Name: Planar gradiente di diffusione del sistema per Indagare Chemiotassi in un 3D collagene Matrix (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Impara a creare una camera di diffusione a gradiente planare per studiare la chemiotassi in una matrice di collagene 3D. Questo metodo utilizza microscopia confocale per tracciare la migrazione cellulare nel tempo.

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Gli autori desiderano ringraziare i dottori Jonathan Reichner e Angle Byrd per l'intuizione dell'esperimento cellulare. Il National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) ha sostenuto questo lavoro.

1. 3D Mold Design e parti di ricambio <ol><li> Muffa <ol><li> Prima di lavorare, di ottenere un kit di elastomero siliconico, una camera di imaging cellulare dal vivo, un vetrino di vetro di 22 mm e un cubo di metallo alluminio lavorato con dimensioni 10,07 millimetri x 3,95 millimetri x 5,99 millimetri. Preparare la camera di cellule vive per stampaggio ponendo il vetrino nel supporto inferiore e montaggio del resto della camera come indicato dal produttore. </li><li> Successivamente, utilizzando una pinza, posizionare il cubo di metallo alluminio lavorato al centro della custodia camera di imaging cellulare dal vivo e sulla parte superiore del vetrino, e poi mettere da parte. </li><li> Mescolare soluzioni elastomero siliconico secondo il protocollo del produttore per fare 5 ml di elastomero. </li><li> Utilizzando un laboratorio spatola monouso, versare la soluzione elastomero siliconico in configurazione camera di imaging cellulare dal vivo e garantire di non muoversi messo lavorato cubo di metallo alluminio. Posizionare il sistema sul banco di laboratorio, in una posizione sicura O / N per curare. </li><li> La mattina dopo, decostruirela camera di imaging cellulare dal vivo, come raccomandato dal costruttore e tirare fuori la muffa con pinze. Utilizzando pinze, estrarre con attenzione il cubo di metallo alluminio lavorato da muffe. Vai al lavello e lavare lo stampo con acqua deionizzata. Mettere lo stampo su un tovagliolo di carta per asciugarsi. </li><li> Una volta asciutto, di un coltello multiuso mio hobby, tagliare fessure attraverso lo stampo, distanziati 2,34 millimetri di distanza l&#39;uno estremità longitudinale, all&#39;interno dello stampo in silicone. Assicurarsi che i soggiorni di stampo in un luogo sicuro e asciutto fino a quando si è pronti a costruire il sistema per un esperimento. </li></ol></li><li> Idrofili e idrofobi vetro coprioggetto Preparazione <ol><li> Per consentire la matrice di collagene di aderire ad una superficie, creare coprioggetto idrofili: <ol><li> Usando una pipetta monouso, misurare 150 ml di 3-amminopropil-trimetossisilano e versare la soluzione in un tubo da 50 ml. Aggiungere 30 ml di etanolo al 100% al tubo 50 ml con una seconda pipetta monouso e chiudere il coperchio. Vortex la soluzione per 2 minuti, assicurando la completa miscelazione. Pla nostra soluzione in una capsula di Petri di vetro e mettere da parte. </li><li> Versare 15 ml di alcol etilico al 100% in un secondo piatto di Petri e mettere da parte (assicuratevi di etichettare i piatti). </li><li> Utilizzando una nuova pipetta monouso, misurare 30 ml di acqua deionizzata e versare la soluzione in una provetta da 50 ml. Successivamente, utilizzando una nuova misura pipetta usa e getta su 1.875 ml di glutaraldeide e versare la soluzione nello stesso tubo da 50 ml e chiudere il coperchio. Vortex la soluzione per 2 minuti, assicurando la completa miscelazione. Versare il composto in terza piastra di Petri, e mettere da parte. </li><li> Utilizzando pinze, togliere un 22 millimetri coprioggetto di vetro rotondo e risciacquare entrambi i lati con 100% di miscela di etanolo con una pipetta monouso. </li><li> Inserire coprioggetto di vetro risciacquati in 3-amminopropil-trimetossisilano con 30 ml di etanolo al 100% piatto soluzione e lasciar riposare in soluzione per 5 min. </li><li> Con una pinza, estrarre coprioggetto di vetro e sciacquare di nuovo con soluzione di etanolo al 100% con la pipetta monouso. </li><li> Goccia coprioggetto di vetro risciacquato in 1.875ml di glutaraldeide e 30 ml di miscela di acqua deionizzata e mettere da parte per 30 min. </li><li> Dopo 30 minuti, rimuovere coprioggetto di vetro con una pinza e sciacquare con acqua