Name: Microperla impianto nel zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Impara l'impianto di microperle in embrioni di zebrafish per studiare la biologia dello sviluppo. Questa tecnica consente di manipolare l'ambiente tissutale locale senza interrompere lo sviluppo normale, facilitando la ricerca sui meccanismi embriogenetici.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere DP2OD008470.

Le procedure per l&#39;utilizzo di embrioni di zebrafish descritte in questo protocollo sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale presso l&#39;Università di Notre Dame. Soluzione Preparazione di 1. Ringer <ol><li> Fare una soluzione di 116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 3,6 mM CaCl 2, e 5 mm con Hepes ultrapuro H 2 O attraverso una continua agitazione per evitare qualsiasi precipitazione di sali. </li><li> Dopo aggiunta di sali e mentre la soluzione è ancora agitazione, aggiungere 100 unità / mL di penicillina per e 100 mg di streptomicina per ml. </li><li> Dopo aver aggiunto tutti gli antibiotici e sali, effettuare Filtro sterilizzante della soluzione e conservare in contenitore sterile. Nota: N-feniltiourea (1-fenil-2-tiourea) o PTU possono essere aggiunti alla soluzione di Ringer di bloccare la formazione di pigmento in perline embrioni impiantati senza conseguenze negative per la salute embrione. Per preparare la soluzione di blocco / pigmentazione di Ringer, utilizzare un concenzione del 0,003% PTU. A causa della bassa concentrazione di PTU da aggiungere si consiglia un volume maggiore di soluzione di Ringer essere fatta almeno 1 L, per evitare di aggiungere minuscole quantità di polvere PTU. Aggiungere PTU durante il passaggio 1.2, mentre la soluzione si agita. </li></ol> 2. Tricaine Soluzione Preparazione <ol><li> Aggiungere 2 g di etil 3-amminobenzoato sale metansolfonato (Tricaine) per l di soluzione più 0,1 M Tris, da uno stock 1 M equilibrata a pH 9,5 fornito con ultrapura H 2 O. Nota: Tricaine sarà utilizzato euthanize gli embrioni zebrafish al punto di tempo desiderato per eseguire il test del branello fenotipi impianto. </li></ol> 3. E3 Soluzione Preparazione <ol><li> Fare una soluzione di 0,25 M NaCl, KCl 10 mM, 12,5 mM CaCl 2, e 16,6 mM MgSO 4 a 1 L di acqua ultrapura per creare 1 L di E3. </li><li> Aggiungere 200 ml di blu di metilene alla soluzione E3 per inibire la crescita fungina. </li></ol>4. Aghi Pulling per Microbead Transfer <ol><li> Utilizzare Sfaccettate vetro borosilicato con filamento ad un OD: 1,0 mm ID 0,5 mm, una lunghezza di 10 cm. </li><li> Posizionare il vetro borosilicato in un estrattore micropipetta per preparare aghi sottili. Nota: I seguenti quattro dimensioni può essere utilizzato come punto di partenza per tirare gli aghi: Calore = 540, Pull = 245, velocità = 200, e ora = 125. </li><li> Dopo aver tirato un numero adeguato di aghi, conservare in plastica coperto petri piatti, posizionate su strisce di pasta modellabile o nastro adesivo per evitare la rottura della punta dell&#39;ago, fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Per tagliare la punta dell&#39;ago per il diametro desiderato, utilizzare un paio di pinze sottili a segnare la fine dell&#39;ago. Nota: Ago diametro varia a seconda delle dimensioni microbead essere utilizzato così come preferenze Gestione utente. Un buon punto di partenza è quello di diametri mestiere in un range tra 100 e 200 micron se saranno utilizzati microperle che vanno 50-100 micron. </li><li> Prior da utilizzare, inserire l&#39;ago tagliato nel supporto tubo capillare di moda lo strumento di trasferimento microperla completato. </li></ol> 5. Baffo / Lash Preparation Tool <ol><li> Ottenere un soffio, scatenarsi, o un altro piccolo pezzo ma ferma di filamento capelli naturali o sintetici. Tagliare vicino alla base del filamento ad un angolo di 45 °. Rispettare il baffo di un P-1000 micropipetta punta usando permanente chiaro colla adesiva. </li></ol> 6. microperla impianto Tray Preparazione <ol><li> Mescolare 2 g di agarosio con 100 ml di soluzione E3 per fare un E3 gel di agarosio al 2%. </li><li> Riscaldare la soluzione di agarosio al 2% per 1 min e 30 sec in un pallone da 250 ml Erlenmeyer, agitando il matraccio ogni 30 secondi per evitare il gel dalla traboccante. </li><li> Prendere il coperchio di una x 15 mm di Petri 60 mm e posizionarlo in un grande 150 millimetri piatto x 15 mm con l&#39;interno rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Versare il gel caldo nella x 15 mm Petri 150 mm, avendo cura di ancorare giùil coperchio del piatto più piccola con il dito indice. Nota: Consentire un sottile strato di agarosio al di sotto del coperchio del piatto più piccolo per rimuovere la condensa che si forma quando si versa il gel; questo renderà le perle più facile vedere al microscopio