Name: Semplice e assistita da computer Olfattivo Test per Mice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Impara a valutare la discriminazione olfattiva nei topi con un test semplice e assistito da computer. Questo metodo analizza preferenze, evitamenti e sensibilità agli odori utilizzando ImageJ per l'elaborazione video.

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Questo lavoro è finanziato dalla Fondazione Nazionale Svizzera (31_138429) e dalla Fondazione Synapsis per il sostegno alla ricerca sul morbo di Alzheimer.

Tutte le procedure di animali sono in conformità con la Direttiva UE 2010/63 / UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e sono approvati dalla locale comitato Animal Care (Cantone di Friburgo, Svizzera). 1. Preparazione degli animali <ol><li> Animali da esperimento <ol><li> Effettuare esperimenti su wild type maschio adulto e topi transgenici (C57BL / 6 di fondo) di 3-5 mesi di età. I tre gruppi di topi corrispondono a controlli di tipo littermate selvatici (gruppo A, Jagged1 flox / flox 19) e due linee del mouse condizionali KO (gruppo B, e C Jagged1ncKO, Jagged1gcKO). </li><li> Topi Camera in condizioni standard di laboratorio in una stanza ventilata, con un ciclo di buio / luce controllata 12 ore e di fornire cibo e acqua ad libitum. </li></ol></li></ol> 2. Setup sperimentale <ol><li> Arena sperimentale <ol><li> Per l&#39;arena sperimentale, utilizzare una gabbia del mouse sterilizzato pulito (36 centimetri di lunghezza x 20,5 centimetri di altezza di larghezza x 13.5 cm) (Figura 1A). </li><li> Assegnare ad ogni mouse per una gabbia numerata con biancheria fresca, alto 3 cm. Se gabbie vengono riutilizzati, come nella prova di sensibilità odore, adottare le seguenti misure per evitare la contaminazione incrociata tra odori e topi. <ol><li> Segnare il lato acqua. </li><li> Pulire le pareti strette delle gabbie con due carte tissue spruzzati con etanolo al 70%, una per ogni lato. </li><li> Accumulano gabbie secondo il genotipo dei topi e memorizzare temporaneamente sotto una cappa laminare. </li></ol></li></ol></li><li> Macchina fotografica <ol><li> Montare una fotocamera su un treppiede personalizzato con l&#39;obiettivo a 58 cm dal fondo della gabbia (Figura 1A). Fissare la posizione del treppiede e la gabbia e delimitare con segni per consentire alla telecamera di essere centrato sulla parte superiore della gabbia. </li><li> Video su 320 pixel x 240 pixel, 15,08 fotogrammi al secondo come file MOV registrare. </li></ol></li><li> Odori <ol><li> Risospendere il scents, quando indicato, nel solvente in cui siano solubili. </li><li> Per il test di preferenza burro di arachidi uso. Risospendere il burro di arachidi in olio di arachidi (10% w / v). </li><li> Per l&#39;uso di test evitamento acido puro 2-metil (2-MB) (98%). </li><li> Per la prova di sensibilità, usare urina femminile dalla stessa colonia mouse e sfondo (C57BL / 6). <ol><li> Per comodità raccogliere le urine 1-2 giorni prima della prova olfattiva. Trattenere e tenere premuto il mouse sotto il cofano con il suo ventre sopra la griglia gabbia. Sotto la griglia gabbia collocare un piatto di plastica petri per raccogliere le gocce di urina. </li><li> Raccogliere l&#39;urina da ciascuna femmina in una provetta da 1,5 ml e miscelare tutti i campioni di urina per normalizzare la variabilità tra animali. Conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Il giorno dell&#39;esperimento, scongelare l&#39;urina ed eseguire 4 diluizioni in acqua bidistillata a un fattore di diluizione di 10 (1:10, 1: 100, 1: 1.000, 1: 10.000). </li></ol></li></ol></li></ol>3. Test olfattiva Nota: in questo protocollo gli odori sono stati volutamente scelti, che sono