deionizzata e collocarlo su asciutto O tessuto / N ad asciugare a temperatura ambiente. </li><li> Ripetere immersione coprioggetto e in movimento per il numero di lamelle, se necessario con le stesse soluzioni generate. </li></ol></li><li> Fai coprioggetto idrofobiche dal protocollo data. <ol><li> Aggiungere 500 pl di tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl, 100 ml di acido acetico e 19,4 ml di esano in una provetta da 50 ml e agitare per 2 min. Versare la soluzione in vetro piastra di Petri e mettere da parte. </li><li> Utilizzando pinze pulite, togliere un vetrino di vetro e cadere in soluzione mista preparata per 2 minuti. Dopo 2 minuti sono passati, togliere vetrino di vetro con una pinza e sciacquare con acqua deionizzata con una usa e getta pipetta e luogo coprioggetto su asciutto O tessuto / N ad asciugare a temperatura ambiente. Conservare vetrino in piatti di plastica Petri fino all&#39;uso. </li><li> Ripetere coprioggetto DIPPzione e spostando a molti coprioggetto come necessario con le stesse soluzioni generati. </li></ol></li></ol></li></ol> Assemblea 2. Mold <ol><li> Prima di utilizzare stampi, usando una pipetta monouso lavare lo stampo con il 90% di alcool etilico su un contenitore per rifiuti chimici. Quindi, posizionare lo stampo in una capsula di Petri riempita con acqua deionizzata e lasciar riposare O / N. </li><li> Prendete muffa dalla soluzione con pinze e posto su un telo ad asciugare prima di avviare il gruppo di forma. </li><li> Mentre lo stampo è aria di essiccazione, tagliare i coprioggetti idrofili quadrata in due rettangoli leggermente più grandi 3,95 millimetri x 5,99 millimetri utilizzando uno strumento diamante scribing alta precisione. Far scorrere ogni vetrino taglio rettangolo nelle fessure tagliate nello stampo in silicone. </li><li> Vibrazione dello stampo capovolto e applicare grasso per vuoto lungo il fondo dello stampo in silicone con una pipetta monouso. Avanti, capovolgere lo stampo posteriore lato destro in alto e premere il fondo dello stampo sulle coperture in vetro idrofili circolarilabbro per creare una tenuta. </li><li> Con guanti monouso, prendere lo stampo montato e mettere in un piatto e getta Petri e poi in un bio-cappuccio. Accendere lampada UV Bio-cappuccio per 1 ora per sterilizzare lo stampo prima che si verifichi la sperimentazione. </li></ol> 3. Il collagene miscela e 3D Matrix <ol><li> Prima di preparare la miscela di collagene, macchia e preparare le cellule per l&#39;imaging secondo protocolli standard 28. </li><li> Utilizzando tecniche di laboratorio standard e protocolli 29,30, in un bio-hood, mescolare carta cellulari e chemiotattico in un tubo da 15 ml alla concentrazione chemoattractant desiderata. Pipettare 5 ml di soluzione specifica cella media-chemiotattico concentrazione in una provetta da 15 ml e spostare la soluzione in un bagno d&#39;acqua riscaldata. </li><li> Usando una pipetta, estrarre 5 ml di supporti cellulari solo in un secondo tubo da 15 ml e posto in un bagno d&#39;acqua riscaldata per riscaldare la soluzione per esperimenti di microscopia. </li><li> In un bio-hood, pipetta 30 ml di 10x tampone fosfatosoluzione ed (PBS) in micro provetta da centrifuga. Aggiungere 6 ml di 1 N di idrossido di sodio (NaOH) in stessa provetta da centrifuga micro e vortex per 15 sec. </li><li> Ottenere soluzione coda di ratto collagene I dal frigo e passare al bio-cappa utilizzando tecniche di laboratorio standard e protocolli 29. Assicurarsi che il collagene è ancora freddo. Pipetta 168,3 ml di collagene nella stessa provetta da centrifuga micro. </li><li> Successivamente, aggiungere 18 ml di microsfere carbossilato modificato fluorescenti giallo-verde con una pipetta alla stessa provetta da centrifuga micro. Vortex provetta micro con tutte le soluzioni per 30 sec. </li><li> Aggiungere 77,7 ml di desideri miscela di cellule media-cell (circa 2 x 10 6 cellule / ml concentrazione) in micro tubo di centrifuga e miscelare con puntale per 20 sec. Se necessario, modificare la densità matrice seguendo la miscela collagene personalizzato adattato per l&#39;aggiunta di perline fluorescenti e tavolo vitalità cellulare (Tabella 1). </li><li> Dispensare 300 &amp; #181; l di miscela di collagene-cellule al centro (pozzetto 2 #) del complesso di stampo preparato. Collocare lo stampo su un piatto Petri monouso e