Semplice e assistita da computer Olfattivo Test per Mice
15 giugno 2015
Presentiamo un test olfattivo semplice e imparziale nei topi. Con questo protocollo la discriminazione olfattiva, la preferenza, l'evitamento e la sensibilità a un nuovo odore rispetto all'acqua possono essere valutati in singole sessioni comportamentali. Questo metodo è indicato per un singolo sperimentatore e l'analisi si basa sull'elaborazione video assistita da computer.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è testare la discriminazione olfattiva innata, la preferenza olfattiva o l'evitamento e la sensibilità olfattiva nei topi. Questo viene ottenuto esponendo il topo a un attrattore o stimolo nuovo e a un odore neutro, costituito dall'acqua. Nel frattempo, una videocamera registra la sessione comportamentale.
Successivamente, il video viene analizzato con Image J utilizzando le macro fornite per ottenere i parametri relativi al tempo trascorso in presenza dell'odore e dell'acqua. I risultati mostrano il comportamento di preferenza o di evitamento verso gli odori rispetto all'acqua in diversi genotipi, in base all'analisi post hoc assistita dal computer. Il vantaggio principale del test olfattivo rispetto all'uso di un'arena dedicata per stimoli olfattivi è che utilizza un'arena familiare, consentendo quindi una rapida esecuzione e un montaggio semplice.
Inoltre, utilizza un hardware economico; la procedura sarà dimostrata da Emmanuel Abry, studente del mio laboratorio. Per questo esperimento, utilizzare topi maschi di età compresa tra tre e cinque mesi, C57 neri, sei di tipo selvatico e topi transgenici. Questa dimostrazione utilizza due linee knockout e controlli appartenenti alla stessa nidiata.
Per gli spazi sperimentali, utilizzare gabbie per topi pulite e sterilizzate con tre centimetri di lettiera. Successivamente, preparare l'allestimento della telecamera. Posizionarla a 58 centimetri sopra il fondo della gabbia su un supporto personalizzato per treppiede.
Fare alcuni segni sul piano di lavoro per indicare la posizione in cui deve trovarsi la gabbia. Per un'immagine centrale, impostare la telecamera per registrare un video di 320 per 240 pixel a circa 15 fotogrammi al secondo. Per preparare il soggetto del test, avere a disposizione concentrazioni di ciascun odore conservate in solvente, ogni volta che possibile.
Per il test di preferenza, preparare una soluzione al 10% peso in volume di burro di arachidi in olio di arachidi. Per il test di evitamento, utilizzare una soluzione al 98% di acido butirrico metilico. Per il test di sensibilità, raccogliere l'urina di femmine da un topo della stessa linea da uno a due giorni prima del test.
Trattenere una femmina con il ventre sopra la griglia della gabbia e raccogliere gocce della sua urina in una capsula di plastica. Raccogliere campioni da diverse femmine per la normalizzazione. A causa della variabilità individuale, unire tutti i campioni in una provetta da 1,5 millilitri e conservarli a meno 20 gradi Celsius.
Per iniziare, abituare gli animali posizionandone uno in una gabbia pulita e lasciandolo esplorare. Per cinque minuti, l'ambiente della gabbia di prova deve essere simile a quello della gabbia di casa. Ripetere la fase di abituazione una volta ogni giorno di prova; al termine del periodo di abituazione, iniziare la registrazione e pipettare 60 microlitri di una fragranza piacevole.
In questo caso, applicare il burro di arachidi su una parete e, sulla parete opposta, pipettare la stessa quantità di acqua. Applicare alcune gocce di una sostanza inodore a circa 10 centimetri di altezza su ciascuna parete. Lasciare ora l'animale esplorare per due minuti, quindi interrompere la registrazione e riportare il topo nella sua gabbia di provenienza.
Ripetere il processo con ogni topo da testare, utilizzando sempre gabbie di prova nuove. Da tre a cinque giorni dopo aver eseguito tutti i test di preferenza, effettuare il test di evitamento utilizzando una nuova gabbia di prova.
Per ogni topo, eseguire il test di evitamento. Come nel test di attrazione, sostituire soltanto la sostanza odorosa piacevole con quella sgradevole, ovvero l'acido due metil butirrico. Per il test di sensibilità, una gabbia può essere riutilizzata tra una prova e l'altra per lo stesso topo.