percepiti come attrattivi forti (burro di arachidi e di urina femminile) o forte repellente (acido 2-MB) 15. È importante effettuare la preferenza e test di sensibilità a piacevoli odori prima della prova di scampo per eliminare la possibilità di eventuali interferenze con il comportamento olfattiva. Tuttavia, per ragioni di semplicità, in questo lavoro, la preferenza e l&#39;elusione di prova saranno entrambi descritti sotto il test di percezione. Ogni sessione comportamentale inizia con una fase di assuefazione. <ol><li> Fase assuefazione <ol><li> Posto l&#39;animale in gabbia assegnato pulito e lasciate esplorare per 5 minuti (Figura 1B). Poiché l&#39;ambiente della gabbia sperimentale è familiare alla gabbia a casa, questo breve periodo di tempo è sufficiente per consentire assuefazione. </li><li> Se il test di sensibilità viene completato in un giorno, effettuare assuefazione sola volta prima della application di alta dell&#39;odore diluito. Se il test di sensibilità viene eseguita in giorni diversi, ogni giorno è necessaria una fase di assuefazione su una nuova gabbia pulita. </li></ol></li><li> Percezione di prova <ol><li> Dopo assuefazione, attivare la fotocamera e subito pipetta 60 ml di profumo gradevole (burro di arachidi) e 60 ml di profumo neutro (acqua di rubinetto) sulle pareti opposte della gabbia a circa 10 cm dal fondo (Figura 1C). </li><li> Lasciate che il mouse esplorare gli odori per 2 minuti (Figura 1D). Successivamente, spegnere la fotocamera. </li><li> A questo punto, procedere con la successiva del mouse a partire dalla fase di assuefazione. Eseguire il test di evitamento esattamente nello stesso modo, applicando 60 ml di odore repellente (acido 2-MB) e 60 ml di acqua. </li></ol></li><li> Test di sensibilità <ol><li> Valutare la soglia attrazione di topi maschi a concentrazioni crescenti di urina femminile nel seguente ordine: 1: 10.000; 1: 1.000; 1: 100; 1:10 e nelle urine puro. </li><li> Dopo assuefazione, esporre ogni topo alla più alta diluizione pipettati dallo sperimentatore come precedentemente descritto in 3.2.1. </li><li> Registrare il comportamento esplorativo di urina contro acqua, entro un arco di tempo 2 minuti su una videocamera. Dopo che tutte le coorti di topi sono testati per la più alta diluizione (1: 10.000), esporre a una maggiore concentrazione di urina, come sopra indicato. </li></ol></li></ol> 4. analisi post-hoc dei dati Nota: Tutti i test comportamentali descritti sono trattati post hoc seguendo le istruzioni di analisi dei dati. <ol><li> Aprire MOV file in ImageJ per i sistemi Windows <ol><li> Installare Quick Time per Java utilizzando le impostazioni personalizzate da http://www.apple.com/quicktime/download. </li><li> Installare il plugin Quick Time dal sito ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html). </li><li> Importare il QTJava.zip (C: Program Files QuickTime QTSystem) nei extens bibliotecaioni di ImageJ (.ImageJ jre lib ext). </li><li> Copiare anche il QTJava.zip nella cartella plugins e rinominarlo come QTJava.jar. </li><li> Installare i sei script allegati nella cartella macro (ImageJ plugins Macros). </li><li> Aprire ImageJ e compilare ed eseguire il plugin Quick Time, da allora in poi vicino ImageJ. </li><li> Riaprire ImageJ e aprire il file MOV utilizzando File&gt; Importa&gt; utilizzando Quick Time. </li></ol></li><li> Regolazione Video <ol><li> Una volta che il file video viene aperto in ImageJ, tagliare il video per ottenere una costante esplorazione 2 min dal tempo sperimentatore ha pipettato i odoranti nella gabbia (T0). Identificare il telaio corrispondente al T0 e rimuovere i fotogrammi precedenti utilizzando incrementi di 1 (ImageJ immagine Pile ToolsSlice rimozione). Utilizzare