spostarlo in un incubatore standard per 20 min a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Togliere sistema da incubatore e mettere di nuovo in bio-cappuccio. Utilizzando pinze, rimuovere entrambi i vetrini idrofobici fissando sulla parte superiore di ogni vetrino e tirando alto e lontano dallo stampo. </li><li> Spostare l&#39;intero sistema alla microscopia e immagine desiderata per assicurare lati dello stampo collagene sono ancora diritto per consentire un gradiente planare diffusione. </li><li> Con il sistema ancora sotto il microscopio, utilizzando un 100 microlitri monocanale pipetta, aggiungere 100 ml di supporti cellule nel pozzetto 1 #. Successivamente, utilizzando una 100 pl monocanale pipetta aggiungere 100 ml di media cella con concentrazione chemoattractant desiderato nel bene # 3. </li><li> Subito dopo l&#39;aggiunta di soluzioni in entrambi i pozzi, iniziare imaging. </li></ol> 4. Imaging e DiffusioneModellismo <ol><li> Se si vuole trovare il coefficiente di diffusione per la densità del collagene specifico per calcolare la concentrazione specifica, seguire il protocollo di seguito: <ol><li> Seguire il protocollo di cui sopra dal titolo &quot;miscela di collagene e 3D Matrix&quot;, invece di generare supporti cella con concentrazione chemoattractant desiderata, fare 5 micron rhodamine in un tubo da 15 ml con calcoli e protocolli 30 standard. </li><li> Immagine matrici collagene 3D con un sistema confocale montato su un microscopio invertito utilizzando un laser ad argon (488 nm) per catturare la fluorescenza. Immagine ogni 2 o 3 secondi per un massimo di 7 ore. </li></ol></li><li> Per Modeling Diffusione: Usando il modello matematico mostrato di seguito, scrivere un codice software di calcolo per l&#39;elaborazione e l&#39;analisi di questi passaggi generali. <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq1.jpg" /><ol><li> Importazione di immagini in software di calcolo per ridimensionamento e normalizzazione da parte della massima intensità. Converti immagini in un colore grigio-mappa dell&#39;immagine per selezionare il bordo. Scegliere un asse lungo il centro dell&#39;immagine, a destra del centro e alla sinistra del centro. </li><li> Usando il codice del software di calcolo, tracciare l&#39;intensità normalizzata, insieme con la vera intensità e la differenza tra i due. </li><li> Quindi, immettere i parametri necessari per il montaggio (concentrazione, tempo e lunghezza). </li><li> Tracciare la concentrazione normalizzata in funzione del tempo e il profilo di concentrazione attraverso l&#39;asse x con un&#39;approssimazione polinomiale ai dati. </li><li> Calcolare il coefficiente di diffusione utilizzando il codice software di calcolo. </li></ol></li></ol> 5. Misure sperimentali <ol><li> Riferendosi di nuovo alla equazione di diffusione, riscrivere l&#39;equazione per determinare la concentrazione specifica in qualsiasi posizione all&#39;interno del sistema, come mostrato in seguito. <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq2.jpg" /> Dove: L = Lunghezza del the matrice di collagene x = posizione sotto inchiesta D = coefficiente di diffusione t = tempo trascorso </li><li> Durante gli esperimenti di chemiotassi, assicurarsi di registrare il tempo specifico che il momento chemochina è stato aggiunto al sistema. Una volta trovato il movimento migrazione delle cellule, assicurarsi di registrare confocale time-lapse, e prendere nota del tempo specifico e la posizione dal bordo dove si è verificato l&#39;imaging. </li><li> Durante l&#39;analisi dei dati, inserire il noto tempo trascorso, la posizione e il coefficiente di diffusione per la cella specifica nell&#39;equazione per trovare la concentrazione specifica normalizzata in qualsiasi punto all&#39;interno del collagene sia per diffusione e esperimenti sulle cellule. </li></ol> 6. Monitoraggio migrazione cellulare Utilizzando TFM <ol><li> Per monitorare la migrazione delle cellule utilizzando tecniche TFM / DVC seguire il protocollo di seguito: <ol><li> Dopo l&#39;aggiunta di concentrazione chemoattractant desiderato nel pozzetto 3 #, avviare l&#39;imaging delle matrici di collagene 3D con un sistema confocale montato su un micr invertitaoscope per trovare una cella per indagare. </li><li> Una volta che una cellula in movimento viene trovato, posizionare la cella al centro del campo visivo e utilizzare un motore piezoelettrico (all&#39;immagine in asse z), un&#39;immagine ogni 1 o 2 min. </li><li> Per calcolare la generazione di forza cellulare e deformazione, generare un codice di calcolo per trovare gli spostamenti delle perline fluorescenza seguenti protocolli TFM / DVC 31. </li></ol></li></ol>

