Name: Modelli Distinctive capillare azione da micro-canali in osso, come può migliorare reclutamento di cellule per il Restauro di grande Bony difetto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Scopri come creare template ossei con micro-canali ingegnerizzati per migliorare l'assorbimento cellulare. Questo metodo avanzato facilita la rigenerazione di difetti ossei cranici e mascellofacciali.

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Gli autori non hanno riconoscimenti.

1. poliuretano (PU) Sponge Preparazione come modello <ol><li> Utilizzare spugne PU per la produzione di modelli di idrossiapatite contenenti pori comunicanti. Usare ogni spugna per fornire trabecole primario per la formazione dei puntoni modello nonché la formazione di micro-canali all&#39;interno della trabecole. </li><li> Tagliare e tagliare 80 ppi (pori per pollice) le spugne in 2 ponti forme con dimensioni di 3,5 cm di altezza x 5 cm di lunghezza x 1,5 cm di larghezza. Nota: Le dimensioni e forme possono essere scelti in base alle dimensioni dei pori primario desiderato: 100 ppi, 80 ppi, e 60 ppi. </li><li> Effettuare un 100 ml di 4% (w / v) di NaOH utilizzando un becher da 150 ml; quindi immergere e spremere fino a quando le spugne preparate sono completamente inzuppati. </li><li> Dopo l&#39;immersione, posizionare il bicchiere con le spugne nella ultrasonicatore (42 kHz). </li><li> Ultrasuoni pre-trattare le spugne PU per 15-20 minuti senza calore per modificare le proprietà superficiali. </li><li> Sciacquare con acqua distillataacqua per 5-10 min. Durante i risciacqui spremere le spugne e consentire loro di espandersi 5 a 7 volte per rimuovere la NaOH residua all&#39;interno delle spugne. </li><li> Spremere le spugne con tovaglioli di carta per eliminare l&#39;acqua in eccesso; quindi asciugare in stufa a 60-80 ° C. </li></ol> 2. idrossiapatite (HA) Slurry Preparazione per il rivestimento <ol><li> Prima di effettuare l&#39;impasto HA, misurare il peso di un becher con ancoretta magnetica. Questa misura viene utilizzato per calcolare il rapporto polvere / liquido. </li><li> Misura 10 g di polvere di HA nano-dimensioni. </li><li> Aggiungere 20 ml di acqua distillata nel becher da 50 ml. Calore per 120-140 ° C e mescolare con un agitatore magnetico piatto caldo. </li><li> Aggiungere 0,3 g (3% w / w) di alcool polivinilico (PVA) (89,000-98,000 MW) per la polvere in acqua distillata agitando a 300-400 rpm. </li><li> Mescolare fino a quando il PVA si è completamente dissolto. La soluzione deve essere chiara dopo la completa dissoluzione del PVA. </li><li> Girare off calore e aggiungere 0,1 g (1% w / w) di sodio carbossimetilcellulosa (CMC) (ultra-bassa viscosità) per la polvere sotto agitazione a 400-500 rpm. La soluzione deve essere chiara dopo la completa dissoluzione del PVA. </li><li> Mescolare fino a quando la CMC si è completamente sciolto e raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 0,3 g (3% w / w) di poliacrilato ammonio disperdente per polvere sotto agitazione a 300-400 rpm. Mescolare fino a completa dissoluzione. </li><li> Aggiungere 0,2 g (2% w / w) di glicerina per polvere sotto agitazione a 300-400 rpm. Mescolare fino a completa dissoluzione. </li><li> Lentamente disperdere la polvere HA nella soluzione agitando a 600-900 rpm e mantenere agitazione per 5 min. </li><li> Ultrasuoni per 5 minuti usando un ultrasonicatore per assicurare la dispersione di qualsiasi agglomerato della polvere di HA. </li><li> Aggiungere un extra di 5 ml di acqua distillata nella miscela sotto agitazione a 600-900 rpm e scaldare a 90-100 ° C. </li><li> Tenere agitazione la miscela con un agitatore magnetico a 600-800 rpm a 90-100 ° C in order evaporare il contenuto di acqua. </li><li> Misurare l&#39;intero peso compreso becher e la miscela di volta in volta fino ad un rapporto polvere / liquido di 1,75-1,8 si ottiene. </li><li> Formattazione il rapporto polvere / liquido, dividere il peso della polvere per il peso totale della miscela (2.14), compresa la polvere, reagenti, e acqua, meno il peso del bicchiere e agitatore (2.1), e meno la polvere HA (2.2). Nota: Per esempio: se A (intera miscela comprese le polveri, i reagenti e acqua) è 49.05 g, B (bicchiere con agitatore) è 33,5 g, e poi C (HA polvere) è di 10 g. C / (ABC) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1,80 </li><li> Lasciare che la sospensione si raffreddi per RT prima di utilizzare per il rivestimento. </li></ol> 3. HA rivestimento, Asciugare, e sinterizzazione <ol><li> Rivestire le spugne PU preparati con il rivestimento poltiglia HA con una spatola di acciaio fino a quando l&#39;impasto è omogeneo distribuiti in tutto il spugna PU su una lastra di vetro. Nota: Dopo aver rimosso la legatura in eccessory, alcuni dei pori possono essere ancora ostruiti con slurry a causa della elevata viscosità della sospensione. </li><li> Per garantire l&#39;interconnettività, uniformità, e pori aperti, leggermente soffiare i modelli HA rivestita utilizzando un compressore d&#39;aria. Questo processo assicura che i modelli vengono omogeneamente rivestite sia sulle superfici interne ed esterne di spugna PU. Nota: se un rivestimento omogeneo non viene raggiunta, i modelli rivestiti di HA crolleranno durante il processo di sinterizzazione e possono anche rompere durante la manipolazione a causa della bassa resistenza meccanica. Inoltre, il rivestimento omogeneo è fondamentale nella creazione micro-canali all&#39;interno della trabecole. </li><li> Essiccare i modelli HA rivestite per un minimo di 5 ore in condizioni di raffreddamento (20-25 ° C) con dolce circolazione dell&#39;aria. Tuttavia, prolungare il tempo di asciugatura in base alle dimensioni del modello. Nota: Dopo l&#39;essiccazione, i modelli HA rivestite in genere ridursi di circa l&#39;8% al 10% in ogni dimensione. </li><li> Dopo il processo di essiccazione, posizionare l&#39;HAmodelli rivestiti in un crogiolo di allumina. Poi, metterli in un forno ad alta temperatura e utilizzare i seguenti 8 fase di sinterizzazione profilo. <ol><li> Calore 2 ° C / min fino a 230 ° C. </li><li> Calore 1 ° C / min fino a 280 ° C. </li><li> Scaldate 0,5 ° C / min fino a 400 ° C. </li><li> Calore 3 ° C / min fino a 600 ° C. Mantenere a 600 ° C per 1 ora. </li><li> Calore 5 ° C / min fino a 1230 ° C. Mantenere 1.230 ° C per 3 ore. </li><li> Raffreddare 5 ° C / min a RT. Nota: sinterizzazione si contrarrà ulteriormente i modelli di spugna HA rivestiti da circa il 22% - 25% in ogni dimensione. </li></ol></li></ol> 4. ingresso e Inhabitancy di celle nel modello <ol><li> Cultura pre-osteoblastiche cellule MC3T3 in mezzi non osteogenico costituito da α-MEM, supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di antibiotici (streptomicina e penicillina) a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO 2 . </li><li> Aggiungere 10 mldi una sospensione cellulare a 2 x 10 6 densità cellulare in un singolo pozzetto in una piastra da 6 pozzetti. </li><li> Posizionare il modello a ponte 3 cm x 4 cm x 1 cm verticalmente nel 6 pozzetti. Mettere una gamba del modello nella piastra contenente la sospensione di cellule, e l&#39;altra gamba in un pozzo vuoto adiacente. </li><li> Lasciare che il modello di assorbire la sospensione cellulare per 10 min. </li><li> Aggiungere 5 ml di supporto successivo al pozzo originariamente riempita con la sospensione cellulare. </li><li> Riempire il mezzo in entrambi i pozzetti ogni 2 o 3 giorni finché siano trascorsi 7 giorni. </li><li> Determinare l&#39;efficacia della mobilità delle cellule da ematossilina e eosina 11. <ol><li> Fissare le cellule e scaffold immergendo in 100% EtOH per 20-30 min. </li><li> Colorare con ematossilina per 1-2 min. </li><li> Risciacquare con acqua distillata per 1-2 minuti per due volte. </li><li> Disidratare per immersione nel 70%, poi 95%, allora il 100% EtOH per 1-2 minuti ciascuno. </li><li> Colorare con Eosina per 20-30 secondi. </li><li> Risciacquare con acqua distillata per 12 min per due volte. </li><li> Disidratare per immersione in 70%, 80%, 90% e 100% EtOH per 1-2 minuti ciascuno. </li><li> Incorporare l&#39;impalcatura in una resina acrilica per sezionamento e di imaging. </li></ol></li><li> Determinare la vitalità cellulare con i 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT) vitalità cellulare test e test dal vivo / Morto (cell Live / morti kit di colorazione MPTP) in fase di punti di giorno 3 e 7 11. Nota: Lo schema di protocolli modello di fabbricazione osso-come sono rappresentati nel &quot;Rappresentante dei risultati&quot; sessione. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

