><td>Sigillante termico per micropiastre Plateloc</td><td>Agilent</td><td>G5402-90001</td><td>termosaldatore per piastra 1536 prima dell'esecuzione LC1536</td></tr><tr><td>Sigillatura permanente trasparente</td><td>Agilent</td><td>24212-001</td><td>termosaldatura otticamente trasparente per piastra multipozzetto LC1536</td></tr><tr><td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage</td><td>Agilent</td><td>G5402-20008</td><td>può sostituire rondelle spesse ~2 mm</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR</td><td>Thermo Scientfic</td><td>75-004-521</td><td>centrifuga termosaldata piastra</td></tr> <tr><td>1536Compressore d'aria industriale</td><td>Jun Air</td><td>1795011</td><td>per far funzionare l'Echo e la termosigillatrice</td></tr><tr><td colspan="4">Real Time PCR</td></tr><tr><td>LightCycler 1536</td><td>Roche</td><td></td><td>richiede una presa da 220 V</td></tr></tbody></table>

analisi qpcrtag - a high throughput, real time pcr assay per sc2.0 genotipizzazione

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Il Progetto Genoma lievito sintetico (Sc2.0) mira a costruire 16 cromosomi del lievito di design e riunire in un&#39;unica cellula di lievito. Ad oggi un cromosoma sintetico, synIII 1, e un braccio cromosoma sintetico, synIXR 2, sono stati costruiti e la loro funzione in vivo convalidato in assenza della corrispondente specie selvatiche cromosomi. Una caratteristica importante disegno di cromosomi Sc2.0 è l&#39;introduzione di PCRTags, che sono brevi sequenze ri-codificato all&#39;interno di lettura aperta (ORF) che consentono la differenziazione dei cromosomi sintetici dai loro omologhi di tipo selvatico. PCRTag primers ricottura selettivamente per entrambi i cromosomi di tipo sintetiche o selvatici e la presenza / assenza di ogni tipo di DNA può essere verificato utilizzando un semplice test PCR. La lettura standard del dosaggio PCRTag è valutare la presenza / assenza di ampliconi mediante elettroforesi su gel di agarosio. Tuttavia, con una densità media PCRTag amplicone di uno per 1.5 kb e agenome dimensione del ~ 12 Mb, il genoma Sc2.0 completato codificherà circa 8.000 PCRTags. Per migliorare il throughput, abbiamo sviluppato un saggio di rilevamento basato su PCR in tempo reale per PCRTag genotipizzazione che chiamiamo analisi qPCRTag. Il flusso di lavoro specifica di 500 reazioni nl in un piatto multipozzetto 1.536, che ci permette di testare fino a 768 PCRTags con entrambe le coppie di primer tipo sintetico e selvatici in un singolo esperimento.