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<li>Shenoy, V., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+Macromolecules+in+Collagen+and+Hyaluronic+Acid%2C+Rigid-Rod-Flexible+Polymer+Composite+Matrixes%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes.</a> Macromolecules. 28 (26), 8751-8758 (1995).</li>
<li>Leddy, H., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Molecular+Diffusion+in+Articular+Cartilage+Measured+using+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Ann. Biomed. Eng. 31 (7), 753-760 (2003).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Le fasi più critiche per esperimenti di diffusione di successo con o senza cellule sono: impostare correttamente il gruppo di forma; sviluppare la manualità necessaria per evitare danni durante l&#39;estrazione dei vetrini idrofobici; garantendo di trovare una buona linea di partenza lineare per calcolare correttamente il coefficiente di diffusione; correggere i calcoli sperimentali di collagene e chemiotattico; utilizzare correttamente del sistema di imaging cellulare dal vivo per assicurare matrice non si secca; e man...

Il movimento preferito di cellule verso un gradiente di concentrazione, noto come chemiotassi, svolge un ruolo importante in processi patologici e fisiologici del corpo. Tali esempi sono la pelle e le mucose guarigione delle ferite 1, morfogenesi 2, infiammazione 3, e la crescita tumorale 4,5. E &#39;stato anche dimostrato che le cellule tumorali possono migrare attraverso due strategie cellule migratorie individuali e collettive 6. Inoltre, i meccanismi di instabilità diffusionali possono indurre la separazione delle cellule singole o cluster da un corpo / oggetto tumorale e quindi in grado di emigrare verso una fonte di sostanze nutritive e di invadere le zone più ampie e tessuti 7 così. Inoltre, è stato dimostrato che i meccanismi di migrazione diverse possono essere attivi in 2D e in 3D, a causa di diversi ruoli delle molecole di adesione 8. Pertanto, una mossa per fisiologicamente rilevanti in vitro per indagare motilità cellulare in un measureable e modo semplice è di importanza nella comprensione movimento delle cellule fenomeni 9. Purtroppo, la difficoltà nell&#39;analisi migrazione cellulare, un completo test chemiotassi quantificabile solito richiede un metodo lungo laboriosa, fondata sulla misurazione della motilità cellulare e fenomeni di trasporto modelli imparziale. Approcci sperimentali passato per indagare chemiotassi cellulari includono la camera di Boyden 10 e il sotto dosaggio agarosio 11. Tuttavia, all&#39;interno di questi primi test, esperimenti di migrazione delle cellule non hanno controllano il movimento in relazione al tempo. Di più, importante, i gradienti di concentrazione usati per gli esperimenti sono stati non ben definiti o completamente compresi mentre solo sostenere la segnalazione per non più di qualche ora. Inoltre, presto chemiotassi tentativi camera limitato la migrazione delle cellule a due dimensioni e non permettono di monitorare la cinetica della migrazione 12. Guardando la camera di Boyden, un saggio finalenon consentirebbe al ricercatore di osservare la migrazione visivamente e non ha potuto differenziare direttamente chemiotassi (movimento direzionale) da chemochinesi (movimento casuale). Inoltre, diverse variabili differenze nella dimensione dei pori e lo spessore delle membrane-reso la camera molto difficile da riprodurre facilmente e nascosti reazione migrante delle cellule di chemochine 13,14. Con la nuova comprensione di microfluidica, nuove camere e micro-dispositivi sono stati studiati come strumento per indagare locomozione cella in condizioni di flusso interstiziali o chemiotassi 15,16. In questi nuovi dispositivi, sono stati introdotti e studiati, come l&#39;effetto di sollecitazione di taglio su una cella 17,18 nuove metriche cellulari. Purtroppo, le camere chemiotassi microfluidica passati e attuali limitati studi di migrazione cellulare a substrati-an 2D battuta d&#39;arresto importante