È necessario un modello a più componenti tra cui le cellule, fattori di crescita, sostanze nutritive, ecc per la rigenerazione ossea successo e ripristino funzionale dei grandi difetti ossei critici dimensioni. All&#39;interno di questi fattori, anatomicamente Conformi proprietà biologiche sono essenziali. Per realizzare la funzionalità biologica, il modello deve esibire biocompatibilità, osteoconduttività, integrità meccanica, una superficie, adeguata struttura di superficie, ed i mezzi per ossigeno e trasporto dei nutrienti. A livello cellulare, le seguenti caratteristiche sono particolarmente cruciale per il ripristino funzionale di massicci difetti ossei: penetrazione facilitata nel modello (reclutamento attivo), una distribuzione uniforme in tutto il modello (retention), la proliferazione accelerata e ad alta redditività (abitazione). Infine, la successiva formazione di matrice extracellulare sostanziale e l&#39;attivazione dell&#39;espressione genica sono fondamentali processi biologici essenziali come la rapida vascolarizzazione unosteogenesi nd. Molti diversi tipi di sostituti sintetici sono stati proposti per sostituire automazione / allo- innesti ossei. Tuttavia, l&#39;organizzazione patibolo corrente non presenta un microambiente interno contenente micro-canali e nano-pori, e quindi non facilita attivamente infiltrazione di cellule, la distribuzione, e inhabitance in profondità i sostituti sintetici che sono più grandi di 10 mm. Non forniscono segnali fisici per pionieristico cellule in modo efficiente, migrare rapidamente ed uniformemente profondamente nel modello osso. Invece, il reclutamento passivo limitato di cellule crea un popolazioni cellulari inegualmente distribuiti tra le aree esterne e interne del patibolo. Questo aggrava non solo la sfida iniziale delle cellule raggiungono il nucleo interno del template, ma impedisce anche il flusso di nutrienti e comunicazione cellulare con l&#39;altra estremità del sostituto sintetico. Questo tipo di cellule sproporzionato di reclutamento e di abitazione risultati nella cella death e ossa incompleta crescita dopo il ponteggio è stato impiantato nel corpo 14,15. Così, abbiamo introdotto il concetto di azione capillare come spunto fisico primario per affrontare questi ostacoli. Abbiamo micro-canali accuratamente progettato nel BMT per indurre l&#39;azione capillare che rappresenteranno la forza di trascinamento primario responsabile per attivamente reclutando cellule in profondità nel BMT. La tecnica di rivestimento in PU spugna presenta diverse proprietà uniche. In primo luogo, permette una facile preparazione di strutture trabecolari porose ben controllati, che si dipendono strutture template predefiniti (ad esempio, 80 dei pori per ogni modello pollici per 300-400 micron). Questo è molto importante per ottimizzare la dimensione dei pori di 15 osteoblasti infiltrazione. In secondo luogo, la tecnica consente la costruzione di micro-canali interconnessi, che rappresentano il ruolo significativo di inizializzazione delocalizzazione cella 11. In terzo luogo, non ci sono quasi limiti quando si utilizza la spugna PU in termini di creazione di forme personalizzate e dimensioni dei modelli. Il produttore può utilizzare una forbice per le forme semplici o taglio laser anche calcolato per geometrie complesse. Utilizzando queste tecnologie controllate precisamente, abbiamo creato la BMT. HA è stato scelto come materiale di partenza per la sua biocompatibilità e osteoconduttiva capacità 17. In questo studio, ci sono diversi passaggi critici che devono essere evidenziati. Durante la preparazione slurry HA, se la temperatura è troppo alta e la velocità di agitazione è troppo bassa, la poltiglia HA diventerà bloccato sui bordi inferiori del becher e asciugare. Dopo il processo di rivestimento quando soffia l&#39;eccesso HA slurry, troppo alta di una pressione dell&#39;aria può indurre crepe sulla superficie del BMT. È importante mantenere la pressione dell&#39;aria relativamente bassa per aerare adeguatamente l&#39;eccesso HA slurry solo. Infine, la seconda e terza fase del processo di sinterizzazionesono più importante (Heat 1 ° C / min fino a 280 ° C e calore di 0,5 ° C / min fino a 400 ° C). In questo intervallo di temperatura, la spugna PU sarà completamente brucia mentre l&#39;HA diventa denso. Se questo protocollo non è seguito da vicino, la BMT sarà crollato o sbriciolato dopo la sinterizzazione. Il BMT descritto in questo studio offre diversi vantaggi. In primo luogo, i macro-pori interconnessi (300-400 micron) imitano quelli di osso trabecolare umano e permette di regolare il flusso del midollo osseo. In secondo luogo, i modelli sono composti da micro-canali (25-50 micron) all&#39;interno di ogni setto trabecolare per accelerare la penetrazione iniziale di cellule ossee tramite azione capillare. Come dimostrato mediante simulazione computazionale 13, se il modello aveva solo 300 micron pori (pori primari) e nessuna microcanali, l&#39;azione capillare sarebbe insufficiente per la piena saturazione del modello con midollo osseo. Ciò soprattutto sostenere per i difetti di grandi dimensioni che richiedono lmodelli di dimensioni arge. Di dimensioni micrometriche canali mostra altamente efficace assorbimento di liquidi, e quindi ci aspettavamo le micro-canali di essere i principali responsabili per l&#39;azione capillare nel nostro studio. In terzo luogo, i nostri BMTs sono strategicamente posizionati nano-pori. I dati della letteratura indicano che le cellule sono particolarmente sensibili alla nano-patterns 18,19; Pertanto, ci aspettavamo i nano-pori sulle pareti dei micro-canali a svolgere un ruolo per aumentare l&#39;adesione cellulare. Pori di dimensioni nanometriche (100-400 nm) sulla superficie dei setti trabecolare ammessi cellule per ancorare immobilizzati. Nel complesso, l&#39;effetto combinato di queste tre strutture interne portato a mobilizzazione delle cellule maggiore e l&#39;adesione in tutto il modello. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni del protocollo e le misure fondamentali per fabbricare la perfetta BMT. Ad esempio, vi è spesso una grande quantità di HA sospensione preparata a causa della difficoltà di mantenere una viscosità omogenea mentre rivestimento. Inoltre vi è una limitazione nel faremodelli maggiori di 5 cm 3 di volume dovuto al tempo di lavoro, mentre il rivestimento. Lo spessore del rivestimento è fondamentale che varia a seconda del produttore di tecniche. I risultati del nostro studio suggeriscono che la BMT in grado di assorbire e trattenere le cellule offriranno vantaggi potenziali rispetto alloplastico convenzionale (o sintetico) impalcature. Uno studio prospettico viene presa in considerazione per verificare i benefici di BMT su osteogenesi e / o angiogenesi con fattori di crescita dell&#39;osso legati. Pertanto, sosteniamo che la nostra unica funzionalità BMT impalcatura può affrontare le principali barriere di osso insufficiente osseo infiltrazione nei costrutti sintetici e rigenerazione ossea incompleta in grandi difetti. L&#39;obiettivo finale di questo studio è quello di semplificare l&#39;attuale paradigma della bioingegneria per la ricostruzione ossea e ripristino funzionale di difetti ossei di dimensioni critiche, eliminando la necessità di tempo- / stroma del midollo osseo alta intensità di lavoroprocessi di cellule l isolamento e di espansione. Infine, ci proponiamo di utilizzare anatomicamente conforme 3D costrutti con micro-canali e nano-pori, che inducono un rapido assorbimento delle cellule, la distribuzione omogenea, e inhabitance per la ricostruzione dell&#39;osso.