lo stesso comando per eliminare tutti i fotogrammi che superano l&#39;esplorazione 2 min. </li><li> Assicurarsi che la gabbia sia centrato e se necessario utilizzare l&#39;Immagine&gt; Trasforma&gt; comando Ruota per allinearlo. </li></ol></li><li> Vedasio Elaborazione Nota: l&#39;elaborazione video è interamente assistita da computer e utilizza i comandi macro che accompagnano questo articolo. <ol><li> Al fine di limitare l&#39;area sulla gabbia di un x 218 pixel dimensioni 127 pixel eseguire la Fase 1 macro dal Plugin&gt; Macro&gt; Esegui comando. Spostare il rettangolo fisso sopra la gabbia (Figura 2, punto 1). </li><li> Raccolto l&#39;area della gabbia sulla regione di interesse (ROI) utilizzando la Fase 2 macro (Figura 2, Passaggio 2). </li><li> Utilizzare la Fase 3 macro per estrarre l&#39;immagine del mouse dallo sfondo assegnando un segnale di soglia, despeckling e filtrando la varianza del segnale. I valori di uscita nel grafico sull&#39;asse Z indicano i valori medi di grigio, corrispondente all&#39;intensità dell&#39;ombra del mouse spostano all&#39;interno della ROI della &quot;camera dell&#39;acqua&quot; durante l&#39;esplorazione 2 min. Copiare i risultati in un foglio di lavoro denominato secondo il ROI in un foglio di calcolo (Figura 2, punto 3). </li><li> Utilizzare il Passo 4 macroestrarre i valori medi grigi del mouse nella ROI &quot;camera di odore&quot;. Copiare i risultati in un foglio di lavoro denominato secondo il ROI nello stesso file foglio di calcolo come a 4.3.3 (Figura 2, punto 4). </li><li> Al fine di limitare ulteriormente l&#39;analisi del movimento del mouse nella ROI &quot;perimetro acqua&quot; utilizzare la macro Passaggio 5. Copiare il risultato sul foglio di lavoro denominato in base al ROI nello stesso file foglio di calcolo come a 4.3.3 (Figura 2, punto 5). </li><li> Per limitare l&#39;analisi del movimento del mouse nella ROI &quot;odore perimetrale&quot; utilizzare la macro Passo 6. Copiare il risultato sul foglio di lavoro denominato in base al file ROI foglio di calcolo come a 4.3.3 (Figura 2, Procedimento 6). </li><li> Elaborare tutti i video e controllare la coerenza del numero di fotogrammi al animali. Qui, registrare tutti gli animali per 1.810 fotogrammi corrispondenti ad una sessione di esplorazione 2 min. </li><li> Per ciascun animale e per ogni ROI sorta telai con media va grigiolues maggiore di 0. Divide il numero di fotogrammi dai valori corrispondenti a 1 secondo e ottenere i secondi trascorsi in ogni ROI. </li></ol></li></ol> 5. Analisi statistica <ol><li> Per ogni prova di verificare l&#39;omogeneità della varianza all&#39;interno gruppi / genotipi con il test di Bartlett con la formula accessibile http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/. </li><li> Nella attrazione e l&#39;elusione di prova, effettuare confronti tra i tempi trascorsi con acqua contro odore entro un gruppo utilizzando test t di Student non direzionale assumendo varianze uguali o disuguali a seconda dei risultati del test di Bartlett. Confronto i tempi trascorsi con gli odori sottratto dal tempo trascorso con acqua tra le genotipi da ANOVA con test post-hoc di Bonferroni. </li><li> Nel test di sensibilità analizzare i confronti tra il tempo trascorso con l&#39;odore sottratto dal tempo trascorso con water tra i gruppi a una specifica diluizioni di urina da ANOVA con test post-hoc di Bonferroni. Confrontare la sensibilità tra i gruppi a crescenti concentrazioni di odori da 2-Way ANOVA con ripetizioni con test post-hoc di Bonferroni. </li><li> L&#39;interazione tra genotipi e trattamenti nella attrazione e l&#39;elusione di prova sono indagati da 2-way ANOVA con test post-hoc di Bonferroni. </li></ol>