dal momento che molti processi biologici, tra cui l&#39;invasione delle cellule tumorali e metastasi, e immigrazione cellulare mune, comporta migrazione 3D. Camere-dove osservazione diretta di una soluzione chemiotattico è in contatto con un gel 3D contenente cellule sono anche stati riportati anche 19,20. Queste camere hanno due scomparti, uno contenente un fattore chemiotattico e una contenente cellule, sono uniti l&#39;uno accanto all&#39;altro in orizzontale 21 o come anelli concentrici 22. Questi sistemi sono puntati nella giusta direzione, ma non mantengono un sistema di chemiotassi per un periodo di tempo prolungato. Inoltre, i ricercatori hanno esaminato diffusività attraverso membrane di collagene nelle cellule dialisi, nonché la diffusione delle molecole traccianti attraverso campioni di collagene sottoposta a pressione idrostatica 23-25. Alcuni esperimenti di diffusione in gel di collagene affidano a modificazioni fisiche e chimiche del gel utilizzando campi magnetici e incorporazione chimiche 26. Un metodo comune per la modellazione di diffusività in collatessuti azo tati si basa sulla fluorescenza del punto photobleaching continuo. Questo metodo ha rivelato anisotropia nei coefficienti di diffusione di macromolecole nei tessuti collageni orientati. Tuttavia, photobleaching è stato usato nella cartilagine articolare e non collagene matrici. Mentre simile, gli esperimenti di modellazione necessari devono essere effettuati tramite specificamente comprendere il coefficiente di diffusione del gel di collagene. Ancora più importante, i sistemi non utilizzano un metodo per misurare generazione di forza cella. Sfortunatamente, la maggior parte dei sistemi sembrano mancare uno o due elementi fondamentali per un sistema ideale: il che consente di inseguimento cellulare, una comprensione gradiente di diffusione con un fattore chemiotattico attraverso la matrice, un insieme relativamente semplice con una facilità di riproducibilità, la minimizzazione interazioni cellula-cellula, e la capacità di misurare unità dimensionali per quantificazione (cioè, velocità, forza, concentrazione specifica). Moghe et al. </em&gt; 27 ha proposto un sistema che soddisfaceva la maggior parte di questi requisiti in cui le cellule sono state inizialmente disperse nel gel anziché concentrati sulla superficie del filtro, ma era difficile misurare le forze che la cellula genera. A questo proposito, vi presentiamo un sistema planare gradiente di diffusione di indagare chemiotassi in una matrice di collagene in 3D, che permette di superare i limiti moderni camera di diffusione dei dosaggi esistenti, che si basa sulla microscopia time-lapse, associato a tecniche di analisi di immagine per la misurazione delle cellule forze in un ambiente 3D. Questo protocollo fornisce un modo semplice, ma innovativo di creazione di una semplice camera di diffusione 3D che può essere usato per studiare chemiotassi 3D in celle diverse.

<table><tbody><tr><td>Kit elastomero siliconico</td><td>Dow Corning Corp</td><td>182 SIL ELAST KIT .5KG</td><td>una miscela in due parti con una miscela 10:1</td></tr><tr><td>Camera di imaging per cellule vive</td><td>Strumento per cellule vive</td><td>CM-B18-1</td><td>CMB per 18&nbsp; mm vetrini coprioggetti rotondi</td></tr><tr><td>22&nbsp; mm Vetrino coprioggetti</td><td>Fisher</td><td>Scientific NC0180281</td><td>Neuvitro Corp. vetrino coprioggetto 22&nbsp; mm 1.5</td></tr><tr>Cubo <td></td><td></td><td></td><td>in metallo in alluminio lavorato</td></tr><tr><td>Coltello multiuso Hobby</td><td>X-Acto</td><td>X3201</td><td></td></tr><tr><td>3-(aminopropil) trimetossisilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00216A-10</td><td>Glutaraldeide, grado EM, tubo 8%</td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Pavimento standard Centrifughe modello e da tavolo Piastra</td></tr> di <tr><td>Petri in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747A</td><td>Piastre di Petri riutilizzabili: Completa (60 x 15&nbsp; </td></tr><tr><td>Pinza</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327-379</td><td>Pinza a Punta Fine</td></tr><tr><td>Copri occhiali</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-105A</td><td>Rettangolo; 30 x 22&nbsp; millimetro; Spessore n. 1</td></tr><tr><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottile</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Acido