L'obiettivo finale dell'ingegneria del tessuto osseo con costrutti sintetici è l'incorporazione dei costrutti nell'osso ospite, il ripopolamento dei costrutti con cellule ospiti e la ricostituzione degli scambi di gas e fluidi corporei per ripristinare la normale funzione ossea. Nell'ultimo decennio sono state riportate notevoli ricerche sull'uso di biomateriali polimerici e ceramici per la produzione di scaffold1,2. Tuttavia, il materiale e la tecnica di fabbricazione ideali per una rigenerazione ottimale del tessuto osseo devono ancora essere identificati. Inoltre, c'è una generale mancanza di successo nel portare queste tecnologie in clinica, soprattutto per la ricostruzione e il ripristino di grandi difetti ossei. Pertanto, il ripristino di difetti ossei di dimensioni critiche rimane ancora una sfida clinica1-5. 
Idealmente, gli scaffold per la rigenerazione del tessuto osseo dovrebbero mostrare biocompatibilità senza causare risposte infiammatorie o reazioni tossiche da corpo estraneo, avere proprietà meccaniche molto simili rispetto a quelle dell'osso nativo e possedere un meccanismo per consentire la diffusione e/o il trasporto di ioni e nutrienti. Sono altrettanto desiderabili un forte legame con l'osso ospite, una crescita ossea dinamica, una crescita vascolare e la biodegradazione degli scaffold. Sebbene l'uso di scaffold polimerici biodegradabili abbia mostrato progressi in termini di crescita dei tessuti, ci sono controversie sul loro utilizzo per la rigenerazione ossea. 
Nonostante questi sforzi estesi, i costrutti sintetici strutturali altamente organizzati hanno ancora un potenziale limitato nel superare l'ostacolo della penetrazione cellulare passiva. La maggior parte di questi approcci ha portato alla crescita tissutale in vitro con sezioni trasversali inferiori a pochi μm a diversi mm dalla superficie esterna, un'integrazione incompleta con l'osso ospite e una rigenerazione ossea solo parziale in vivo6,7. Le cellule pioniere non migrano in profondità nei costrutti a causa della mancanza di una forza iniziale che le attiri all'interno prima che inizi la colonizzazione cellulare. Di conseguenza, la colonizzazione cellulare avviene rigorosamente alla periferia dell'impalcatura, diventando un'ostruzione dalla periferia al centro dell'impalcatura. Pertanto, la diffusione di ossigeno e sostanze nutritive nelle parti interne dei modelli diventa limitata8. Pertanto, è chiaro che l'architettura degli scaffold (dimensione dei pori, porosità, interconnettività e permeabilità) che influenzano il trasporto e la diffusione delle sostanze attraverso gli scaffold è fondamentale per ottenere una proliferazione e differenziazione cellulare ben distribuita9,10. Sebbene i fosfati di calcio siano stati utilizzati in passato per la fabbricazione di scaffold , diversi processi e procedure hanno spesso portato a scaffold di fosfato di calcio con architetture variabili. Pertanto, la selezione del processo di produzione diventa importante nel dettare l'architettura dell'impalcatura necessaria per una rigenerazione del tessuto osseo di successo.
In conclusione, ci sono ancora due principali carenze dell'ingegneria del tessuto osseo che devono essere affrontate: il reclutamento iniziale delle cellule nel modello prima dell'attaccamento e della colonizzazione delle cellule e la qualità del flusso della sostanza sia dentro che fuori dal modello.