dissezione. </li><li> Come l&#39;agarosio si raffredda, ma prima che si solidifica, posizionare uno stampo ben sul gel. Ciò consentirà per facilitare il posizionamento degli embrioni. </li><li> Nota: Per evitare bolle nei pozzetti, posizionare lo stampo lentamente con un angolo fino a che galleggia sulla superficie del gel. </li><li> Utilizzando un microspatula, rimuovere con attenzione lo stampo bene una volta il gel si è solidificato. Aggiungere la soluzione E3 e conservare a 4 ° C. </li></ol> 7. embrioni Collection <ol><li> Preparare le camere di accoppiamento, separati da divisori, da essi riempiendo d&#39;acqua il sistema, e poi mettendo maschio adulto zebrafish (s) e (s) coppie di sesso femminile nelle camere di O / N. </li><li> Raccogliere uova fecondate con un colino rete metallica (stadi embrionali possono variare leggermente). </li><li> Depositare le uova fecondate in una, dieci centimetri di diametro piatto di Petri pulita ruotando il filtro a testa in giù e risciacquo con un bel flusso di E3 finché non ci sono le uova rimaste nel colino, e ci circa 25 ml di soluzione E3 nel piatto. </li><li> Dopo la raccolta, dividere le uova in diversi piatti (circa 50-60 uova per piatto) per evitare il sovraffollamento, che potrebbe condurre a asincronia di sviluppo all&#39;interno della frizione e rendere la raccolta di momenti desiderati punti difficili. </li><li> Incubare gli embrioni in soluzione E3 a 28,5 ° C per consentire la valutazione dello sviluppo secondo la serie messa in scena zebrafish standard a 40. Nota: Gli embrioni devono essere trasferiti E3 / PTU a 24 ore dopo la fecondazione (HPF) per prevenire lo sviluppo di pigmento se manipolazioni nelle fasi più anziani richiedono chiarezza ottica. </li></ol> 8. Bead impianto <ol><li> Incubare le microsfere di concentrazione di prova molecola desiderata o al veicolo corrispondente soluzione per il tempo necessario a un volume adeguato. Nota: Il ricercatore può utilizzare piastre sterili vanno 3-6 cm di diametro, o piastre a più pozzetti, entrambi i quali consentono la visualizzazione delle microsfere all&#39;interno della soluzione. Il tempo può variare a seconda del tipo e della quantità di molecola di interesse, e il ricercatore dovrebbe riferirsi fabbricante o raccomandazioni pubblicate per durata dell&#39;incubazione e altri aspetti come la sensibilità alla luce e temperatura. </li><li> Una volta che gli embrioni hanno raggiunto il punto di tempo di sviluppo desiderato, rimuovere gli embrioni dai loro chorions utilizzando una pinza sottile. </li><li> Incubare gli embrioni nella soluzione Ringer filtrata con antibiotici per 10 minuti per loro ambientarsi alla soluzione. </li><li> Mentre gli embrioni sono acclimating, trasferire le microsfere nella piastra microbead annidato all&#39;interno del vassoio impianto e sciacquare in soluzione Ringer per 10 min. Nota: Impianto le perle a meno di 50 minuti dopo aver raggiunto questo punto. Questo will diminuire la probabilità che uno impiantare un cordone con una minore concentrazione della molecola di interesse. </li><li> Array gli embrioni nei pozzetti del vassoio microbead impiantazione, avendo cura di orientarle quindi la zona di interesse in cui la microbead sarà impiantato è accessibile. </li><li> Fai una piccola incisione sull&#39;embrione utilizzando l&#39;ago di tungsteno. </li><li> Trasferire una microbead sul embrione utilizzando la pipetta di trasferimento microcapillare: premendo il bulbo della pipetta, tirare delicatamente il microbead nella colonna capillare, e poi rilasciare la pressione per trasferire il microbead alla destinazione desiderata. </li><li> Utilizzare lo strumento basette / sferza per posizionare il microbead all&#39;interno dell&#39;embrione. Nota: Assicurarsi di posizionare il microbead nel tessuto lontano dal sito di incisione in modo che il microbead non sarà espulso dal embrione come si guarisce. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nel secolo scorso, la comprensione del piano corpo patterning e organogenesi ha subito progressi monumentali. Tecniche di manipolazione dei tessuti erano critici nello scoprire informazioni chiave su questi processi vitali. La modificazione genetica è uno dei metodi più comunemente utilizzati per l&#39;accertamento funzione dei geni, e metodi di analisi mosaico, come il trapianto di cellule, fornisce approcci utili a comprendere l&#39;autonomia della funzione del gene. Impianto microperla fornisce un altro luogo per interrogare come le molecole particolare alterare le dinamiche evolutive, in quanto questo metodo consente al ricercatore di alterare un ambiente del tessuto locale con l&#39;introduzione di molecole di segnalazione o inibitori. Una gamma di microsfere sono disponibili in commercio, che hanno varie dimensioni e altre proprietà fisiche