acetico ACS reagente, &ge; 99,7%</td></tr><tr><td>Esano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td>anidro, 95%</td></tr><tr><td>Alcool etilico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof, per biologia molecolare</td></tr><tr><td>Strumento di incisione in diamante ad alta precisione</td><td>Lunzer</td><td>PV-081-3</td><td>Scriba a punta estesa diritta, .020" (.50&nbsp; mm) diametro di .200" (5.0&nbsp; mm) lunghezza della punta</td></tr><tr><td>Grasso per vuoto</td><td>Dow Corning</td><td>14-635-5C</td><td>Grasso per alto vuoto Tubo</td></tr><tr><td>da 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>Provette da centrifuga coniche da 15 ml con superficie idrofoba e biologicamente inerte</td></tr><tr><td>10x soluzione tamponata con fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td>1,37 M di cloruro di sodio, 0,027 M di cloruro di potassio e 0,119 M di tampone fosfato</td></tr><tr><td>1&nbsp; N idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38215</td><td>Concentrato di idrossido di sodio</td></tr><tr><td>Collagene I, coda di ratto</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>Coda di ratto&nbsp;</td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-332</td><td>Volume: 2,0 ml; O.D. x L: 13&nbsp; x&nbsp; 40&nbsp; millimetro; sterile; single-wrapped</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Microsfere modificate con carbossilato</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; F-8813</td><td>Microsfere modificate con carbossilato, 0,5 &; m, fluorescente giallo-verde (505/515), 2% solidi</td></tr><tr><td>Rodamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83689</td><td>Rodamina B per fluorescenza</td></tr></tbody></table>

planar gradiente di diffusione del sistema per indagare chemiotassi in un 3d collagene matrix

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

L'importanza della migrazione cellulare può essere vista attraverso lo sviluppo della vita umana. Quando le cellule migrano, generano forze e trasferiscono queste forze nell'area circostante, portando al movimento e alla migrazione cellulare. Per comprendere i meccanismi che possono alterare e/o influenzare la migrazione cellulare, si possono studiare queste forze. In teoria, la comprensione dei meccanismi e delle forze fondamentali alla base della migrazione cellulare è la promessa di approcci efficaci per il trattamento delle malattie e la promozione del trapianto cellulare. Sfortunatamente, le moderne camere per chemiotassi che sono state sviluppate sono solitamente limitate a due dimensioni (2D) e hanno gradienti di diffusione complessi che rendono l'esperimento difficile da interpretare. A tal fine, abbiamo sviluppato, e descriviamo in questo articolo, una camera a visione diretta per studi di chemiotassi, che consente di superare gli ostacoli della moderna camera di chemiotassi in grado di misurare le forze cellulari e la concentrazione specifica all'interno della camera in un ambiente 3D per studiare la migrazione 3D cellulare. Più convincente, questo approccio consente di modellare con successo la diffusione attraverso matrici di collagene 3D e calcolare il coefficiente di diffusione di un chemioattrattivo attraverso più diverse concentrazioni di collagene, mantenendo il sistema semplice e facile da usare per la microscopia della forza di trazione (TFM) e l'analisi della correlazione digitale del volume (DVC).

La capacità di questo test per valutare con precisione la migrazione della cella si basa su una buona configurazione del sistema. Pertanto, è fondamentale per fare in modo di progettare lo stampo sistema di diffusione in modo accurato e fare molta attenzione nel porre coprioggetto sia idrofobe e idrofile, come illustrato nella figura 1. Se il sistema è correttamente progettato e durante la fase di modellazione diffusione garantendo trovare molto buona linea di partenza lineare, si è in grado di raggiung...

La migrazione cellulare è una parte importante dello sviluppo e della vita umana. Al fine di comprendere i meccanismi che possono alterare la migrazione cellulare, presentiamo un sistema di diffusione a gradiente planare per studiare la chemiotassi in una matrice di collagene 3D, che consente di superare i limiti della moderna camera di diffusione dei saggi esistenti.