<ol><li>Doty, R. L., Kamath, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influences+of+age+on+olfaction%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cognitive+Science%22%5BJournal%5D)">The influences of age on olfaction: a review.</a> Cognitive Science. 5, 20(2014).</li>
<li>Mesholam, R. I., Moberg, P. J., Mahr, R. N., Doty, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfaction+in+neurodegenerative+disease%3A+a+meta-analysis+of+olfactory+functioning+in+Alzheimer%E2%80%99s+and+Parkinson%E2%80%99s+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Olfaction in neurodegenerative disease: a meta-analysis of olfactory functioning in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases.</a> Archives of Neurology. 55 (1), 84-90 (1998).</li>
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<li>Alonso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Discrimination+Learning+Increases+the+Survival+of+Adult-Born+Neurons+in+the+Olfactory+Bulb%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Olfactory Discrimination Learning Increases the Survival of Adult-Born Neurons in the Olfactory Bulb.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10508-10513 (2006).</li>
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<li>Kobayakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+versus+learned+odour+processing+in+the+mouse+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb.</a> Nature. 450 (7169), 503-508 (2007).</li>
<li>Witt, R. M., Galligan, M. R., Despinoy, J., Segal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Behavioral+Testing+in+the+Adult+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (23), (2009).</li>
<li>Lee, A. W., Emsley, J. G., Brown, R. E., Hagg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+olfactory+sensitivity+and+apparent+speed+of+forebrain+neuroblast+migration+in+three+inbred+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Marked differences in olfactory sensitivity and apparent speed of forebrain neuroblast migration in three inbred strains of mice.</a> Neuroscience. 118 (1), 263-270 (2003).</li>
<li>Page, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computerized+assessment+of+social+approach+behavior+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Computerized assessment of social approach behavior in mouse.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 3, 48(2009).</li>
<li>Nyfeler, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jagged1+signals+in+the+postnatal+subventricular+zone+are+required+for+neural+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Jagged1 signals in the postnatal subventricular zone are required for neural stem cell self-renewal.</a> Embo J. 24 (19), Available from:
	
