Name: Realizzazione di un funzionalizzato magnetico batterica Nanocellulose con nanoparticelle di Ossido di Ferro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Scopri come sintetizzare nanocellulosa batterica magnetica con nanoparticelle di ossido di ferro per applicazioni in ingegneria vascolare e trattamento minimamente invasivo di aneurismi cerebrali.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento della Difesa con contratto n. W81XWH-11-2-0067

1. Preparazione del batterica Nanocellulose (BNC) Nota: Tutte le operazioni vengono eseguite in condizioni asettiche, se non diversamente indicato. <ol><li> Preparare terreno di coltura. <ol><li> Preparare 500 ml di terreno di coltura liquido combinando 25 g di estratto di lievito, 15 g di peptone, 125,0 g di mannitolo e 500 ml di acqua ad elevata purezza. Autoclave questa miscela a 120 ° C per 20 min e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare 100 ml di supporti semisolidi aggiungendo 15 g di agar a 5,0 g di estratto di lievito, 3,0 g di peptone, 25,0 g di mannitolo e 100 ml di acqua ad elevata purezza. Autoclave questa miscela a 120 ° C per 20 min. Una volta autoclavato, deposito 5 ml della miscela in un x 16 mm plastica Petri 90 mm. Lasciare la soluzione di gel a 4 ° C e conservare a questa temperatura fino a nuovo uso. </li></ol></li><li> Reidratare G. xylinus ceppo conservato in fiale liofilizzate con l&#39;aggiunta di 1 ml di terreno di coltura liquido e pipettando su ebasso, come indicato dalle istruzioni del produttore. </li><li> Inoculare le piastre di Petri contenenti supporti semisolidi con piccole gocce di sospensione batterica utilizzando un ciclo inoculo. Assicurarsi che l&#39;inoculo copre l&#39;intera piastra Petri spostando l&#39;anello in una direzione zag zig dalla periferia al centro del piatto. </li><li> Incubare le piastre di Petri a 26 ° C per 72 ore in un incubatore senza CO 2. Dopo il periodo di incubazione, piccole colonie bianche sono visibili. Se non vengono utilizzati immediatamente le colonie, memorizzare le piastre Petri a 4 ° C sigillando il coperchio con parafilm e disporre le stoviglie capovolta. Le colonie possono essere memorizzati in questo modo fino a 6 mesi. </li><li> Trasferimento 2 ml di mezzo di coltura liquido preparato al punto (1.1.1) in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti di coltura tissutale. Prendere due colonie con un ago da inoculo delle piastre seminate Petri nella fase (1.3) e metterli nel primo pozzo della piastra di coltura tissutale. REPEAT la stessa procedura per le restanti 23 pozzetti. </li><li> Incubare la piastra di coltura tissutale a 30 ° C per 7 giorni. Ciò produrrà un totale di 24 BNC pellicole con diametro di 16 mm e uno spessore di circa 2-3 mm di diametro come illustrato in Figura 1. Nota: non disturbare la coltura batterica in qualsiasi momento durante il periodo di incubazione, per esempio agitando le piastre. Durante il periodo di incubazione, G. xylinus estrude molecole di zucchero glucopiranosio per formare una maglia cristallina polimerico nell&#39;interfaccia aria-liquido, che adotta la forma e le dimensioni del pallone in condizioni di coltivazione statiche. Questa matrice polimerica, detto nanocellulose batterica (BNC), è evidente alla fine del periodo di incubazione. </li><li> Raccogliere le pellicole BNC dal supporto di crescita e sterilizzare in 200 ml di 1% di soluzione di NaOH per 1 ora a 50 ° C, al fine di eliminare ogni traccia di G. xylinus. Opzionalmente, mescolare questa soluzione a 300 rpm con una barra magneticae una piastra di agitazione. Scartare la soluzione di NaOH e aggiungere 200 ml di soluzione preparata 1% NaOH. Ripetere lo stesso processo ancora una volta o fino a quando le pellicole BNC in soluzione acquisisce un aspetto traslucido. </li><li> Lavare le pellicole BNC con acqua tre volte e conservarli in acqua ad elevata purezza a temperatura ambiente. Assicurarsi che le pellicole BNC sono completamente immersi in acqua e non sono autorizzati a essiccare in qualsiasi momento. </li><li> Autoclave le pellicole BNC a 121 ° C per 20 min. Nota: Uno studio sottocutanea in vivo nel ratto eseguita da Martson e collaboratori hanno mostrato segni non degradazione del BNC dopo 60 settimane impianto. Infatti, BNC è degradabile in natura dagli enzimi microbici e fungine, assenti nei mammiferi. D&#39;altra parte, la biodegradabilità del BNC può essere il risultato di processi biologici che indeboliscono la rete microfibril in vivo 4 meccanica, chimica e. </li></ol> 2. Sintesi di Polymer-coatedDi ossido di