esistere (ad esempio, carica) tale che essi possono essere impiegati per le condizioni sperimentali di interesse. Così, impiantando microsfere che sono immersi in una proteina o chimicocal di interesse all&#39;interno di un organismo, i ricercatori possono studiare gli effetti localizzati durante lo sviluppo e trovare le associazioni tra il gene o molecola di interesse e particolare fenotipo biologico (s). Studi come quello eseguito da Wada e colleghi hanno utilizzato microperla l&#39;impianto al fine di valutare l&#39;effetto di un aumento Hedgehog in patterning scheletrico neurocranio anteriore (ANC) in zebrafish 23. Studi precedenti hanno dimostrato che Shh è necessario per la formazione ANC 14. Uso microsfere Shh rivestite ricercatori hanno identificato che questo segnale promuove la formazione della cartilagine nell&#39;ANC. Il processo di impianto microperla è stato utilizzato per dimostrare un chiaro legame tra segnalazione Hedgehog e la formazione di cartilagine dell&#39;ANC. Un altro esempio chiave di questa tecnica manipolazione dei tessuti in zebrafish è osservata in studi in cui gli scienziati hanno studiato il controllo trascrizionale del Erythroblastoma ventisei (ETS) dominio fmolecola attori ETS relative (Erm) e Polyoma enhancer attivatore 3 (Pea3) di FGF signaling durante le prime fasi di sviluppo del cervello zebrafish 19. Attraverso esperimenti di impianto microperla, sono stati in grado di dimostrare che Fgf8 e FGF3 possono ectopicamente attivare l&#39;espressione di ERM e pea3. Questi esempi illustrano l&#39;utilità di microsfere di fornire informazioni sui meccanismi di sviluppo che collaborano durante la formazione del tessuto, che possono essere ben caratterizzato dall&#39;utilizzo di metodi per valutare l&#39;espressione genica 41. Così, il trapianto microbead può essere un metodo praticabile per esplorare altri tessuti, come il mesoderma intermedio (IM) che dà origine al rene. In particolare, sarebbe di aiuto negli studi di sviluppo renale, per indagare come le diverse molecole influenzano nefrone segmentazione 42 e tubulogenesi 43,44, processi che sono solo superficialmente compresi attualmente. Inoltre, microbead impianto è già iniziato ad essere utilizzato al montanteprocessi y rigenerazione in zebrafish 29] e potrebbero essere adattati per l&#39;utilizzo con qualsiasi numero di modelli di rigenerazione di organi, come ad esempio in seguito ablazione laser dei tessuti embrionali, come il nefrone 45 o in combinazione con metodi che sono stati formulati per eseguire la ricerca con le corrispondenti strutture per adulti 46-49. Infine, microbead impianto ha il potenziale per essere utilizzato in modelli di malattie umane, come il cancro 50,51 o tessuto degenerazione 52,53. Nel presente protocollo, dimostriamo il metodo di microbead impianto in embrioni di zebrafish, che è anche stato simile descritto da altri ricercatori, ma non dimostrato, attraverso protocolli di video 1. Con la pratica minimo siamo stati in grado di impiantare microsfere ad una velocità di circa 8-10 embrioni / h, che mette in relazione la fattibilità di questa procedura una volta che il ricercatore ha una certa esperienza. I risultati riportati nel presente documento dimostrano che perle di vari dimensioni possono essere impiantati nelle fasi iniziali, e che con cura, questa tecnica manipolazione dei tessuti possono essere implementati con minimo impatto fisico per l&#39;embrione. Un miglioramento che va sottolineato è l&#39;uso di uno strumento basette / ciglia posizionarla microbead nell&#39;embrione. Questo pezzo relativamente economico e semplice di apparecchiature è circa lo stesso diametro del microperla, è facile da ottenere e aiuta a velocizzare il processo di impianto. Il baffo / sferza può essere tagliato alla lunghezza desiderata per la produzione di una ditta e delicato strumento-tallone gestione, a seconda del ricercatore destrezza e la preferenza. Infine, mentre abbiamo descritto qui come manipolare fisicamente microsfere ed embrioni di zebrafish per eseguire l&#39;impianto, questo protocollo non delineare specifiche procedure di gestione per i farmaci o peptidi diversi. In generale, microsfere trattate chimicamente devono essere impiantati nell&#39;animale con espedienti, per evitare effetti indesiderati in altre aree dell&#39;organismo, e ricercatori dovrebbero essere largoformata sui possibili problemi di sicurezza associati a tali sostanze chimiche prima di iniziare i loro studi. In sintesi, abbiamo dimostrato un metodo microbead impianto relativamente semplice ed efficiente con una vasta gamma di applicazioni che utilizzano materiali che sono facilmente disponibili in laboratorio. In definitiva, ci auguriamo che questo manuale sarà di aiuto ai ricercatori la delicatezza di manipolazione dei tessuti zebrafish.