<table><tbody><tr><td>spugna poliuretanica</td><td>Plastifoam</td><td>PU-3215</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>167176</td><td></td></tr><tr><td>Idrossiapatite in polvere</td><td>Ossgen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcool polivinilico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td></td></tr><tr><td>Carbossimetilcellulosa sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>360384</td><td></td></tr><tr><td>poliacrilato di ammonio</td><td>Vanderbilt</td><td>DARVAN 821A</td><td></td></tr><tr><td>Glicerina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2289</td><td></td></tr></tbody></table>

modelli distinctive capillare azione da micro-canali in osso, come può migliorare reclutamento di cellule per il restauro di grande bony difetto

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

Senza, fiorente popolazione attiva cella che è ben distribuito e stabilmente ancorata al modello inserito, rigenerazione ossea eccezionale non si verifica. Con i modelli convenzionali, l&#39;assenza di micro-canali interni provoca la mancanza di infiltrazione di cellule, la distribuzione, e inhabitance nel profondo i modelli. Quindi, un modello altamente porosa e uniforme interconnessi trabecolare-simile all&#39;osso con micro-canali (modello microambiente biogeni; BMT) è stato sviluppato per affrontare questi ostacoli. Il romanzo BMT è stato creato da concetti innovativi (azione capillare) e fabbricato con una tecnica di rivestimento spugna-modello. La BMT è costituito da diversi componenti strutturali: primarie-pori interconnessi (300-400 micron), che imitano i pori in osso trabecolare, micro-canali (25-70 micron) all&#39;interno di ogni trabecula e nanopori (100-400 nm) sul di superficie per permettere alle cellule di ancoraggio. Inoltre, la BMT è stato documentato da studi di prova meccanica per avere simili proprietà di resistenza meccanica a quelle dell&#39;osso trabecolare umano (~ 3,8 MPa) 12. La BMT esposto elevato assorbimento, ritenzione, e abitazione di cellule in tutto il (¸) modelli a forma di ponte (tre centimetri di altezza e 4 cm di lunghezza). Le cellule che inizialmente sono state seminate in una estremità dei modelli immediatamente mobilitate verso l&#39;altra estremità (10 cm di distanza) per capillarità del BMT sul supporto cellulare. Dopo 4 ore, le cellule omogeneamente occupato l&#39;intera BMT ed esposti comportamento cellulare normale. L&#39;azione capillare rappresentato per l&#39;infiltrazione di cellule sospese in media e la distribuzione (migrazione attiva) in tutto il BMT. Dopo aver osservato questi capacità della BMT, proiettiamo che BMTs assorbirà cellule del midollo osseo, fattori di crescita e sostanze nutritive dalla periferia in condizioni fisiologiche. Il trapianto di midollo osseo può risolvere le limitazioni attuali via infiltrazione rapida, distribuzione omogenea e inhabitance di cellule in grandi modelli volumetrici per riparare enormi difetti scheletrici.