Planar gradiente di diffusione del sistema per Indagare Chemiotassi in un 3D collagene Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare una camera di diffusione a gradiente planare per studiare la chemotassi in una matrice tridimensionale di collagene. Questo risultato si ottiene innanzitutto realizzando un modello in silicone 3D mediante l'utilizzo di una camera per l'immagineggiamento di cellule vive. Il secondo passaggio consiste nel preparare coprioggetti idrofili e idrofobi e nell'utilizzarli per assemblare il modello in silicone 3D.Successivamente, la miscela di cellule e collagene viene aggiunta al compartimento centrale e lasciata polimerizzare. L'ultimo passaggio consiste nel rimuovere le lamelle idrofobe dallo stampo dopo l'incubazione e nell'aggiungere mezzo basale in un serbatoio e mezzo contenente un chemiotattico nell'altro serbatoio. Infine, la microscopia confocale viene utilizzata per tracciare nel tempo la chemotassi cellulare e visualizzare lo spostamento delle cellule all'interno della matrice di collagene.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti come la camera a boina e la microelettroforesi consiste nella possibilità di utilizzare un allestimento semplice per studiare la migrazione nello spazio 3D mediante un gradiente di diffusione semplice, senza ricorrere a una pipetta monouso. Misurare 150 microlitri di amino seline A-P-T-M-S e versarli in un tubo da 50 millilitri. Successivamente, aggiungere 30 millilitri di etanolo al 100% al tubo utilizzando una seconda pipetta monouso e chiudere il coperchio.Vortexare la soluzione per due minuti per garantire un mescolamento completo. Successivamente, versare la soluzione in una piastra di Petri in vetro e metterla da parte. Poi, versare 15 millilitri di alcol etilico al 100% in una seconda piastra di Petri e posizionarla accanto alla prima piastra utilizzando una nuova pipetta monouso.Misurare 30 millilitri di acqua deionizzata e versare la soluzione in un tubo da 50 millilitri. Successivamente, utilizzare una nuova pipetta monouso per aggiungere 1,875 millilitri di glutaraldeide al tubo e chiudere il coperchio. Vortexare la soluzione per due minuti, quindi versare la miscela in una terza piastra di Petri.Utilizzando pinzette, prelevare un'ampolla di vetro rotonda da 22 millimetri e risciacquare entrambi i lati con una miscela di etanolo al 100%. Utilizzando una pipetta monouso, posizionare l'ampolla di vetro risciacquata nella prima capsula contenente amino seline e lasciarla in ammollo nella soluzione per cinque minuti, utilizzando pinzette. Rimuovere quindi l'ampolla di vetro e risciacquarla nuovamente con etanolo al 100%.Quindi depositare il vetrino in vetro risciacquato nella piastra con glutaraldeide e lasciarlo in posa per 30 minuti. Dopo 30 minuti, rimuovere il vetrino in vetro con una pinzetta e risciacquarlo con acqua deionizzata. Posizionare il vetrino risciacquato su un fazzoletto di carta per farlo asciugare tutta la notte a temperatura ambiente.Per preparare coprioggetti idrofobici, aggiungere prima 500 microlitri di TTS, 100 microlitri di acido acetico e 19,4 millilitri di eptano in un tubo da 50 millilitri e vortexare per due minuti. Versare quindi la soluzione in una capsula di Petri di vetro ed utilizzare pinzette pulite per immergere un coprioggetto di vetro nella soluzione preparata, lasciandolo in immersione per due minuti. Dopo due minuti, rimuovere il coprioggetto di vetro con le pinzette e risciacquarlo con acqua deionizzata utilizzando una pipetta monouso, quindi posizionare il coprioggetto su un fazzoletto di carta e lasciarlo asciugare a temperatura ambiente per tutta la notte.Conservare le lamelle essiccate in una capsula di Petri di plastica fino al momento in cui saranno necessarie. Successivamente, assemblare la camera per l'immagine in tempo reale delle cellule vive come descritto nel protocollo testuale allegato. Poi, mescolare le soluzioni dell'elastomero di silicone seguendo le istruzioni del produttore per ottenere cinque millilitri di elastomero. Quindi, utilizzare una spatola monouso per versare lentamente la soluzione di elastomero di silicone nell'apparato della camera per l'immagine in tempo reale delle cellule vive, evitando di disturbare i componenti dello stampo.Lasciare lo stampo in un luogo sicuro a temperatura ambiente per tutta la notte. La mattina seguente, rimuovere lo stampo con una pinzetta ed estrarre con cura il cubo di alluminio lavorato dallo stampo. Successivamente, recarsi al lavandino e risciacquare lo stampo con acqua deionizzata, quindi posizionare lo stampo su un tovagliolo di carta per farlo asciugare.Una volta asciutto, utilizzare un taglierino da modellismo per praticare delle fessure distanziate di 2,34 millimetri l'una