I ricercatori di biologia dello sviluppo utilizzano una vasta gamma di metodi di cellulari, molecolari e genetici per scoprire i meccanismi che controllano come si forma un organismo. Tra questi approcci, manipolazione dei tessuti è uno strumento chiave nel decifrare questioni complesse circa il destino della cellula, il movimento cellulare, e l&#39;organizzazione dei tessuti. Un modo per alterare ambienti locali tissutali è attraverso l&#39;applicazione chirurgica di microsfere che sono utilizzati per fornire una sorgente focale di proteine ​​o altre molecole di segnalazione 1. Questo tipo di manipolazione sperimentale è stato ampiamente implementato in classici modelli embriologia vertebrati, come la rana e pulcino 2. Il pesce zebra è diventato un importante organismo modello vertebrato per lo studio della organogenesi e fornisce anche molti vantaggi unici per la modellazione malattia 3-5 in quanto condividono la conservazione genetica alto con gli esseri umani 6. In particolare, la trasparenza ottica ed exsviluppo Ternal dell&#39;embrione zebrafish offre un punto di vista senza pari per l&#39;osservazione del tessuto ontogenesi 3-5. La realizzazione di schermi genetici forward grandi ha generato un potente repository di ceppi mutanti zebrafish per ulteriori studi 7,8, e l&#39;identificazione di tecniche di screening alternativi che possono essere efficacemente condotta a scala ridotta in singoli laboratori 9,10. Ulteriore lavoro sperimentale con zebrafish è stata facilitata grazie ai progressi nelle metodologie transgeniche e invertire approcci genetici 11,12, così come la genetica chimici 13-15. Tecniche di manipolazione dei tessuti, come la realizzazione di microsfere, non sono stati così ampiamente impiegato nel zebrafish, ma comunque fornire uno strumento utile per comprendere ulteriormente la segnalazione delle cellule durante lo sviluppo. Microperla impianto è stato utilizzato per interrogare i processi di formazione dell&#39;organo nella retina zebrafish16,17, 18 cuore, il cervello 19-22, neural crest 23, e fin 24,25. In questi ed altri studi, perline sono state applicate durante lo sviluppo per comprendere la diffusione delle molecole di segnalazione 26, come gradienti influenzano migrazione cellulare 27 e assiale patterning 28. Più recentemente, microsfere sono stati utilizzati per valutare i meccanismi di rigenerazione in adulti zebrafish 29. Negli studi di sviluppo, ad esempio, il lavoro microperla zebrafish ha fornito informazioni sui meccanismi di formazione degli arti attraverso studi della pinna pettorale 25. Il pesce zebra pettorali germoglio pinna è omologa al germoglio arti anteriori nel topo 30 e pulcino 31. La gemma vertebrati arto ha due nodi fondamentali di segnalazione: la zona di attività polarizzante (ZPA), che stabilisce l&#39;asse anteriore-posteriore attraverso l&#39;espressione di Sonic hedgehog (Shh) ea valle geni bersaglio Hox,e la cresta ectodermica apicale (ARE) presente sulla punta della gemma dell&#39;arto, che agisce per stabilire prossimale all&#39;identità distale degli arti attraverso l&#39;espressione di fattori di crescita dei fibroblasti (Fgfs). Con l&#39;impianto di microsfere Fgf imbevuti in zebrafish mutanti genetici Shh, investigatori identificato Fgf come essenziale per la progressione del ciclo cellulare e la crescita dell&#39;arto vertebrati 25. In aggiunta a FGF e Shh cascate di segnalazione che stabiliscono identità posizionale, studi pionieristici utilizzando la gemma pulcino arto identificato acido retinoico (RA) come una molecola che potrebbe mimare l&#39;azione della regione polarizzatore per stabilire anteriore a posteriore identità 32. Questi esperimenti coinvolti mettendo piccole strisce di carta Whatman RA-impregnato nella arto pulcino di valutare cifre patterning 32. Inoltre, i ricercatori hanno eseguito altri studi eleganti che impiegano l&#39;uso di microsfere, trapianto di cellule, ed esogenoTrattamenti RA in zebrafish per determinare che RA agisce per fornire a lungo raggio spunti di posizione all&#39;interno romboencefalo zebrafish e mesoderma 28. Tuttavia, attualmente molte domande rimangono circa i ruoli di segnalazione fattori come Fgf e RA durante numerosi aspetti dello sviluppo dei vertebrati. Gli effetti di segnalazione di RA, che agisce come un morfogeno, incidono molti organi 33, come il cuore lo sviluppo 34 e progenitori renali, dove RA specifica cellule renali prossimali tipo destino 35-39. Ulteriore comprensione di tali argomenti potrebbe beneficiare in modo significativo da studi sperimentali che utilizzano tecniche di manipolazione dei tessuti e microperla impianto. Mentre meno studi sono stati condotti con microperla impianto in zebrafish, rispetto a modelli come il pulcino, quelli che sono stati eseguiti sono stati altamente informativo. Uno dei motivi per la scarsità di microbead impianto-ricerca con sede nell&#39;embrione zebrafish è likely la nozione che ci sono difficili sfide tecniche, in base alle dimensioni dell&#39;embrione, che costituiscono un impedimento per eseguire con successo tali manipolazioni. Tuttavia, microbead impianto in embrioni di zebrafish può essere apprese con la pratica e assistito attraverso l&#39;osservazione visiva della tecnica, e quindi può essere perseguito come un mezzo per interrogare i meccanismi di sviluppo. Qui, dimostriamo l&#39;applicazione precisa di una microbead nell&#39;embrione zebrafish, che può essere utilizzato per condurre una vasta varietà di saggi di formazione del tessuto e la morfogenesi cellulare.