La struttura complessiva del BMT presenta un modello tridimensionale unico con trabecolari strutture interne simile all&#39;osso. La BMT contiene macro-pori, micro-canali e nano-pori. Configurazioni chiare di completamente interconnessi macro-pori (dimensione media di 320 micron), micro-canali (diametro medio di 50 micron) e nano-pori (dimensione media di 100 nm) sono stati verificati con un microscopio elettronico a scansione (EVO-40; Zeiss) nonché attraverso micro-tomografia. Figura 1 mostra protocolli dettagliati stepwise creando un BMT. Attraverso un preciso controllo dei protocolli dalla preparazione delle spugne PU al processo di sinterizzazione (P1 - P7; Figura 1), le seguenti funzioni possono essere raggiunti: una superficie altamente densa e liscia dopo il rivestimento di HA e di essiccazione; un preciso forma e dimensioni 3-D del modello; una rete trabecolare porosa completamente interconnesso simile a quella dell&#39;osso trabecolare; e micro-canali ingegnohin ogni trabecula che imitano i canali intra-ossee come canali di Havers e canali di Volkmann (figure 2 e 3). Inoltre, relativamente ad alta resistenza meccanica (~ 3,8 MPa) simile a quella dell&#39;osso trabecolare umano è stata misurata mediante una prova di resistenza alla compressione. Parametri istomorfometrici altamente simili con quelli di lombari umano vertebre osso trabecolare sono stati confermati da analisi di micro-CT 12. Diversa entità azione capillare è stata dimostrata attraverso diversi diametri capillari in figura 4 utilizzando la simulazione computazionale. Attraverso queste simulazioni, abbiamo proiettato che la BMT mostrerebbe diversi tassi di assorbimento all&#39;interno delle primarie-pori (300-400 micron) e micro-canali (25-70 micron) in base ai diametri. Capillari più piccoli esposti capacità di assorbimento più forti. Questa ipotesi è stata verificata in questo esperimento come mostrato in Figura 5. La BMT esposto altamente efficaceassorbimento e ritenzione di fluido attraverso l&#39;azione capillare delle strutture micro-channel; blu macchia di stevenel stato utilizzato come mezzo fluido di monitorare facilmente il flusso (figura 5). Sulla base di simulazione computazionale, la BMT con queste configurazioni sono stati visti di assorbire e trattenere sospensioni cellulari fino a 8,5 cm di distanza totale entro 10 sec. A causa di una forte azione capillare indotta dalle strutture interne, il mezzo tinto raggiunto l&#39;estremità opposta di un 3 cm (altezza) x 4 cm (lunghezza) x 1 cm (larghezza) modello a ponte entro 1 min e 40 sec. Inoltre, la mobilizzazione delle cellule attiva e incorporazione nella BMT è stata osservata (Figura 6). Successivamente, la mobilizzazione delle cellule omogeneo e attacco provocato maggiore proliferazione e formazione della matrice in una formazione uniformemente distribuito. Inoltre, a lunga distanza (~ 10 cm) migrazione delle cellule attraverso il BMT è stato convalidato immediatamente dopo BMT era satura della sospensione cellulare. Se<html> cellule EDED sopravvissuti nel segmento template che è stato esposto all&#39;aria e non immerso nel mezzo di coltura. In questo esperimento, il terreno di coltura è stato fornito alle cellule esclusivamente nei pozzetti toccano solo le gambe del ponteggio. L&#39;azione capillare esposti da microcanali poi consentito per mezzo fresco per raggiungere la cima, porzione ponte del patibolo. Dopo 3 giorni di cultura, il modello venne occupato con le cellule in rapida proliferazione. Dopo 7 giorni di coltura, ogni trabecula era avvolto da matrici extracellulari e integrato con celle 13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig1.jpg" /> Figura 1. Il protocollo template fabbricazione complessiva simile all&#39;osso dal pre-trattamento di PU spugna (P1) per il trattamento termico finale (P7). Mantenendo il profilo sinterizzazione precisa dopo P7 è fondamentale per ottenere una resistenza meccanica favorevole.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig2.jpg" /> . Figura 2 Rappresentante stereo microscopio (AmScope, SM-2TZ-M) immagini (x4) di un 80 ppi dimensioni PU spugna (a sinistra), HA rivestito ed essiccato BMT (al centro), e sinterizzato BMT (a destra) (Dimensioni: 3. cm di altezza x 4 cm di lunghezza x 1 cm di larghezza). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig3.jpg" /> Figura 3. SEM e micro-CT immagini di un modello biogenico: (A) una immagine complessiva di un modello biogenico, <st<html> rong&gt; (B, C, D) le immagini per i micro-canali. Al fine di evidenziare chiari micro-canali del trabecole, il modello è stato granulato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig4.jpg" /> . Figura 4. calcolo computazionale di azione capillare con differenti diametri di canale entro lo stesso periodo di tempo (0,4 ms), mentre il più grande capillare (d = 300 micron: si riferisce primaria pori) assorbita medio (blu) fino a 0,16 mm in altezza, il più piccolo capillare (d = 30 micron: si riferisce alla micro-channel) assorbito il supporto fino a 0,415 mm di altezza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig5.jpg" /> Figura 5. Le immagini mostravano differenze di capacità di assorbimento capillare basati su diverse dimensioni di primari-pori e micro-canali (primary size-pori si riferisce al diametro medio: 60 ppi ≈ 470 micron, 80 ppi ≈ 320 um, 100 ppi ≈ 200 micron). Le linee gialle rappresentano l&#39;azione capillare indotta dalla combinazione di primari-pori e micro-canali. Le linee rosse rappresentano l&#39;azione capillare indotta da prevalentemente micro-canali esposte in ogni trabecula. Come mostrato in (F), il modello 100 ppi indotto la forte azione capillare, con conseguente completa saturazione del modello entro 39 sec. I modelli 80 ppi e 60 ppi sono stati testati da allora in poi. (B) 0 sec, (C) 0,5 sec, (D) 1,5 sec, (E) 17.0 sec, (F) 39,0 sec, (G) 50,0 sec, e (H) 1 min 18 sec dopo l&#39;immersione. (Dimensione Template: 1cm x 1 cm x 4 cm di altezza cubica). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig6.jpg" /> Figura 6. L&#39;ingresso e l&#39;immigrazione di cellule dai pozzi teste di serie (parte I) per i pozzi non teste di serie (parte V) attraverso i modelli biogene indotte per azione capillare. Le cellule inizialmente seminate raggiunto la fine della gamba testa di serie (parte V) subito dopo piena saturazione. Dopo 3 giorni, la confluenza delle cellule era evidente in tutto l&#39;intero modello. Dopo 7 giorni, la formazione di matrice di collagene spazio-temporale si è verificata entro popolazioni cellulari (H &amp; E macchia). (Dimensione Template: 3 cm di altezza x 4 cm di lunghezza x 1 cm di larghezza). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig6large.jpg" target="_blank">Si prega di cl</a>ick qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Viene presentato un processo generico passo-passo per creare un modello simile a un osso con micro-canali ingegnerizzati. Le elevate capacità di assorbimento e ritenzione del modello sono dimostrate dall'azione capillare tramite microcanali.