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=16163386"">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=16163386"</a> 3504-3515 (2005).</li>
<li>Tong, M. T., Peace, S. T., Cleland, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+mechanisms+of+olfactory+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Properties and mechanisms of olfactory learning and memory.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).</li>
<li>Steinlechner, S. Chapter 2.12 - Biological Rhythms of the Mouse. The Laboratory Mouse (Second Edition). , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123820082000179">http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123820082000179</a> 383-407 (2012).</li>
<li>Corthell, J., Stathopoulos, A., Watson, C., Bertram, R., Trombley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Bulb+Monoamine+Concentrations+Vary+with+Time+of+Day%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Olfactory Bulb Monoamine Concentrations Vary with Time of Day.</a> Neuroscience. 247, 234-241 (2013).</li>
<li>Lehmkuhl, A. M., Dirr, E. R., Fleming, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+assays+for+mouse+models+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Olfactory assays for mouse models of neurodegenerative disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51804(2014).</li>
</ol>

Non vi è alcun conflitto di interessi.

I test proposti in questo protocollo permette di valutare diversi aspetti del comportamento olfattivo innato nei topi: percezione di odori, di discriminazione tra gli odori contro l&#39;acqua e la sensibilità agli odori. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi odore secondo la preferenza e la scala evitamento precedentemente dimostrato 15. Poiché il protocollo si basa sull&#39;attività esplorativa è importante che i topi non presentano deficit motori o ansia che possono influenzare il loro moviment...

