Planar gradiente di diffusione del sistema per Indagare Chemiotassi in un 3D collagene Matrix

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare una camera di diffusione a gradiente planer per studiare le tasse della chemio in una matrice di collagene 3D. Ciò si ottiene fabbricando prima uno stampo in silicone 3D con l'uso di una camera di imaging di cellule vive. Il secondo passo è quello di realizzare i vetrini coprioggetti idrofili e idrofobi e di utilizzarli per assemblare lo stampo in silicone 3D.

Successivamente, la miscela di cellule di collagene viene aggiunta al compartimento centrale e lasciata polimerizzare. Il passaggio finale consiste nel rimuovere i vetrini di copertura idrofobici dallo stampo dopo l'incubazione e nell'aggiungere un terreno semplice a un serbatoio e un terreno con chemioattrattivo all'altro serbatoio. In definitiva, la microscopia confocale viene utilizzata per monitorare la chemiotassi cellulare nel tempo e visualizzare lo spostamento del movimento cellulare all'interno della matrice di collagene.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti come la boin chamber e la micro atletica, è che consente una semplice configurazione per studiare la migrazione nello spazio 3D con un semplice gradiente di diffusione, senza l'utilizzo di una pipetta monouso. Dosare 150 microlitri di aminoseta A-P-T-M-S e versarla in un tubo da 50 millilitri. Quindi aggiungere 30 millilitri di etanolo al 100% alla provetta con una seconda pipetta usa e getta e chiudere il coperchio.

Agitare la soluzione per due minuti per garantire una miscelazione completa. Versate quindi la soluzione in una capsula di Petri di vetro e mettetela da parte. Successivamente, versare 15 millilitri di alcol etilico al 100% in una seconda capsula di Petri e posizionarla con la prima piastra utilizzando una nuova pipetta usa e getta.

Misurare 30 millilitri di acqua deionizzata e versare la soluzione in un tubo da 50 millilitri. Quindi, utilizzare una nuova pipetta usa e getta per aggiungere 1,875 millilitri di aldeide glu alla provetta e chiudere il coperchio. Agitare la soluzione per due minuti, quindi versare il composto in una terza capsula di Petri.

Usando una pinza, estrarre 1 vetrino da 22 millimetri rotondo e sciacquare entrambi i lati con una miscela di etanolo al 100%. Utilizzando una pipetta usa e getta, posizionare il vetrino di risciacquo nel primo piatto che contiene ammino seline e lasciarlo riposare nella soluzione per cinque minuti utilizzando una pinza. Estrarre il vetrino coprivetro e risciacquarlo nuovamente con etanolo al 100%.

Quindi versare il vetrino risciacquato nella pirofila con glutaraldeide e metterlo da parte per 30 minuti. Dopo 30 minuti, rimuovere il vetrino coprivetro con una pinza e sciacquarlo con acqua deionizzata. Posizionare il vetrino coprioggetto risciacquato su un fazzoletto ad asciugare per una notte a temperatura ambiente.

Per preparare i vetrini coprioggetti idrofobici, aggiungere prima 500 microlitri di TTS, 100 microlitri di acido acetico e 19,4 millilitri di eme in un tubo da 50 millilitri e agitarlo per due minuti. Quindi versare la soluzione in una capsula di Petri di vetro e utilizzare una pinza pulita per far cadere un vetrino nella soluzione preparata e lasciarlo lì per due minuti. Dopo due minuti, estrarre il vetrino coprioggetto con una pinza e sciacquarlo con acqua deionizzata utilizzando una pipetta monouso, posizionare il vetrino coprioggetto su un fazzoletto e lasciarlo asciugare a temperatura ambiente per una notte.

Conservare i vetrini di copertura essiccati in una capsula di Petri di plastica fino a quando non sono necessari per iniziare, assemblare la camera di imaging delle cellule vive come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi, mescola le soluzioni di elastomero siliconico secondo le istruzioni del produttore per produrre cinque millilitri di elastomero. Quindi utilizzare una spatola da laboratorio monouso per versare lentamente la soluzione di elastomero siliconico nella configurazione della camera di imaging per cellule vive in modo da non disturbare i componenti dello stampo.

Metti da parte lo stampo in un luogo sicuro per curare la temperatura ambiente durante la notte. La mattina dopo, estrarre lo stampo usando una pinza ed estrarre con cura il cubo di metallo in alluminio lavorato dallo stampo. Quindi, vai al lavandino e sciacqua lo stampo con acqua deionizzata, quindi posiziona lo stampo su un tovagliolo di carta ad asciugare.