Modelli Distinctive capillare azione da micro-canali in osso, come può migliorare reclutamento di cellule per il Restauro di grande Bony difetto

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare un microambiente modello osseo in grado di ripristinare l'osso mancante o danneggiato. Questo risultato si ottiene innanzitutto modellando e modificando una spugna di poliuretano in modo che si adatti alla zona della lesione. Il secondo passaggio consiste nell'applicare uniformemente sulla spugna di poliuretano una sospensione viscosa di idrossiapatite e lasciarla asciugare.L'ultimo passaggio consiste nel posizionare al centro del rivestimento di idrossiapatite un fornetto muscolare ad alta temperatura. In definitiva, viene realizzato un modello simile all'osso con microcanali progettati, che presenta elevate capacità di assorbimento e ritenzione cellulare. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le tecniche di lisciviazione del sale o di stampa 3D, è che l'ingegnerizzazione dei microcanali induce un'azione capillare.Questo metodo può contribuire a risolvere le principali sfide nel campo della medicina rigenerativa, come la ricostruzione di difetti ossei cranio-massofacciali e segmentali. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malformazioni congenite. I modelli sono completamente personalizzabili per forma e dimensione, e l'azione capillare favorirà la migrazione cellulare su lunghe distanze.Sebbene questo metodo fornisca informazioni sulla rigenerazione ossea, può essere applicato anche ad altri sistemi di coltura, come la piattaforma di coltura del cancro 3D. Iniziare tagliando le spugne di poliuretano con 80 pori per pollice in forme a ponte con dimensioni di 3,5 centimetri di altezza per cinque centimetri di larghezza per 1,5 centimetri di profondità. Successivamente, preparare 100 millilitri di una soluzione al 4% di idrossido di sodio.Utilizzando un becher da 150 millilitri, immergere le spugne nella soluzione di idrossido di sodio ed espellere l'aria intrappolata premendo fino a quando le spugne non saranno completamente inzuppate. Una volta sature, posizionare il becher con le spugne in un bagno ad ultrasuoni a 42 kilohertz per 15-20 minuti senza riscaldamento.Una volta terminato, risciacquare le spugne con acqua distillata per cinque-dieci minuti; durante il risciacquo, strizzare le spugne e lasciarle espandere da cinque a sette volte per rimuovere eventuali residui di idrossido di sodio all'interno delle spugne. Rimuovere l'acqua in eccesso dalle spugne utilizzando carta da cucina, quindi posizionarle in un forno a 60-80 gradi Celsius per completare l'essiccazione. Per iniziare a preparare la sospensione di idrossiapatite, pesare prima un becher da 50 millilitri contenente una barretta magnetica per l'agitazione.Successivamente, aggiungere 20 millilitri di acqua distillata nel becher. Riscaldare l'acqua su una piastra riscaldante impostata a 120-140 gradi Celsius e mescolare utilizzando un agitatore magnetico. Quando l'acqua inizia a bollire, aggiungere 0,3 grammi di polvere di alcol polivinilico nell'acqua distillata mescolando a 300-400 giri al minuto.Mescolare fino a quando la polvere non si sarà completamente disciolta e la soluzione sarà limpida. Spegnere quindi il riscaldamento e aggiungere 0,1 grammi di polvere di carbossimetilcellulosa sodica a viscosità ultra bassa, continuando a mescolare a 400-500 giri al minuto fino a quando la soluzione non diventa limpida. Una volta nuovamente disciolta, raffreddare la miscela a temperatura ambiente.Successivamente, aggiungere 0,3 grammi di dispersante poliacrilico di ammonio mescolando a 300-400 giri al minuto. Mescolare fino a completa dissoluzione, quindi aggiungere 0,2 grammi di glicerina continuando a mescolare a 300-400 giri al minuto. Mescolare la miscela fino a completa dissoluzione.Quindi pesare 10 grammi di polvere di idrossiapatite di dimensioni nanometriche e aggiungerla lentamente al becher sotto costante agitazione a 600-900 giri/min. Continuare ad agitare per cinque minuti. Successivamente, collocare la miscela in un bagno ad ultrasuoni e sottoporla a sonificazione per cinque minuti per garantire la dispersione di eventuali agglomerati della polvere di idrossiapatite, quindi aggiungere altri cinque millilitri di acqua distillata alla miscela sotto agitazione a 600-900 giri/min e riscaldare a 90-100 gradi Celsius, continuando ad agitare la miscela mediante un agitatore magnetico a 600-800 giri/min a 90-100 gradi Celsius.Per evaporare il contenuto di acqua, misurare periodicamente il peso totale, compresi il becher e la miscela, fino a ottenere un rapporto polvere-liquido compreso tra 1,75 e 1,80. Come descritto nel protocollo testuale allegato, lasciare raffreddare la sospensione a temperatura ambiente prima di utilizzarla per il rivestimento; applicare la sospensione di idrossiapatite sui tamponi di poliuretano utilizzando una spatola in acciaio inox, fino a quando la sospensione non risulta uniformemente distribuita in tutto il tampone di poliuretano su una piastra di vetro. Successivamente, soffiare leggermente sui tamponi utilizzando un compressore d'aria per garantire interconnessione, uniformità e pori aperti.Se non si ottiene un rivestimento omogeneo, i modelli rivestiti con idrogel crolleranno durante il processo di ING e potrebbero anche creparsi durante la manipolazione a causa dei bassi vincoli meccanici. Inoltre, un