Olfatto è una delle funzioni sensoriali più sviluppate ed importanti nei mammiferi. Qualsiasi riduzione di valore di attività olfattiva possono influenzare l&#39;assunzione di cibo, comportamento sociale e, nel peggiore dei casi, anche la sopravvivenza. Negli esseri umani, il deterioramento olfattivo è l&#39;età dipendente 1 ed è considerato un forte predittore di disturbi neurologici 2-6. Il test di identificazione olfattiva sviluppato dalla University of Pennsylvania rappresenta attualmente uno dei più utilizzati, non invasive e quantificabili, test diagnostici che possono valutare i primi deficit neurologici 7 e prevedere con elevata probabilità la progressione della demenza 8,9. L&#39;accessibilità del sistema olfattivo e l&#39;importanza dell&#39;olfatto nei roditori, ha scatenato una linea intensa ricerca sulle funzioni meccanismi olfattivi sottostanti 10. Abbiamo precedentemente dimostrato che la perdita di funzione della recept segnalazioneo Notch1 colpisce evitamento olfattiva 11. In questo protocollo si usa topi privi del ligando segnalazione, Jagged1, in neuroni o glia per studiare le prestazioni olfattiva. L&#39;olfatto innata è definito da tre parametri come la percezione, discriminazione tra odori e sensibilità olfattiva 4. Test olfattivo in roditori può essere fatto in una varietà di modi e alcuni studi comportamentali fare uso di olfactometers, che forniscono l&#39;odore all&#39;animale in una specifica concentrazione di vapore e in un lasso di tempo preciso 12 - 14. Tuttavia, questo strumentazione è costoso e può essere disponibile solo in strutture specializzate. Nel nostro lavoro, forniamo un protocollo semplice, veloce e riproducibile test olfattivo, che viene effettuata con profumi volatili. Le prove descritte percezione misura a un attrattivo o un odore repellente e valutare la discriminazione tra il profumo e il 11,15,16 acqua. Utilizzando la stessa messa a punto, we può anche misurare la sensibilità ad un odore a diverse concentrazioni 16,17. L&#39;elaborazione video post-hoc assistita da computer, ispirato all&#39;opera di pagina e colleghi 18, fornisce i risultati imparziali, senza la necessità di accecamento sperimentale e consentendo una sola persona per svolgere l&#39;intero esperimento. Questo protocollo è destinato a fornire un punto di partenza per studiare il comportamento olfattiva nei topi.

<table><tbody><tr><td>Gabbia per topi</td><td>Italplast (Italia)</td><td>1144B</td><td>36 cm di lunghezza x 20,5 cm di larghezza x 13,5 cm di altezza</td></tr><tr><td>Lettiera in legno scheggiato</td><td>Abedd (Austria)</td><td>LTE E-001</td><td>3 cm di altezza</td></tr><tr><td>Burro di arachidi</td><td>Migros (Svizzera)</td><td>NA</td><td>1:10</td></tr><tr><td>2-Metilbutirrico</td><td>Sigma Aldrich (Svizzera)</td><td>W269514</td><td></td></tr><tr><td>Pura urina femminile proveniente da femmine fertili dello stesso ceppo di topo</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Dilution series</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Olympus (US)</td>File <td>MOV</td> <td>Camedia C-8080</td></tr><tr><td>Quicktime per Java (Windows)</td><td>Apple (USA)</td><td>NA</td><td>plugin video per la visualizzazione di file MOV</td></tr><tr><td>ImageJ per Windows</td><td>NIH (USA)</td><td>NA</td><td>Elaborazione/Analisi video</td></tr></tbody></table>

semplice e assistita da computer olfattivo test per mice

Simple and Computer-assisted Olfactory Testing for Mice

L&#39;olfatto è altamente conservata tra le specie ed è necessario per la riproduzione e la sopravvivenza. Negli esseri umani, l&#39;olfatto è anche uno dei sensi che viene colpito con l&#39;invecchiamento ed è un forte predittore di malattie neurodegenerative. Così, test olfattivo è usato come un metodo diagnostico non invasivo per rilevare deficit neurologici presto. Al fine di comprendere i meccanismi alla base olfattiva suscettibilità rete, ricerca olfattiva nei roditori ha preso slancio negli ultimi dieci anni. Qui, presentiamo un metodo semplice, efficiente e riproducibile test olfattivo tempo di percezione dell&#39;odore innata e sensibilità nei topi senza la necessità di qualsiasi restrizione cibo o acqua prima. I test vengono eseguiti in un ambiente familiare per i topi, richiedono solo i profumi e 2 minuti a sessione di esposizione odorizzante. Viene eseguita l&#39;analisi post-hoc, utilizzando i comandi del computer-assistita in ImageJ e può essere, quindi,, Effettuata dall&#39;inizio alla fine da un ricercatore. Questo protocollo non richiede alcun hardware o configurazione speciale ed è indicato per qualsiasi laboratorio interessati a testare percezione olfattiva e sensibilità.