Quindi segnare il lato dell'acqua della gabbia e prepararsi a pulire le pareti corte con carta imbevuta di etanolo al 70% tra un test e l'altro. Nel giorno dell'esperimento, preparare quattro concentrazioni dell'urina mediante una serie di diluizioni decrescenti. Utilizzando acqua bidistillata, come nel test di evitamento, abituare ciascun animale alla propria gabbia di prova per cinque minuti.
Quindi esporre ogni topo all'urina alla diluizione più alta inizialmente, ovvero uno a 10.000. Durante la registrazione, applicare la diluizione di urina nella gabbia di prova e applicare acqua sulla parete opposta. Come fatto per altri test, lasciare che l'animale esplori.
Per due minuti. Successivamente, trasferire l'animale in una gabbia pulita per topi. Dopo che tutti gli animali hanno sperimentato la concentrazione più bassa, pulire tutte le pareti della gabbia di prova e ripetere il test su ciascun topo utilizzando l'urina con la concentrazione immediatamente successiva.
Continuare questo processo fino a quando non viene testata l'urina pura. Dopo aver raccolto tutti i dati di un esperimento, aprire i video in ImageJ per le regolazioni e i dettagli di elaborazione, i cui passaggi sono forniti nel protocollo testuale utilizzando i protocolli descritti. Due linee knockout diverse.
I gruppi B e C sono stati confrontati con il gruppo di controllo derivante dalla stessa nidiata, gruppo A. Un test T di Student non direzionale con varianza uguale o disuguale ha confrontato il tempo trascorso tra l'odore e l'acqua all'interno dei genotipi. Confrontare il comportamento tra i genotipi utilizzando un'analisi della varianza unidirezionale (one-way ANOVA). Entrambi i gruppi sperimentali, B e C, non hanno mostrato preferenza per l'odore attraente. Nel test di evitamento, la risposta verso l'odore repellente dell'acido due metil butirrico è stata quella prevista per i gruppi A e B, ma il gruppo C non ha mostrato comportamento di evitamento verso questo odore.
Nel test di sensibilità, la soglia di attrazione è stata ottenuta sottraendo il tempo trascorso con l'urina dal tempo trascorso con l'acqua, preferendo l'urina rispetto all'acqua a una diluizione da uno a 1000. Mentre entrambi i gruppi sperimentali, B e C, necessitavano di una concentrazione 100 volte maggiore per mostrare una preferenza. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un paio d'ore se effettuata correttamente; successivamente, seguendo questa procedura, è possibile applicare altri metodi come l'apprendimento olfattivo e l'estinzione per studiare la plasticità olfattiva e l'apprendimento.
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Panoramica
Questo studio presenta un test olfattivo semplice progettato per i topi, che consente la valutazione della discriminazione olfattiva, della preferenza, dell'avversione e della sensibilità a un odore nuovo rispetto all'acqua. Il metodo è efficiente per un singolo sperimentatore e si basa su un'analisi video assistita da computer.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Analisi del Comportamento
- Test Olfattivo
Sfondo
- L'esperimento ha lo scopo di valutare i comportamenti olfattivi innati nei topi.
- Prevede l'esposizione a un odore nuovo e a un controllo neutro (acqua).
- Il comportamento viene registrato e analizzato per determinare preferenze o avversioni.
- Questo metodo utilizza un ambiente familiare per i topi, aumentando l'affidabilità dei risultati.
Scopo dello studio
- Valutare la discriminazione olfattiva nei topi.
- Valutare i comportamenti di preferenza e di evitamento olfattivo.
- Misurare la sensibilità olfattiva a odori nuovi.
Metodi Utilizzati
- I topi sono esposti a un nuovo attrattore o stimolante e all'acqua.
- Le sessioni comportamentali sono registrate mediante una telecamera.
- L'analisi video viene eseguita utilizzando il software Image J con macro.
- I risultati vengono analizzati per determinare il tempo trascorso con ciascun odore.
Risultati principali
- I risultati indicano comportamenti di preferenza o di evitamento verso odori rispetto all'acqua.
- Le risposte comportamentali variano tra diversi genotipi.
- Il metodo consente un'impostazione rapida e il completamento degli esperimenti.
- L'analisi assistita da computer migliora l'accuratezza dei risultati.
Conclusioni
- Il test olfattivo è un metodo affidabile per valutare il comportamento olfattivo nei topi.
- L'utilizzo di un'arena familiare semplifica il processo sperimentale.