<table><tbody><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00366</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-20ML</td><td></td></tr><tr><td>N-Feniltiourea (PTU)</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Etile 3-amminobenzoato (Tricaina)</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Vetro borosilicato</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio ultrapuro</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Blu di metilene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Pallone di Erlenmeyer</td><td>Fischer Scientific</td><td>FB-500-250</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri monouso per falco,</td><td>430167</td><td></td> <td>Corning</td> sterile</tr><tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Saint-Gobain Chemware Microspatola</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-50B</td><td></td></tr><tr><td>P-1000 Puntali per micropipette</td><td>Fischer Scientific</td><td>2707402</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a bassa temperatura</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>Dimethly Sulfoxide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere (45-106 &micro; m)</td><td>Biorad</td><td>140-1454 AG1-X8</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere (45 &; micro; m)</td><td>Polysciences</td><td>7314</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta per microdissezione</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>Ago di tungsteno</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6065</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per tubo capillare</td><td>Globe Scientific Inc.</td><td>Codice: 51674</td><td></td></tr></tbody></table>

microperla impianto nel zebrafish

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Il pesce zebra è emerso come un valido sistema di modello genetico per lo studio della biologia dello sviluppo e della malattia. Zebrafish condividono un alto grado di conservazione genomica, nonché similarità nei processi cellulari, molecolari e fisiologici, con altri vertebrati compresi gli esseri umani. Durante la prima ontogenesi, embrioni di zebrafish sono otticamente trasparente, consentendo ai ricercatori di visualizzare la dinamica di organogenesi utilizzando un semplice stereomicroscopio. Impiantazione microperla è un metodo che permette la manipolazione dei tessuti attraverso l&#39;alterazione dei fattori negli ambienti locali. Questo permette ai ricercatori di saggiare gli effetti di un qualsiasi numero di molecole di segnalazione di interesse, come i peptidi secreti, nei punti spaziali e temporali specifiche all&#39;interno dell&#39;embrione in via di sviluppo. Qui, i dettagli di un protocollo per il modo di manipolare e perline impianti durante le prime fasi di sviluppo zebrafish.