Il test misura la percezione attrazione di burro di arachidi e di evitare di acido 2-MB. Tre gruppi di topi sono testati e il tempo trascorso in &quot;odore perimetrale&quot; vengono quantificati rispetto all&#39;acqua. Nel test di preferenza, il gruppo di controllo A visualizza preferenza significativa per l&#39;odore rispetto all&#39;acqua (t 8 = 2.52, p &lt;0,05). D&#39;altra parte, il gruppo B non mostra alcuna attrazione significativa al burro di arachidi e passa più tempo con acqua (6 t = 3.2...

Presentiamo un test olfattivo semplice e imparziale nei topi. Con questo protocollo la discriminazione olfattiva, la preferenza, l'evitamento e la sensibilità a un nuovo odore rispetto all'acqua possono essere valutati in singole sessioni comportamentali. Questo metodo è indicato per un singolo sperimentatore e l'analisi si basa sull'elaborazione video assistita da computer.

Semplice e assistita da computer Olfattivo Test per Mice

Olfaction is highly conserved among species and is required for reproduction and survival.
In humans, olfaction is also one of the senses that is affected ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è testare la discriminazione olfattiva innata, la preferenza olfattiva o l'evitamento e la sensibilità olfattiva nei topi. Questo viene ottenuto esponendo il topo a un attrattore o stimolo nuovo e a un odore neutro, costituito dall'acqua. Nel frattempo, una videocamera registra la sessione comportamentale.Successivamente, il video viene analizzato con Image J utilizzando le macro fornite per ottenere i parametri relativi al tempo trascorso in presenza dell'odore e dell'acqua. I risultati mostrano il comportamento di preferenza o di evitamento verso gli odori rispetto all'acqua in diversi genotipi, in base all'analisi post hoc assistita dal computer. Il vantaggio principale del test olfattivo rispetto all'uso di un'arena dedicata per stimoli olfattivi è che utilizza un'arena familiare, consentendo quindi una rapida esecuzione e un montaggio semplice.Inoltre, utilizza un hardware economico; la procedura sarà dimostrata da Emmanuel Abry, studente del mio laboratorio. Per questo esperimento, utilizzare topi maschi di età compresa tra tre e cinque mesi, C57 neri, sei di tipo selvatico e topi transgenici. Questa dimostrazione utilizza due linee knockout e controlli appartenenti alla stessa nidiata.Per gli spazi sperimentali, utilizzare gabbie per topi pulite e sterilizzate con tre centimetri di lettiera. Successivamente, preparare l'allestimento della telecamera. Posizionarla a 58 centimetri sopra il fondo della gabbia su un supporto personalizzato per treppiede.Fare alcuni segni sul piano di lavoro per indicare la posizione in cui deve trovarsi la gabbia. Per un'immagine centrale, impostare la telecamera per registrare un video di 320 per 240 pixel a circa 15 fotogrammi al secondo. Per preparare il soggetto del test, avere a disposizione concentrazioni di ciascun odore conservate in solvente, ogni volta che possibile.Per il test di preferenza, preparare una soluzione al 10% peso in volume di burro di arachidi in olio di arachidi. Per il test di evitamento, utilizzare una soluzione al 98% di acido butirrico metilico. Per il test di sensibilità, raccogliere l'urina di femmine da un topo della stessa linea da uno a due giorni prima del test.Trattenere una femmina con il ventre sopra la griglia della gabbia e raccogliere gocce della sua urina in una capsula di plastica. Raccogliere campioni da diverse femmine per la normalizzazione. A causa della variabilità individuale, unire tutti i campioni in una provetta da 1,5 millilitri e conservarli a meno 20 gradi Celsius.Per iniziare, abituare gli animali posizionandone uno in una gabbia pulita e lasciandolo esplorare. Per cinque minuti, l'ambiente della gabbia di prova deve essere simile a quello della gabbia di casa. Ripetere la fase di abituazione una volta ogni giorno di prova; al termine del periodo di abituazione, iniziare la registrazione e pipettare 60 microlitri di una fragranza piacevole.In questo caso, applicare il burro di arachidi su una parete e, sulla parete opposta, pipettare la stessa quantità di acqua. Applicare alcune gocce di una sostanza inodore a circa 10 centimetri di altezza su ciascuna parete. Lasciare ora l'animale esplorare per due minuti, quindi interrompere la registrazione e riportare il topo nella sua gabbia di provenienza.Ripetere il processo con ogni topo da testare, utilizzando sempre gabbie di prova nuove. Da tre a cinque giorni dopo aver eseguito tutti i test di preferenza, effettuare il test di evitamento utilizzando una nuova gabbia di prova.Per ogni topo, eseguire il test di evitamento. Come nel test di attrazione, sostituire soltanto la sostanza odorosa piacevole con quella sgradevole, ovvero l'acido due metil butirrico. Per il test di sensibilità, una gabbia può essere riutilizzata tra una prova e l'altra per lo stesso topo.Quindi segnare il lato dell'acqua della gabbia e prepararsi a pulire le pareti corte con carta imbevuta di etanolo al 70% tra un test e l'altro. Nel giorno dell'esperimento, preparare quattro concentrazioni dell'urina mediante una serie di diluizioni decrescenti. Utilizzando acqua bidistillata, come nel test di evitamento, abituare ciascun animale alla propria gabbia di prova per cinque minuti.Quindi esporre ogni topo all'urina alla diluizione più alta inizialmente, ovvero uno a 10.000. Durante la registrazione, applicare la diluizione di urina nella gabbia di prova e applicare acqua sulla parete opposta. Come fatto per altri test, lasciare che l'animale esplori.Per due minuti. Successivamente, trasferire l'animale in una gabbia pulita per topi. Dopo che tutti gli animali hanno sperimentato la concentrazione più bassa, pulire tutte le pareti della gabbia di prova e ripetere il test su ciascun topo utilizzando l'urina con la concentrazione immediatamente successiva.Continuare questo processo fino a quando non viene testata l'urina pura. Dopo aver raccolto tutti i dati di un esperimento, aprire i video in ImageJ per le regolazioni e i dettagli di elaborazione, i cui passaggi sono forniti nel protocollo testuale utilizzando i protocolli descritti. Due linee knockout diverse.I gruppi B e C sono stati confrontati con il gruppo di controllo derivante dalla stessa nidiata, gruppo A. Un test T di Student non direzionale con varianza uguale o disuguale ha confrontato il tempo trascorso tra l'odore e l'acqua all'interno dei genotipi. Confrontare il comportamento tra i genotipi utilizzando un'analisi della varianza unidirezionale (one-way ANOVA). Entrambi i gruppi sperimentali, B e C, non hanno mostrato preferenza per l'odore attraente. Nel test di evitamento, la risposta verso l'odore repellente dell'acido due metil butirrico è stata quella prevista per i gruppi A e B, ma il gruppo C non ha mostrato comportamento di evitamento verso questo odore.Nel test di sensibilità, la soglia di attrazione è stata ottenuta sottraendo il tempo trascorso con l'urina dal tempo trascorso con l'acqua, preferendo l'urina rispetto all'acqua a una diluizione da uno a 1000. Mentre entrambi i gruppi sperimentali, B e C, necessitavano di una concentrazione 100 volte maggiore per mostrare una preferenza. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un paio d'ore se effettuata correttamente; successivamente, seguendo questa procedura, è possibile applicare altri metodi come l'apprendimento olfattivo e l'estinzione per studiare la plasticità olfattiva e l'apprendimento.

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