Una volta asciutto, usa un taglierino per hobby per tagliare delle fessure a 2,34 millimetri di distanza da ciascuna estremità longitudinale all'interno dello stampo in silicone. Assicurarsi che lo stampo rimanga in un luogo sicuro e asciutto fino a quando non è necessario per l'esperimento prima dell'uso. Sciacquare lo stampo con etanolo al 90% e metterlo in una capsula di Petri riempita con acqua deionizzata per riposare per una notte.

La mattina dopo, trasferisci lo stampo su un tovagliolo di carta e lascialo asciugare all'aria mentre lo stampo si asciuga. Utilizzare uno strumento di incisione a diamante ad alta precisione per tagliare il quadrato. La copertura idrofila scivola in due rettangoli, leggermente più grandi di 3,95 millimetri per 5,99 millimetri.

Quindi far scorrere ciascuna delle guide di copertura rettangolari tagliate nelle fessure, tagliare nello stampo in silicone, capovolgere lo stampo e applicare grasso sottovuoto lungo il fondo dello stampo in silicone utilizzando una pipetta usa e getta. Quindi, capovolgere lo stampo con il lato destro rivolto verso l'alto e premere la parte inferiore dello stampo sul vetrino circolare idrofilo. Per creare una guarnizione, preparare una miscela di terreno e chemio-attrattivo in una provetta da 15 millilitri alla concentrazione desiderata, pipettare cinque millilitri di miscela in una nuova provetta da millilitri e cinque millilitri di terreno semplice in una seconda provetta.

Spostare entrambi i tubi in un bagno d'acqua riscaldato a 37 gradi Celsius. Pipettare quindi 30 microlitri di 10 XPBS in una provetta per microcentrifuga. Aggiungere sei microlitri di una normale soluzione di idrossido di sodio nella stessa provetta da microcentrifuga e agitare per 15 secondi.

Quindi aggiungere 18 microlitri di carbossilato fluorescente giallo-verde, microsfere modificate a una provetta da microcentrifuga e 168,3 microlitri di ghiaccio freddo. Collagene di coda di topo di tipo uno. Agitare il composto per 30 secondi.

Quindi, aggiungi 77,7 microlitri della cellula desiderata. Digitare due volte da 10 a sei cellule per millilitro nel terreno nella provetta della microcentrifuga e mescolare. Utilizzando la punta di una pipetta per 20 secondi, pipettare 300 microlitri della miscela di cellule di collagene nel pozzetto centrale del gruppo stampo preparato.

Quindi posizionare lo stampo su una capsula di Petri usa e getta e spostarlo in un'incubatrice standard per 20 minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica Dopo il periodo di incubazione, utilizzare una pinza per rimuovere entrambi i vetrini coprioggetti idrofobici bloccando la parte superiore di ciascun vetrino coprioggetti, quindi tirandolo verso l'alto e allontanandolo dallo stampo. Spostare l'intero sistema al microscopio ed esaminare la camera per assicurarsi che i lati dello stampo di collagene siano ancora dritti, consentendo un gradiente di diffusione pialla con un sistema ancora sotto il microscopio. Aggiungere 100 microlitri di terreno cellulare nel primo pozzetto.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di terreno cellulare con la concentrazione di chemio-attrattivo desiderata nel pozzetto sull'altro lato della matrice. Traccia la migrazione cellulare in riferimento alle microsfere marcate in fluorescenza come descritto nel protocollo di testo allegato. La serie di immagini qui presentate mostra la diffusione della rumina che si muove attraverso un gel di collagene da un milligrammo per millilitro.

Questo esempio mostra il vero gradiente di diffusione planare del sistema, che ci si può aspettare anche da qualsiasi chemio-attrattivo introdotto. Nell'esempio mostrato qui, l'intensità del segnale della rumina è stata misurata nel tempo nelle posizioni identificate dai quadrati rossi. La concentrazione in ciascuna di queste posizioni è mostrata in questo grafico come una linea separata, che se misurata allo stato stazionario, produce un gradiente di concentrazione lineare basato sulla posizione nel gel.

Questa relazione rimane lineare in una gamma di concentrazioni di matrice di collagene, rendendo questo sistema molto utile per gli esperimenti cellulari. In questa immagine, un neutrofilo di colore rosso è mostrato all'interno di una matrice di collagene disseminata di microsfere verdi fluorescenti che vengono utilizzate come riferimenti di posizione. Le tre immagini successive mostrano la migrazione diretta del neutrofilo mentre si muove verso l'alto in un gradiente di chemio-attrattivo, che è raffigurato dalla freccia bianca.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare una semplice camera di diffusione per studiare la migrazione cellulare in una matrice di collagene 3D.