Diversi tipi di strumenti di manipolazione sono utili per il trattamento microsfere durante applicazioni di ricerca (Figura 1). Inoltre, un semplice stampo agarosio con pozzetti può essere utilizzata per tenere l&#39;embrione zebrafish, che è fondamentale per effettuare questi esperimenti in modo tempestivo ed efficace (Figura 1). L&#39;impianto di una microbead può essere eseguita alla posizione spaziale e temporale della fase di interesse, che permette ai ricercatori per limitare una specifica finestra di azione per la molecola di interesse. Qui, singole microsfere sono stati impiantati in embrioni di zebrafish allo stadio bocciolo coda o in successivi momenti durante le fasi somitogenesis (Figura 3). Due microsfere di dimensioni differenti, sciacquati con soluzione di Ringer sola, sono stati utilizzati in questo protocollo dimostrazione (Figura 3A, 3B e 3C). Questo impianto microbead in assenza di qualsiasi coniugatopiccole molecole dimostra che tallone impianto può essere raggiunto senza effetti morfologici lordi durante il corretto sviluppo dell&#39;embrione zebrafish (Figura 4). Il sperimentalista può incontrare difficoltà con la manovra della microbead nel foro di puntura fatta da un ago di tungsteno in cima l&#39;embrione. Per ottenere una migliore gestione del microbead volta immesso sul embrione dal micro-ago, un / strumento ciglia whisker può essere utilizzato. Questo può essere realizzato con cadute naturalmente felino o basette canino, anche se altri filamenti ciglia naturali o sintetici possono essere utilizzati (Figura 1). Una leggera spinta del microbead sia con l&#39;ago di tungsteno o lo strumento baffo dovrebbe vedere la microbead affondare la soluzione di Ringer dello stampo. Una volta che il microbead è affondato nello stampo dovrebbe essere spostato grandi distanze, se necessario, utilizzando l&#39;ago di tungsteno e una volta in cima dell&#39;embrione dell&#39;utensile ago o whisker può essere utilizzato per position per la microbead nell&#39;embrione. Il successo del fissaggio microbead può essere misurata immediatamente attraverso la visualizzazione a uno stereomicroscopio, come il tallone rimane stabilmente posizionato nel tessuto. Per valutare la posizione tallone nel tempo, ogni campione embrione può essere ripreso con vivo time-corso di fotografia o controllato ad intervalli periodici (come illustrato nella Figura 4) per assicurare che la posizione tallone non è spostato sopra la durata dell&#39;esperimento dovuta al tessuto endogeno morfogenesi. Comprensione della posizione del tallone nel tempo è critico per l&#39;interpretazione più informata dei risultati, come valutare l&#39;effetto di una piccola molecola su un tessuto bersaglio o un processo evolutivo. L&#39;uso di questi passaggi sopra fornirà un ambiente ideale per incastonare microsfere nell&#39;embrione zebrafish alla volta e posizione desiderata. Nella nostra esperienza, gli utenti meno esperti di questo protocollo microperla impianto tipicamente guadagnato il ne abilitàsario effettuare impianto chirurgico coerente microsfere nell&#39;embrione zebrafish, dopo circa una settimana di pratica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" /> Figura 1. strumenti utilizzati per eseguire microbead impiantazione. (A) Il vassoio impiantazione tallone (sinistra 15 cm di diametro) con stampi embrione (a sinistra) e un vassoio microbead incubazione (a destra, diametro 6 cm). Questo vassoio di lavoro permette al ricercatore di posizionare gli embrioni nell&#39;orientamento desiderato per microperla impianto, e di avere le microsfere preparati per l&#39;impianto in prossimità alla stazione microscopio. Microsfere devono essere incubate a piccola molecola (s) e / o del veicolo e quindi risciacquati in una piastra separata microbead (destra) prima di posizionarli nel vassoio impiantazione tallone che è posizionato sotto la stazione microscopio. (B) Due coppie di pinza sottile saranno utilizzati per rimuovere il Chorisulla circostante ogni embrione zebrafish e anche a rompere la fine dell&#39;ago microcapillare. (C) Un ago di tungsteno sarà utilizzata per realizzare un sottilissimo foratura nell&#39;embrione zebrafish in cui posizionare il microperla. (D) Il trasferimento pipetta microcapillari sarà utilizzato per prelevare e posizionare un microbead in cima zebrafish vicino al sito della puntura. (E) Il / strumento sferza baffo consentirà il posizionamento dolce del microbead nel sito di incisione all&#39;interno dell&#39;embrione che è stato precedentemente fatto dal ago di tungsteno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" /> Figura 2. Schema del procedimento microbead impianto. (A) Un vassoio impiantazione microbead con microsfere soaking nella soluzione di lavaggio desiderato sia impostato sotto una stazione stereomicroscopio, e gli embrioni posizionati con il tessuto rivolto verso l&#39;alto. (B) Usando un ago di tungsteno, una piccola incisione nella embrione può essere effettuato con un lieve movimento ancora forte. (C) Usando una pipetta di trasferimento microcapillari, il microbead desiderato può essere ritirato dalla camera microbead incubazione nel vassoio, situata a destra, e portato al vano sinistra dove la zona di lavoro embrione è situato. Il microbead deve essere depositato vicino al sito di incisione, poi delicatamente posizionata nel sito di incisione fatta dall&#39;ago tungsteno utilizzando lo strumento / ciglia basette. Una volta che un microbead è manovrato nel sito di incisione, dovrebbe essere inserito nel tessuto (distanza dall&#39;incisione) per posizionare stabilmente la microbead e prevenire successivo movimento fuori dell&#39;embrione come sviluppo continua. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">P</a>leasing clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" /> Figura 3. microsfere possono essere impiantati in embrioni a diversi stadi di sviluppo. (A) zebrafish embrioni sono stati impiantati con un microbead (diametro di circa 50 micron) nel tronco in fase di germoglio di coda. Esaminato in 24 ore dopo branello impianto (hpbi), gli embrioni avevano sviluppato normalmente e la microbead mostrato minimo movimento durante il passaggio del tempo evolutivo. (B) zebrafish embrioni impiantati con microsfere (con un diametro di circa 50 micron) nel sacco vitellino nella fase 3 somite (ss) visualizzate sviluppo normale con movimento tallone relativamente minore nel tempo. (C) microsfere grandi (diametro di circa 70 micron) sono stati impiantati nell&#39;embrione 7 ss simile mostrato successivo sviluppo normale, così come minimal se dal sito dell&#39;impianto alcun movimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" /> Figura 4. sviluppo Gross dell&#39;embrione zebrafish è imperturbato dalla presenza di un microbead attraverso 72 hpbi. Zebrafish embrioni sono stati impiantati con microsfere imbevute di soluzione di Ringer (con un diametro di circa 50 micron) nella fase 7 somite (ss). Ogni microperla stato chirurgicamente inserito nel bagagliaio, tra le somiti 3 e 4. La presenza del cordone non era associata a difetti palesi sviluppo a 24 ore dopo perlina impianto (hpbi), 48 hpbi, o 72 hpbi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un versione più grande di questa figura.</a>