Abbiamo testato sintetico e selvaggio tipo cromosoma 3 PCRTag coppie di primer 1 con il lievito DNA genomico (gDNA) estratto da quattro diversi ceppi. Cromosoma 3 ha 186 PCRTag coppie di primer che si estendono la lunghezza del cromosoma (synIII è ~ 270 kb e selvaggio tipo cromosomiche 3 è ~ 315 kb). Per testare ciascuno dei quattro ceppi con entrambe le serie di primer, abbiamo diviso la piastra multipozzetto in quattro quadranti, uno per ogni tipo di gDNA, assegnando primers sintetici PCRTag alla metà superiore di ogni quadrante e tipo selvaggio per la metà inferiore. Il DNA genomico è stato estratto dai ceppi di lievito, due dei quali codificano wild type cromosoma 3 (wild type, synIXR 2), mentre i restanti due codifica cromosoma sintetico 3 (synIII 1, synIII synIXR). qPCR master mix è stato erogato in ciascun pozzetto di una piastra multipozzetto 1.536 con un dosatore di massa, seguito da gDNA e PCRTag primer utilizzando le Echo 550. primer sono stati schierati in modo identicoogni quadrante della piastra di pozzetti per un facile confronto visivo. La piastra pozzetti è stato poi termosaldato con guarnizione otticamente chiaro e sottoposto ad real time PCR. In questo esperimento qPCRTag abbiamo osservato, per la maggior parte, di amplificazione come previsto, per cui primers sintetici esclusivamente amplificate DNA sintetico e viceversa (figure 2 e 3). Tuttavia, abbiamo anche osservato diverse deviazioni dal modello previsto, suggerendo falsi negativi e falsi positivi nel dataset. In questo esperimento, la centralina è stata rilevata nel 100% dei pozzi, indicando il dosatore bulk erogato successo mastermix in ogni pozzetto della piastra (dati non mostrati). Questo esclude un potenziale fonte di falsi negativi. Inoltre, alcuni dei cromosomi 3 PCRTags sono noti a fallire (indicato nelle figure S6 e S7 di Annaluru et al. 1), di cui almeno 2 SYN e 1 WTcoppie di primer; quindi questi pozzi possono essere ignorati in ogni quadrante. Veri falsi negativi potrebbero derivare da una mancanza di trasferimento di template gDNA o primer, però nella nostra esperienza, data la corretta taratura della Echo 550, così come la preparazione di gDNA e primer come descritto, questo non è stato un importante fonte di errore. Nel complesso in questo esperimento il tasso di falsi negativi è stato estremamente basso per primer WT con modello WT (~ 2%), anche se leggermente superiore per i primer SYN con SYN DNA (~ 8%). I falsi positivi, il rilevamento di segnali in pozzi dove primers SYN sono mescolati con WT gDNA (e viceversa), possono derivare da amplificazione croce o dimeri di primer. Infatti, dimeri di primer sono spesso visibili mediante elettroforesi su gel (Figura 1B) e rappresentano una fonte di errore ragionevole. Per l&#39;applicazione della qPCR, l&#39;esame delle curve di fusione può essere utile per determinare se diverse specie, come dimeri di primer, possono contribuire a un segnale. Inoltre, performing un esperimento di controllo per cui primer sono dispensati in assenza del DNA stampo può aiutare a identificare primer con una propensione a dimerize. Amplificazione trasversale può essere osservata mediante elettroforesi su gel, in particolare se troppi cicli di PCR vengono eseguite o se la temperatura di ricottura è troppo bassa. Si è cercato di ridurre il numero di falsi positivi dovuta all&#39;amplificazione croce ottimizzando entrambi questi parametri per il protocollo qPCRTag. Infine, esaminando i valori valico (Cp) per ciascun bene può aiutare a identificare primer che non sono adatti al rilevamento basato su tempo reale (figura 3, per esempio, BB22, FB22, BB46, Fb46). Nel complesso in questo esperimento il tasso di falsi positivi è stato basso per primer SYN con modello WT (~ 5%) e superiore per primer WT con template SYN (~ 10%). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> Figura 2: Piastra mappa di calore visualizzazione presenza / abinvito indicationi per un esperimento qPCRTag. Quattro diversi tipi di DNA genomico (quadranti separati da linee bianche solide) sono stati sottoposti ad analisi PCRTag usando sintetica (SYN) e wild type (WT) cromosoma 3 primer PCRTag (tratteggiate linee bianche per separare SYN (top ) e WT (inferiore) in ogni quadrante). WT e synIXR gDNA codificano selvaggio tipo cromosoma 3, cedendo l&#39;amplificazione con primer WT PCRTag. SynIII e synIII synIXR gDNA codificano cromosoma sintetico 3, cedendo l&#39;amplificazione con primer SYN PCRTag. Primer sono disposte in base al loro posizionamento cromosomica da sinistra a destra e posizionate in modo identico nei quattro quadranti per il confronto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> Figura 3: di calore a piastremappa mostrando valico (Cp) valore per un esperimento qPCRTag. Questo è lo stesso insieme di dati, come in figura 2 e il layout di piastra è quindi identica. N / A si riferisce a &#39;nessuna amplificazione&#39;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

I cromosomi progettisti del progetto Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, possono essere distinti dalle loro controparti native utilizzando un test di genotipizzazione basato su PCR chiamato PCRTagging, che ha un punto finale di presenza/assenza. Qui descriviamo un metodo di rilevamento della PCR in tempo reale ad alto rendimento per la genotipizzazione PCRTag.

Analisi qPCRTag - A High Throughput, Real Time PCR Assay per Sc2.0 genotipizzazione

