Semplice e assistita da computer Olfattivo Test per Mice
15 giugno 2015
Presentiamo un test olfattivo semplice e imparziale nei topi. Con questo protocollo la discriminazione olfattiva, la preferenza, l'evitamento e la sensibilità a un nuovo odore rispetto all'acqua possono essere valutati in singole sessioni comportamentali. Questo metodo è indicato per un singolo sperimentatore e l'analisi si basa sull'elaborazione video assistita da computer.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è testare la discriminazione olfattiva innata, la preferenza olfattiva o l'evitamento e la sensibilità olfattiva nei topi. Ciò si ottiene esponendo il topo a un nuovo attrattivo o ricorrente e a un odore neutro, che è l'acqua. Nel frattempo, una videocamera registra la sessione comportamentale.
Successivamente, il video viene analizzato nell'immagine J utilizzando le macro fornite per ottenere il tempo trascorso nei parametri dell'odore e dell'acqua. I risultati mostrano la preferenza o il comportamento di evitamento degli odori rispetto all'acqua tra i diversi genotipi sulla base dell'analisi assistita da computer post hoc. Il vantaggio principale del test olfattivo rispetto all'uso di un'arena e di un'arena dedicata è che utilizza un'arena familiare ed è quindi di completamento rapido e configurazione semplice.
Inoltre, utilizza hardware poco costoso che dimostra che la procedura sarà Emmanuel Abry, secondo lo studente nel mio laboratorio. Per questo esperimento, utilizzare topi maschi da tre a cinque mesi, C 57 neri, sei wild type e transgenici. Questa dimostrazione utilizza due linee di sfondamento e controlli del compagno di cucciolata.
Per le arene sperimentali, utilizzare gabbie per topi pulite e sterilizzate con tre centimetri di lettiera. Quindi, prepara la configurazione della fotocamera. Posizionalo a 58 centimetri dal pavimento della gabbia su un supporto per treppiede personalizzato.
Fai dei segni sul bancone per indicare dove dovrebbe essere la posizione della gabbia. Per un'immagine centrale, impostare la fotocamera in modo che registri un video di 320 x 240 pixel a circa 15 fotogrammi al secondo. Per preparare l'esecutore del test, conserva i concentrati di ogni profumo nel solvente quando possibile.
Per il test delle preferenze, preparare una soluzione al 10% in peso in volume di burro di arachidi in olio di arachidi. Per il test di evitamento, avere una soluzione al 98% di acido metilbutirrico. Per il test di sensibilità, raccogliere l'urina femminile da un topo dello stesso ceppo uno o due giorni prima del test.
Trattieni una femmina con la pancia sopra la griglia della gabbia e raccogli le gocce della sua urina in un piatto di plastica. Raccogli campioni da diverse femmine per normalizzare. Per una variabilità individuale, estrarre tutti i campioni in una provetta da 1,5 millilitri e conservarla a meno 20 gradi Celsius.
Per iniziare, abituare gli animali, metterne uno in una gabbia pulita e lasciarlo esplorare. Per cinque minuti l'ambiente della gabbia di prova dovrebbe essere simile a quello della gabbia di casa. Ripetere la fase di assuefazione una volta ogni giorno di test, quando il periodo di assuefazione è terminato, avviare la registrazione e pipettare 60 microlitri di un gradevole profumo.
In questo caso, burro di arachidi su una parete sulla parete opposta, pipettare la stessa quantità di acqua. Un profumo neutro, applicare le gocce a circa 10 centimetri su ogni parete. Ora lascia che l'animale esplori per due minuti, quindi interrompi la registrazione e riporta il topo nella sua gabbia di casa.
Ripetere il processo con ogni mouse da testare. Utilizzo sempre di nuove gabbie di prova. Da tre a cinque giorni Dopo aver eseguito tutti i test di preferenza, eseguire il test di evitamento utilizzando una nuova gabbia di prova.
Per ogni mouse, eseguire il test di evitamento. Come il test di attrazione, sostituisci solo il profumo gradevole con il profumo di evitamento, che è l'acido butirrico a due metili. Per il test di sensibilità, una gabbia può essere riutilizzata tra le prove per lo stesso topo.
Quindi segna il lato dell'acqua della gabbia e preparati a pulire le pareti corte con carta imbevuta di etanolo al 70% tra una prova e l'altra. Il giorno dell'esperimento, fare quattro concentrazioni di urina con la serie di diluizione decupla. Utilizzando acqua distillata doppia, come nel test di evitamento, abituare ogni animale alla sua gabbia di prova per cinque minuti.
Quindi esporre ogni topo all'urina alla diluizione più alta all'inizio, che è da uno a 10.000. Durante la registrazione, applicare la diluizione delle urine sulla gabbia del test e applicare acqua sulla parete opposta. Come fatto per altri test, lascia che l'animale esplori.
Per due minuti. Successivamente, trasferisci l'animale in una gabbia per topi pulita. Dopo che tutti gli animali hanno sperimentato la concentrazione più bassa, pulire tutte le pareti della gabbia di prova e ripetere il test su ciascun topo utilizzando l'urina successiva più concentrata.
Continua questo processo fino a quando l'urina pura non viene testata. Dopo aver raccolto tutti i dati per un esperimento, aprire i video nell'immagine J per la regolazione e l'elaborazione, i cui dettagli sono forniti nel protocollo di testo utilizzando i protocolli descritti. Due diverse linee di knockout.