Il pesce zebra è un eccellente sistema modello per studi genetici e di sviluppo. L'impianto di perline è una preziosa tecnica di manipolazione dei tessuti che può essere utilizzata per interrogare i meccanismi di sviluppo introducendo alterazioni negli ambienti cellulari locali. Questo protocollo descrive come eseguire l'impianto di microsfere nell'embrione di zebrafish.

Microperla impianto nel zebrafish

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare l'impianto di microperle per indurre alterazioni nell'ambiente tissutale locale in punti spaziali e temporali specifici durante l'embriogenesi del pesce zebra. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando un vassoio per l'impianto delle perle, che facilita la manipolazione precisa e l'impianto delle microperle. Come secondo passaggio, le uova di pesce zebra vengono incubate fino allo stadio di sviluppo desiderato.Le microperle vengono quindi preparate nelle soluzioni sperimentali appropriate e trasferite con attenzione nella posizione desiderata all'interno dell'embrione. In definitiva, l'impianto di microperle può essere eseguito senza alterare lo sviluppo normale del pesce zebra, consentendo di valutare gli effetti delle molecole di interesse sull'embriogenesi del pesce zebra. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo, come ad esempio in che modo diverse molecole influenzano il processo di organogenesi?Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà, poiché è necessario esercitarsi per acquisire abilità nel manipolare le microperle. Per preparare il vassoio di impianto delle microperle, riscaldare innanzitutto per 90 secondi una soluzione di aro al 2% appena preparata. In un matraccio Erlenmeyer da 250 millilitri, agitare il matraccio ogni 30 secondi per evitare che il gel trabocchi.Successivamente, posizionare il coperchio di una piastra di Petri da 60 per 15 millimetri all'interno di una piastra da 150 per 15 millimetri, con la parte interna del coperchio rivolta verso l'alto. Quindi, tenere fermo il coperchio della piastra di Petri più piccola con un dito indice. Versare il gel di agarosio caldo nella piastra più grande.Lasciare formare uno strato sottile di agarosio sotto il coperchio più piccolo per prevenire la formazione di condensa e per rendere più visibili le perle al microscopio durante il raffreddamento dell'agarosio. Prima che si solidifichi, inclinare lentamente uno stampo per pozzetti nella parte superiore del gel per facilitare il posizionamento degli embrioni. Una volta che il gel si è solidificato, utilizzare una spatola microscopica per rimuovere con attenzione lo stampo per pozzetti.Quindi aggiungere la soluzione E tre alla piastra e conservarla a quattro gradi Celsius. Per raccogliere gli embrioni di pesce zebra, riempire una camera di accoppiamento con acqua del sistema. Quindi posizionare un divisorio al centro della camera e aggiungere esemplari adulti di pesce zebra maschi e femmine nei lati appropriati della camera.La mattina seguente, utilizzare un setaccio a maglie fini per raccogliere le uova fecondate. Capovolgere il setaccio all'interno di una nuova capsula di Petri da 10 centimetri e risciacquare la rete con un flusso sottile di soluzione E3 fino a quando non restano uova nel setaccio e il volume nella capsula è di circa 25 millilitri di soluzione E3. Successivamente, dividere le uova in diverse capsule, con 50-60 uova per capsula, per evitare sovraffollamento, e incubare le uova in soluzione E3 a 28,5 gradi Celsius. Prima dell'innesto delle microperle, incubare le uova nel volume appropriato della molecola in esame o del veicolo controllo per il periodo di tempo adeguato.Quindi, quando gli embrioni hanno raggiunto il punto temporale di sviluppo desiderato, utilizzare pinzette fini per rimuovere i loro kons e incubare i zebrafish in soluzione di Ringer filtrata, integrata con antibiotici per 10 minuti mentre gli embrioni si adattano. Trasferire le microperle nella piastra per microperle precedentemente preparata, posizionata all'interno del vassoio di impianto, e risciacquare le perle e la soluzione di Ringer per 10 minuti.Entro 50 minuti dal lavaggio dell'array di perline, posizionare un embrione alla volta all'interno della cavità della piastra di impianto, in modo che l'area destinata all'impianto delle microperline sia accessibile. Utilizzando un ago di tungsteno, praticare una piccola incisione sull'embrione, quindi premere la boccetta di una pipetta capillare per trasferire delicatamente una microperlina all'interno della colonna capillare e rilasciare la pressione per depositare la microperlina nella piastra di impianto, facilitandone la manipolazione. Spingere delicatamente la perlina in modo da farla affondare nella soluzione di Ringer all'interno dello stampo.Quindi, utilizzando il microneedle, spostare la microperlina sull'embrione e all'interno dell'incisione. Infine, usare lo strumento "whisker" per allontanare la microperlina dal sito dell'incisione in modo che non venga espulsa durante la guarigione. Il successo dell'innesto della microperlina può quindi essere valutato immediatamente attraverso il microscopio stereoscopico, poiché la perlina rimarrà stabilmente posizionata all'interno del tessuto.In questo esperimento, singole microperle di due dimensioni diverse, risciacquate esclusivamente con soluzione fisiologica, sono state impiantate in embrioni di pesce zebra allo stadio di gemmulo caudale o in fasi successive durante una certa miogenesi, per garantire che la posizione delle perle non si sia spostata nel corso dell'esperimento a causa della morfogenesi del tessuto endogeno. I campioni di embrione possono essere visualizzati mediante acquisizione fotografica temporale o controllati a intervalli regolari, come mostrano le immagini relative all'impianto delle microperle. In assenza di qualsiasi coniugato, è possibile ottenere molecole di piccole dimensioni senza effetti morfologici evidenti durante lo sviluppo normale del pesce zebra SPR.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come Whole Mount Institute hyper per studiare come il microbead influisce sull'espressione genica. In generale, comprendere la posizione del bead nel tempo è fondamentale per l'interpretazione dei risultati, ad esempio per valutare gli effetti di una molecola di piccole dimensioni su un tessuto bersaglio o su un processo di sviluppo.