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

L'obiettivo generale dell'analisi QPCR TAG è migliorare la produttività del saggio di genotipizzazione PCR TAG del progetto di genoma sintetico del lievito, implementando un sistema di rilevamento basato sulla PCR in tempo reale e reazioni miniaturizzate. Questo viene realizzato innanzitutto utilizzando un distributore automatico di liquidi per versare la miscela master QPCR in ogni pozzetto di una piastra multipozzetto da 1536. Successivamente, un robot per l'emissione acustica di gocce su scala nanometrica trasferisce il DNA stampo e i primer nei pozzetti della piastra multipozzetto.Successivamente, la piastra viene sigillata e le reazioni sono eseguite mediante il termociclatore A-Q-P-C-R. Infine, i dati di PCR in tempo reale vengono analizzati per determinare la presenza o l'assenza di marcatori PCR di tipo sintetico o selvatico in ciascun locus. In definitiva, il flusso di lavoro con marcatori QPCR migliora la produttività.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto al saggio PCR TAG attuale è che ci permette di evitare l'uso dell'elettroforesi su gel e l'annotazione manuale di tali gel. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo capito quanto tempo richiedesse e quanto fosse laboriosa la marcatura PCR su cromosomi più lunghi. Dopo aver coltivato e raccolto circa 2 milioni di cellule di lievito, aggiungere 200 microlitri di buffer per la lisi del lievito e pipettare per risospendere.Al pellet aggiungere 300 microlitri di perline di vetro trattate con acido fino a raggiungere un livello di circa un millimetro sotto quello delle cellule, sfocato. Quindi, in una cappa da laboratorio, aggiungere 200 microlitri di fenolo cloroformio alcol isoamilico, capovolgere il tubo tre volte per mescolare e verificare che il tappo sia ben chiuso. Successivamente, utilizzando un agitatore da banco, agitare il tubo per 10 minuti a temperatura ambiente; dopo la centrifugazione, trasferire 75 microlitri della fase acquosa in un nuovo tubo microcentrifuga contenente un millilitro di etanolo al 100%.Rovesciare il tubo 10 volte per miscelare dopo una nuova centrifugazione, aspirare il soprannatante senza disperdere il pellet ed utilizzare 500 microlitri di etanolo al 70% per lavare il pellet. Dopo aver rimosso il soprannatante, utilizzare 75 microlitri di tris 10 millimolare pH 7,4 per risospendere il pellet ed eseguire un vortex per miscelare. Dopo aver diluito il DNA da uno a dieci, aliquotare 30 microlitri di gDNA diluito nel pozzetto appropriato di una piastra sorgente per la dispensazione acustica di liquidi su scala nanometrica.Preparare 850 microlitri di miscela master per QPCR in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri ed eseguire un vortex per omogeneizzare. Quindi centrifugare la soluzione a 20.800 ×g e a temperatura ambiente per due minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria. Successivamente, utilizzando un distributore multiplo, distribuire 500 nanolitri per pozzetto in una piastra multipozzetto da 1536.Raccogliere il mix master per QPCR sul fondo di ogni pozzetto centrifugando brevemente la piastra. Successivamente, utilizzando il sistema acustico di trasferimento liquido e i dettagli indicati nel protocollo testuale, dispensare cinque nanolitri di GDNA diluito e dieci nanolitri di primer forward e reverse premiscelati a 50 micromolari nei pozzetti desiderati della piastra multipozzetto. La tecnologia acustica di gocciolamento utilizza il suono per trasferire verticalmente piccoli volumi di liquido da una piastra sorgente a una piastra destinazione capovolta.Qui il modello, il DNA e i primer vengono trasferiti in gocce multiple di 2,5 nanolitri nei pozzetti di una piastra multipozzetto da 1536 per impostare le reazioni di marcatura QPCR. Successivamente, utilizzare un sigillo otticamente trasparente e un sistema di sigillatura per micropiastre per sigillare immediatamente la piastra multipozzetto da 1536.Centrifugare immediatamente la piastra sigillata a 2000 G a temperatura ambiente per tre minuti per raccogliere tutti i reagenti sul fondo della pozzetta ed eseguire il programma di PCR in tempo reale sull'apparecchio QPCR, seguendo le indicazioni del protocollo scritto, quindi premere "esegui" al termine. Verificare che tutte le pozzette superino il controllo master, il che indica che il master mix per QPCR è stato rilevato nella pozzetta. Qualsiasi pozzetta che non superi il controllo rappresenta un potenziale punto dati falso negativo.Per analizzare i dati, ispezionarli visivamente all'interno del software QPCR e/o esportare i dati per l'elaborazione offline dall'apparecchiatura. In questo esperimento, coppie di primer per i marcatori PCR del cromosoma tre di tipo selvaggio e sintetico sono state testate con gDNA di lievito estratto da quattro ceppi diversi: due con il cromosoma tre di tipo selvaggio e due che codificano per un cromosoma sintetico.Tre primer sintetici, come previsto, hanno generalmente amplificato il DNA sintetico e non il DNA di tipo selvaggio. Analogamente, i primer di tipo selvaggio hanno prodotto ampliconi esclusivamente a partire da DNA di tipo selvaggio. È prevista la presenza di un numero ridotto di falsi positivi e falsi negativi, e le possibili fonti di questi errori sono descritte nel protocollo testuale allegato.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa un'ora dalla preparazione alla conclusione. Grazie per averci guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Qui, descriviamo un metodo per la quantificazione simultanea dei circoli di escissione del recettore delle cellule T (TREC) e dei circoli di escissione di ricombinazione con eliminazione K (KREC). Il test TREC/KREC può essere utilizzato come marcatore della produzione di timo e midollo osseo.

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