Microperla impianto nel zebrafish

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare l'impianto di microperle per indurre alterazioni nell'ambiente tissutale locale in punti spaziali e temporali specifici durante l'embriogenesi del pesce zebra. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando un vassoio per l'impianto delle perle, che facilita la manipolazione precisa e l'impianto delle microperle. Come secondo passaggio, le uova di pesce zebra vengono incubate fino allo stadio di sviluppo desiderato.

Le microperle vengono quindi preparate nelle soluzioni sperimentali appropriate e trasferite con attenzione nella posizione desiderata all'interno dell'embrione. In definitiva, l'impianto di microperle può essere eseguito senza alterare lo sviluppo normale del pesce zebra, consentendo di valutare gli effetti delle molecole di interesse sull'embriogenesi del pesce zebra. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo, come ad esempio in che modo diverse molecole influenzano il processo di organogenesi?

Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà, poiché è necessario esercitarsi per acquisire abilità nel manipolare le microperle. Per preparare il vassoio di impianto delle microperle, riscaldare innanzitutto per 90 secondi una soluzione di aro al 2% appena preparata. In un matraccio Erlenmeyer da 250 millilitri, agitare il matraccio ogni 30 secondi per evitare che il gel trabocchi.

Successivamente, posizionare il coperchio di una piastra di Petri da 60 per 15 millimetri all'interno di una piastra da 150 per 15 millimetri, con la parte interna del coperchio rivolta verso l'alto. Quindi, tenere fermo il coperchio della piastra di Petri più piccola con un dito indice. Versare il gel di agarosio caldo nella piastra più grande.

Lasciare formare uno strato sottile di agarosio sotto il coperchio più piccolo per prevenire la formazione di condensa e per rendere più visibili le perle al microscopio durante il raffreddamento dell'agarosio. Prima che si solidifichi, inclinare lentamente uno stampo per pozzetti nella parte superiore del gel per facilitare il posizionamento degli embrioni. Una volta che il gel si è solidificato, utilizzare una spatola microscopica per rimuovere con attenzione lo stampo per pozzetti.

Quindi aggiungere la soluzione E tre alla piastra e conservarla a quattro gradi Celsius. Per raccogliere gli embrioni di pesce zebra, riempire una camera di accoppiamento con acqua del sistema. Quindi posizionare un divisorio al centro della camera e aggiungere esemplari adulti di pesce zebra maschi e femmine nei lati appropriati della camera.

La mattina seguente, utilizzare un setaccio a maglie fini per raccogliere le uova fecondate. Capovolgere il setaccio all'interno di una nuova capsula di Petri da 10 centimetri e risciacquare la rete con un flusso sottile di soluzione E3 fino a quando non restano uova nel setaccio e il volume nella capsula è di circa 25 millilitri di soluzione E3. Successivamente, dividere le uova in diverse capsule, con 50-60 uova per capsula, per evitare sovraffollamento, e incubare le uova in soluzione E3 a 28,5 gradi Celsius. Prima dell'innesto delle microperle, incubare le uova nel volume appropriato della molecola in esame o del veicolo controllo per il periodo di tempo adeguato.

Quindi, quando gli embrioni hanno raggiunto il punto temporale di sviluppo desiderato, utilizzare pinzette fini per rimuovere i loro kons e incubare i zebrafish in soluzione di Ringer filtrata, integrata con antibiotici per 10 minuti mentre gli embrioni si adattano. Trasferire le microperle nella piastra per microperle precedentemente preparata, posizionata all'interno del vassoio di impianto, e risciacquare le perle e la soluzione di Ringer per 10 minuti.

Entro 50 minuti dal lavaggio dell'array di perline, posizionare un embrione alla volta all'interno della cavità della piastra di impianto, in modo che l'area destinata all'impianto delle microperline sia accessibile. Utilizzando un ago di tungsteno, praticare una piccola incisione sull'embrione, quindi premere la boccetta di una pipetta capillare per trasferire delicatamente una microperlina all'interno della colonna capillare e rilasciare la pressione per depositare la microperlina nella piastra di impianto, facilitandone la manipolazione. Spingere delicatamente la perlina in modo da farla affondare nella soluzione di Ringer all'interno dello stampo.

Quindi, utilizzando il microneedle, spostare la microperlina sull'embrione e all'interno dell'incisione. Infine, usare lo strumento "whisker" per allontanare la microperlina dal sito dell'incisione in modo che non venga espulsa durante la guarigione. Il successo dell'innesto della microperlina può quindi essere valutato immediatamente attraverso il microscopio stereoscopico, poiché la perlina rimarrà stabilmente posizionata all'interno del tessuto.

In questo esperimento, singole microperle di due dimensioni diverse, risciacquate esclusivamente con soluzione fisiologica, sono state impiantate in embrioni di pesce zebra allo stadio di gemmulo caudale o in fasi successive durante una certa miogenesi, per garantire che la posizione delle perle non si sia spostata nel corso dell'esperimento a causa della morfogenesi del tessuto endogeno. I campioni di embrione possono essere visualizzati mediante acquisizione fotografica temporale o controllati a intervalli regolari, come mostrano le immagini relative all'impianto delle microperle. In assenza di qualsiasi coniugato, è possibile ottenere molecole di piccole dimensioni senza effetti morfologici evidenti durante lo sviluppo normale del pesce zebra SPR.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come Whole Mount Institute hyper per studiare come il microbead influisce sull'espressione genica. In generale, comprendere la posizione del bead nel tempo è fondamentale per l'interpretazione dei risultati, ad esempio per valutare gli effetti di una molecola di piccole dimensioni su un tessuto bersaglio o su un processo di sviluppo.