microbead-implantation-in-the-zebrafish-embryo

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

In questo video, si dimostra un metodo con cui analizzare il cervello dei vertebrati sviluppo in embrioni di zebrafish dal vivo a una risoluzione singola cellula al microscopio confocale. Questo include il metodo con cui iniettare il unicellulare zebrafish e, successivamente, montare e immagine lo sviluppo del cervello.

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Embrioni di zebrafish trasparente si sono dimostrati padroni di casa modello utile per la visualizzazione e lo studio delle interazioni funzionali tra cellule immunitarie innate e batteri patogeni intracellulari, come ad...

L&#39;infezione di embrioni di zebrafish con batteri patogeni intracellulari

Questo video descrive una tecnica di microiniezione di embrioni per rilasciare composti nel sacco vitellino di pesce zebra.

Microiniezione di embrioni: una tecnica per somministrare un composto nel tuorlo di pesce zebra

Fonte: Zhang, X. et. al., Un modello di embrione di pesce zebra per la visualizzazione in vivo e l'analisi intravitale dell'infezione da Staphylococcus aureus associata a biomateriali. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra un modello di embrione di zebrafish per lo studio delle infezioni legate ai biomateriali impiantati. L'iniezione di Staphylococcus aureus con microsfere di polistirene migliora la sopravvivenza batterica, confermando il ruolo di promozione delle infezioni dei materiali...

Analisi in vivo delle infezioni batteriche associate all'impianto utilizzando embrioni di zebrafish

Fonte: Shi, J., et al., Screening e identificazione dei soppressori silenzianti dell'RNA da effettori secreti di patogeni vegetali. J. Vis. Esp. (2020)Questo video mostra la procedura per preparare una coltura di Agrobacterium tumefaciens inducendo l'espressione genica della virulenza con acetosirone, seguita dalla rimozione degli antibiotici tramite lavaggio e risospensione, per generare una sospensione pronta per la trasformazione destinata alla trasmissione genica nei tessuti vegetali.

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Il presente studio descrive un modello di embrione di zebrafish per videomicroscopia analisi di biomateriale infezione nel corso del tempo basato su microscopia di fluorescenza e la visualizzazione in vivo. Questo modello è un promettente sistema integrando modelli animali mammiferi quali modelli murini per lo studio delle infezioni associate al biomateriale in vivo.

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Le manipolazioni embriologiche come l'estirpazione e il trapianto di cellule sono strumenti importanti per studiare lo sviluppo precoce. Questo protocollo descrive un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per eseguire queste manipolazioni in embrioni di zebrafish.

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In questo studio, descriviamo un metodo semplice per eseguire l'analisi del colorante blu di Evans (EBD) sulle larve di pesce zebra.  Questa tecnica è un potente strumento per la caratterizzazione dell'integrità del muscolo scheletrico e la delineazione di modelli di distrofia muscolare di zebrafish, ed è un metodo prezioso per lo sviluppo di nuove terapie.

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Impara l'impianto di microperle in embrioni di zebrafish per studiare la biologia dello sviluppo. Questa tecnica consente di manipolare l'ambiente tissutale locale senza interrompere lo sviluppo normale, facilitando la ricerca sui meccanismi embriogenetici.

Microperla impianto nel zebrafish

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