rivestimento omogeneo è fondamentale per creare microcanali all'interno della struttura. Asciugare i modelli rivestiti con acido ialuronico per un minimo di cinque ore a una temperatura compresa tra 20 e 25 gradi Celsius con una leggera circolazione d'aria.Aumentare questo tempo per modelli di dimensioni maggiori. Al termine del processo di essiccazione, posizionare i modelli rivestiti con acido ialuronico su un crogiolo Illumina. Successivamente, inserirli in un forno ad alta temperatura e seguire il profilo di centraggio in otto passaggi descritto nel protocollo testuale allegato.Aggiungere 10 millilitri di cellule mc3t3 pre-osteoblastiche a 1 milione di cellule in un singolo pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Successivamente, posizionare verticalmente nella piastra a sei pozzetti un stampo a forma di ponte di dimensioni tre centimetri per quattro centimetri per un centimetro. Inserire una gamba dello stampo in un pozzetto contenente la sospensione cellulare e l'altra gamba in un pozzetto adiacente vuoto.Lasciare che il tampone assorba la sospensione cellulare per 10 minuti in un armadio a sicurezza biologica. Quindi aggiungere cinque millilitri di mezzo supplementare al pozzetto che inizialmente era stato riempito con la sospensione cellulare. Dopo ulteriori cinque minuti, aggiungere cinque millilitri di mezzo all'altro pozzetto che inizialmente non era stato riempito con la sospensione cellulare.Quindi posizionare l'apparato in un incubatore. Cambiare il mezzo ogni due giorni per sette giorni. Al termine dell'esperimento, fissare le cellule e il supporto per 20-30 minuti immergendoli in un becher riempito con etanolo al 100%.Colorare l'impalcatura risciacquata con la soluzione di ematossilina per uno o due minuti. Successivamente, risciacquare per uno o due minuti immergendo nuovamente l'impalcatura in un becher contenente acqua distillata, ripetendo il risciacquo due volte; quindi disidratare l'impalcatura in cellule immergendola in etanolo al 70% per uno o due minuti. Trasferire poi l'impalcatura in etanolo al 95% per un ulteriore periodo di uno o due minuti.Infine, posizionare l'impalcatura in etanolo al 100% per due minuti. Successivamente, controcolorare la costruzione con e, s e Y per uno o due minuti. Quindi risciacquare per uno o due minuti immergendo nuovamente l'impalcatura in un becher contenente acqua distillata due volte.Dopo il risciacquo, disidratare l'impalcatura immergendola in una serie di etanolo a concentrazione crescente prima dell'inclusione in resina. Infine, includere l'impalcatura in una resina acrilica per la sezionatura e l'analisi mediante imaging. Il modello di microambiente biogenico mostrato in diverse fasi di fabbricazione consiste in una rete trabecolare porosa completamente interconnessa, simile a quella dell'osso trabecolare.Questo stampo presenta diverse componenti strutturali, tra cui pori primari interconnessi di diametro compreso tra 300 e 400 micron, microcanali di diametro compreso tra 25 e 70 micron e nanopori superficiali di diametro compreso tra 100 e 400 nanometri, che permettono l'ancoraggio delle cellule. Lo stampo del microambiente biogenico favorisce la semina cellulare in tutte le regioni della struttura tramite l'azione capillare. Immediatamente dopo la saturazione completa, la distribuzione delle cellule può essere chiaramente osservata mediante colorazione con ematossilina, eosina e sezione dell'impalcatura.Il numero di cellule in ciascuna regione del modello è stato quantificato e monitorato dopo tre giorni di coltura. Dopo sette giorni di coltura, il modello si è riempito di cellule che proliferavano rapidamente, ogni trabecola era avvolta da matrici extracellulari e infiltrata da cellule. Una volta tarata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni se viene effettuata correttamente.Nel seguire questa procedura, è importante ricordare di mantenere il corretto rapporto tra polvere e acqua e di garantire un rivestimento omogeneo. Seguendo questo protocollo, è possibile adottare anche altri metodi, come il sistema dinamico a dondolo o il sistema di coltura rotante, per rispondere ad ulteriori quesiti riguardanti le risposte cellulari.

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L&#39;uso di cellule staminali per la rigenerazione ossea perivascolari

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Sono interessanti gli scaffold in grado di adattarsi ai difetti ossei cranio-maxillo-facciali (CMF) mentre mostrano osteoconduttività e bioattività. Questo protocollo descrive la preparazione di un'impalcatura a memoria di forma a base di policaprolattone diacrilato (PCL-DA) utilizzando un metodo di lisciviazione del particolato con colata di solvente (SCPL) che impiega un modello di sale fuso e l'applicazione di un rivestimento bioattivo in polidopamina.

Realizzazione di una sede a PCL Bioactive, &quot;Self-fitting&quot; Shape Memory Polymer Ponteggio

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In questo studio, descriviamo in dettaglio i metodi di decellularizzazione, caratterizzazione fisica, imaging e impianto in vivo di biomateriali a base vegetale, nonché metodi per la semina e la differenziazione cellulare negli scaffold. I metodi descritti consentono la valutazione di biomateriali di origine vegetale per applicazioni di ingegneria del tessuto osseo.

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