dall'altra all'interno del stampo in silicone, partendo da ciascuna estremità longitudinale. Assicurarsi che lo stampo rimanga in un luogo sicuro e asciutto fino al momento dell'uso, prima dell'esperimento. Sciacquare lo stampo con etanolo al 90% e collocarlo in una piastra di Petri riempita con acqua deionizzata, lasciandolo in ammollo per tutta la notte.Il mattino seguente, trasferire lo stampo su un tovagliolo di carta e lasciarlo asciugare all'aria mentre lo stampo si asciuga. Utilizzare uno strumento di incisione al diamante ad alta precisione per tagliare il quadrato. Fette di coprioggetti idrofili in due rettangoli, leggermente più grandi di 3,95 millimetri per 5,99 millimetri.Quindi inserire delicatamente ciascun rettangolo di vetrino tagliato nelle fessure ricavate nel mold in silicone, capovolgere il mold e applicare grasso da vuoto lungo il fondo del mold in silicone utilizzando una pipetta monouso. Successivamente, rimettere il mold nella posizione corretta e premere il fondo del mold sul vetrino circolare in vetro idrofilo. Per creare una sigillatura, preparare una miscela di mezzo e chemiotattrante in un tubo da 15 millilitri alla concentrazione desiderata, pipettare cinque millilitri della miscela in un nuovo tubo da millilitro e cinque millilitri di mezzo semplice in un secondo tubo.Spostare entrambe le provette in un bagno termostatato riscaldato a 37 gradi Celsius. Successivamente, pipettare 30 microlitri di 10 XPBS in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere sei microlitri di una soluzione di idrossido di sodio 1 N nella stessa provetta da microcentrifuga e vortexare per 15 secondi.Quindi aggiungere 18 microlitri di microsfere fluorescenti verdi gialle carbossilate, modificate, in una provetta da microcentrifuga e 168,3 microlitri di collagene di coda di ratto di tipo uno freddo su ghiaccio. Vortexare la miscela per 30 secondi.Successivamente, aggiungere 77,7 microlitri del tipo cellulare desiderato a una concentrazione di due volte 10 alla sesta cellule per millilitro nel mezzo, in un tubo da microcentrifuga e mescolare. Utilizzando una punta di pipetta, pipettare per 20 secondi 300 microlitri della miscela di cellule e collagene al centro del pozzetto dell'assemblea del mold preparata.Quindi posizionare lo stampo su una piastra di Petri monouso e trasferirlo in un incubatore standard per 20 minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Al termine del periodo di incubazione, utilizzare le pinzette per rimuovere entrambe le lamelle idrofobiche afferrandone la parte superiore e tirando verso l'alto e lontano dallo stampo. Spostare l'intero sistema sul microscopio ed esaminare la camera per assicurarsi che i lati dello stampo in collagene siano ancora dritti, consentendo così un gradiente di diffusione planare con il sistema ancora sotto il microscopio. Aggiungere 100 microlitri di mezzo cellulare nel primo pozzetto.Successivamente, aggiungere 100 microlitri di mezzo cellulare con la concentrazione desiderata di chemiotrattante nel pozzetto sull'altro lato della matrice. Monitorare la migrazione cellulare in riferimento alle microsfere marcate fluorescentemente come descritto nel protocollo testuale allegato. La serie di immagini qui presentata mostra la diffusione della rumina attraverso un gel di collagene ad una concentrazione di un milligrammo per millilitro.Questo esempio mostra il vero gradiente di diffusione planare del sistema, che può essere osservato anche con qualsiasi chemioattrattante introdotto. Nell'esempio mostrato qui, l'intensità del segnale rumine è stata misurata nel tempo nei punti identificati dai quadrati rossi. La concentrazione in ciascuna di queste posizioni è riportata in questo grafico come linea separata, che, quando misurata a stato stazionario, produce un gradiente di concentrazione lineare in base alla posizione nel gel.Questa relazione rimane lineare in un intervallo di concentrazioni della matrice di collagene, rendendo questo sistema molto utile per esperimenti cellulari. In questa immagine, un neutrofilo colorato di rosso è mostrato all'interno di una matrice di collagene disseminata di microsfere fluorescenti verdi utilizzate come riferimenti di posizione. Le prossime tre immagini mostrano la migrazione diretta del neutrofilo mentre si sposta lungo un gradiente di chemiotattante, rappresentato dalla freccia bianca.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come creare una semplice camera di diffusione per studiare la migrazione cellulare in una matrice tridimensionale di collagene.

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Planar gradiente di diffusione del sistema per Indagare Chemiotassi in un 3D collagene Matrix

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