- Questo approccio può risultare utile per vari studi comportamentali in neuroscienze.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La disfunzione olfattiva è un biomarcatore precoce nei modelli di malattie neurodegenerative, rendendo fondamentali saggi affidabili dell'olfatto nei roditori per la validazione degli obiettivi nella scoperta di farmaci per il sistema nervoso centrale. Questo metodo consente una valutazione rapida e riproducibile della percezione olfattiva innata e della sensibilità, senza restrizione di cibo o acqua, supportando lo screening ad alto rendimento di interventi genetici o farmacologici. Quantificando le risposte comportamentali ad attrattanti, avversivi e soglie di sensibilità, fornisce un approccio meccanicistico per ridurre i rischi associati a bersagli coinvolti nella disfunzione della rete olfattiva.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche collegando genotipo a comportamento olfattivo, consentendo la validazione funzionale di bersagli nei percorsi olfattivi.
- Valore operativo: Utilizza ambienti familiari e richiede un'abituazione minima, riducendo la variabilità indotta dallo stress e migliorando la riproducibilità del saggio tra diversi genotipi.
- Valore predittivo: Rileva modifiche nella preferenza o nell'avversione agli odori in modelli knock-out, supportando una precoce riduzione del rischio per bersagli associati a indicazioni neurodegenerative o psichiatriche.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera metriche quantitative del tempo trascorso mediante analisi computerizzata con ImageJ, consentendo un confronto oggettivo delle risposte agli odori tra diversi gruppi sperimentali.
- Valore operativo: Richiede soltanto gabbie standard, lettiera, odori e una videocamera, permettendo un'implementazione scalabile nei laboratori di scoperta senza l'uso di attrezzature specializzate.
- Valore predittivo: Permette la caratterizzazione dose-risposta nei test di sensibilità, supportando l'ottimizzazione dei composti principali mediante la definizione di intervalli di concentrazione efficaci per i comportamenti indotti da odoranti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Si allinea ai deficit olfattivi umani come biomarcatori prodromici, aumentando la rilevanza traslazionale dei modelli murini nella ricerca sulle malattie neurodegenerative.
- Valore operativo: Permette test di sensibilità longitudinali mediante serie di diluizioni seriali, supportando il monitoraggio della progressione negli studi preclinici di efficacia.
- Valore predittivo: Identifica soglie genotipo-specifiche per il rilevamento degli odori, facilitando la stratificazione dei pazienti e la selezione di bersagli allineati ai biomarcatori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del capostazione, fornendo letture comportamentali che informano decisioni di avanzamento o interruzione prima dell'investimento sul composto.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi misurando la discriminazione olfattiva innata e le preferenze, chiarificando la funzione genica nei percorsi di elaborazione sensoriale.
- Screening: Fornisce output standardizzati e quantitativi (tempo nelle zone con odore rispetto a quelle con acqua) che permettono confronti affidabili degli effetti di composti o genotipi.
- Analisi: L'analisi assistita da computer fornisce misurazioni riproducibili basate su soglie, che supportano il confronto statistico tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando la perdita di sensibilità olfattiva, un tratto predittivo della neurodegenerazione clinica.
- Riutilizzo aziendale: Riutilizzabile in diversi tipi di test (preferenza, evitamento, sensibilità) e ceppi di topi, funzionando come capacità di piattaforma piuttosto che come saggio monouso.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nella funzione dei circuiti olfattivi.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso tempi di esposizione fissi, analisi video in cieco e controlli interni con acqua.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo un rapido triage degli obiettivi mediante fenotipizzazione comportamentale a basso costo e ad alta riproducibilità.
- Impatto sul portafoglio: Informa le decisioni di avanzamento corrette per il rischio identificando gli obiettivi la cui modulazione ripristina o riproduce fenotipi olfattivi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel manipolaggio dei roditori, nell'osservazione del comportamento e nell'uso di software di tracciamento video di base (ImageJ).
- È dipendente da un'illuminazione costante, da una posizione fissa della telecamera (58 cm sopra la gabbia) e dalla preparazione degli odoranti (ad esempio diluizioni di olio di burro di arachidi, serie di diluizioni di urina).
- Necessita di una standardizzazione tra i gruppi di lavoro riguardo ai protocolli di abituazione e di un'analisi in cieco per ridurre al minimo i bias dell'operatore.
- L'adattamento a diversi sistemi modello richiede la validazione della rilevanza degli odoranti (ad esempio feromoni o sostanze avverse specifici per specie).
- Limite pratico: la sensibilità del saggio dipende da una corretta somministrazione e rimozione degli odoranti tra un test e l'altro per prevenire contaminazioni incrociate, in particolare durante i test di sensibilità.