I gruppi B e C sono stati confrontati con i controlli del gruppo A.A del gruppo T non direzionale dello studente con varianza uguale o disuguale confronta il tempo trascorso tra l'odore e l'acqua all'interno dei genotipi. Confrontare il comportamento tra i genotipi utilizzando un inova unidirezionale. Entrambi i gruppi sperimentali, B e C, non hanno mostrato alcuna preferenza per l'odore attrattivo Nel test di evitamento, la risposta verso l'odore repulsivo di acido metilbutirrico è stata quella prevista per i gruppi A e B, ma il gruppo C non ha mostrato alcun comportamento di evitamento a questo odore.
Nel test di sensibilità, la soglia di attrazione è stata ottenuta sottraendo il tempo trascorso con l'urina dal tempo trascorso con l'acqua, l'urina preferita all'acqua con una diluizione di uno a 1000. Mentre entrambi i gruppi sperimentali, B e c, avevano bisogno di una concentrazione 100 volte maggiore per mostrare una preferenza. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un paio d'ore se eseguita correttamente, quindi seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'apprendimento olfattivo e l'estinzione per indagare la plasticità olfattiva e l'apprendimento.
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Panoramica
Questo studio presenta un semplice test olfattivo progettato per i topi, che consente la valutazione della discriminazione olfattiva, della preferenza, dell'evitamento e della sensibilità a un nuovo odore rispetto all'acqua. Il metodo è efficiente per un singolo sperimentatore e si basa sull'analisi video assistita da computer.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Analisi comportamentale
- Test olfattivo
Sfondo
- Lo scopo dell'esperimento è valutare i comportamenti olfattivi innati nei topi.
- Comporta l'esposizione a un nuovo odore e a un controllo neutro (acqua).
- Il comportamento viene registrato e analizzato per determinare preferenze o avversioni.
- Questo metodo utilizza un ambiente familiare per i topi, migliorando l'affidabilità dei risultati.
Scopo dello studio
- Valutare la discriminazione olfattiva nei topi.
- Valutare i comportamenti di preferenza e di evitamento olfattivo.
- Misurare la sensibilità olfattiva a nuovi odori.
Metodi utilizzati
- I topi sono esposti a un nuovo attrattivo o appellante e all'acqua.
- Le sessioni comportamentali vengono registrate utilizzando una videocamera.
- L'analisi video viene eseguita utilizzando il software Image J con macro.
- I risultati vengono analizzati per determinare il tempo trascorso con ogni odore.
Principali risultati
- I risultati indicano comportamenti di preferenza o evitamento verso gli odori rispetto all'acqua.
- Le risposte comportamentali variano tra i diversi genotipi.
- Il metodo consente una rapida configurazione e completamento degli esperimenti.
- L'analisi assistita da computer migliora l'accuratezza dei risultati.
Conclusioni
- Il test olfattivo è un metodo affidabile per valutare il comportamento olfattivo nei topi.
- L'utilizzo di un'arena familiare semplifica il processo sperimentale.
- Questo approccio può essere vantaggioso per vari studi comportamentali in neuroscienza.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Olfactory dysfunction is an early biomarker in neurodegenerative disease models, making reliable rodent olfaction assays critical for target validation in CNS drug discovery. This method enables rapid, reproducible assessment of innate odor perception and sensitivity without food/water restriction, supporting high-throughput screening of genetic or pharmacological interventions. By quantifying behavioral responses to attractants, aversants, and sensitivity thresholds, it provides mechanistic de-risking for targets implicated in olfactory network dysfunction.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking genotype to olfactory behavior, enabling functional validation of targets in olfactory pathways.
- Operational Value: Uses familiar environments and minimal habituation, reducing stress-induced variability and improving assay reproducibility across genotypes.
- Predictive Value: Detects altered odor preference or avoidance in knockout models, supporting early de-risking of targets associated with neurodegenerative or psychiatric indications.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative time-spent metrics via computer-assisted ImageJ analysis, enabling objective comparison of odor responses across experimental groups.
- Operational Value: Requires only standard cages, bedding, scents, and a video camera, allowing scalable implementation in discovery labs without specialized equipment.
- Predictive Value: Supports dose-response characterization in sensitivity testing, informing lead optimization by defining effective concentration ranges for odorant-evoked behaviors.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with human olfactory deficits as prodromal biomarkers, enhancing translational relevance of mouse models in neurodegenerative disease research.
- Operational Value: Enables longitudinal sensitivity testing through serial dilution series, supporting progression tracking in preclinical efficacy studies.
- Predictive Value: Identifies genotype-specific thresholds for odor detection, aiding in patient stratification and biomarker-aligned target selection.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing behavioral readouts that inform go/no-go decisions prior to compound investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring innate olfactory discrimination and preference, clarifying gene function in sensory processing pathways.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (time in odor vs. water zones) that enable reliable comparison of compound or genotype effects.
- Analytics: Computer-assisted analysis provides reproducible, threshold-based measurements that support statistical comparison across treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling olfactory sensitivity loss, a feature predictive of clinical neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Reusable across multiple test types (preference, avoidance, sensitivity) and mouse strains, functioning as a platform capability rather than a single-use assay.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in olfactory circuit function.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through fixed exposure times, blinded video analysis, and internal water controls.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid triage of targets using low-cost, high-reproducibility behavioral phenotyping.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying targets whose modulation rescues or recapitulates olfactory phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent handling, behavioral observation, and basic video tracking software (ImageJ).
- Dependent on consistent lighting, camera positioning (58 cm above cage), and odorant preparation (e.g., peanut butter oil dilutions, urine dilution series).
- Necessitates cross-team standardization of habituation protocols and blind analysis to minimize operator bias.
- Adaptation across model systems requires validation of odorant relevance (e.g., species-specific pheromones or aversants).
- Practical limitation: Assay sensitivity depends on accurate odorant delivery and cleanup between trials to prevent cross-contamination, particularly in sensitivity testing.