ferro nanoparticelle e la sua deposizione in un batterica Nanocellulose membrana <ol><li> Bubble 1.000 ml di acqua ad elevata purezza con gas azoto per eliminare l&#39;ossigeno disciolto nell&#39;acqua e sostituirla con azoto. </li><li> Utilizzare un tre colli pallone a fondo tondo a preparare una soluzione in un rapporto 2: 1 molare di ferro (III) cloruro esaidrato (FeCl 3 · 6H 2 O) e ferro (II) cloruro tetraidrato (FeCl 2 · 4H 2 O) diluito con l&#39;acqua di elevata purezza deoxygenated. Ad esempio, utilizzare 5,4 g di FeCl 3 · 6H 2 O e 1,98 g di FeCl 2 · 4H 2 O in 10 ml di acqua ad elevata purezza deossigenato. Se questa preparazione diventa troppo viscoso e difficile da agitare, utilizzare 0,54 g di FeCl 3 · 6H 2 O e 0,198 g di FeCl 2 · 4H 2 O in 20 ml di acqua ad elevata purezza deossigenato. Nota: Ridurre il tempo di esposizione del 4H FeCl 2 · 2 O all&#39;aria pesando questo chcomposto emical il più velocemente possibile. Una volta introdotto nel pallone a fondo rotondo a tre colli, chiudere il tre colli pallone a fondo tondo con tappo setto finché non è collegato all&#39;alimentazione di gas azoto e il tubo del refrigerante. </li><li> Utilizzare due colli della nave per fornire un ingresso e l&#39;uscita di azoto costante collegando l&#39;alimentazione di gas azoto per un agugliato in un tappo setto e fissato al collo del vaso. </li><li> Posizionare 1 BNC pellicola che è stato preparato in precedenza al passo 1.5 (15,6 mm di diametro e 2-3 mm di spessore) nel recipiente con i reagenti. Assicurarsi che il campione è completamente sommerso nel liquido. </li><li> Collegare collo restante della nave verso un tubo del refrigerante. Inoltre, utilizzare un tubo di essiccazione riempito con solfato di calcio anidro in cima al tubo del refrigerante. Eseguire l&#39;acqua attraverso il tubo del refrigerante. </li><li> Sigillare tutti i giunti di vetro con grasso per vuoto. </li><li> Riscaldare la soluzione in un bagno di olio di silicone a 80 ° C con una agitazionepiastra e mantenere questa temperatura fino al punto 2.10. Utilizzare una piccola ancoretta magnetica per miscelare i reagenti a 350 rpm per 5 min. Assicurarsi che il BNC è opportunamente impregnato con la soluzione ferrosi e dei reagenti sono completamente sciolto. Tenere agitazione la miscela fino alla fine dell&#39;esperimento. Nota: Utilizzare un termometro per verificare la temperatura dell&#39;olio di silicone. Essa deve essere stabile a 80 ° C. </li><li> Aumentare la velocità di agitazione a 700 rpm e aggiungere (facendo cadere), in un intervallo di tempo di 5 minuti, 5 ml di idrossido di ammonio (NH 4 OH, 14%) al 10 ml di soluzione ferrosa utilizzando un ago pipettaggio, che è stata anche un pugno in un tappo setto. Dopo l&#39;aggiunta di idrossido di ammonio, il colore della soluzione cambia da giallo / arancio al nero. </li><li> Continuare a mescolare la soluzione a 80 ° C per altri 5 minuti. Evitare fermenti ad alta velocità al fine di mantenere l&#39;integrità del campione. Elevate velocità, cioè, superiore a 1.000 rpm, possono distruggereil campione. </li><li> Abbassare la temperatura della soluzione a 30 ° C utilizzando il fondo controllo della temperatura della piastra agitazione e mantenere agitazione per altri 5 minuti. Quindi, spegnere la piastra calda. A questo punto, il IONP sono stati inseriti nella rete BNC. </li><li> Raffreddare il composto fino a RT e separare le nanoparticelle magnetiche (MNP) e BNC con un forte magnete permanente (ad esempio, 1 Tesla). Per fare questo, trasferire la miscela in un pallone nave e quindi, mantenendo il magnete vicino alla nave, tenere il MNPs e il BNC in posizione mentre decantazione del supernatante. Nota: Fare attenzione nel maneggiare i magneti forti dal momento che possono essere dannosi se usati in modo errato. Per la procedura (2.12) - (2.14) e (2.16) utilizzano l&#39;acqua deossigenato elevata purezza preparata precedentemente in (2.1) per evitare che particelle dall&#39;ossidazione. </li><li> Risospendere il MNPs e BNC in 100 ml di acqua. Agitare delicatamente la soluzione per rimuovere tutte le MNPs che non sono fortemente incorporati nella BNC. Decantare il supernatant di nuovo tenendo il MNPs e il BNC in posizione con il magnete. </li><li> Lavare il MNPs e più volte BNC con acqua fino a quando il surnatante raggiunge pH neutro (pH ~ 7), come misurato utilizzando una striscia colorimetrico. </li><li> Separare il nanocellulose batterica magnetico-funzionalizzati BNC o magnetico (MBNC) dal MNPs con una pinzetta e sciacquare la MBNC più volte con acqua fino a quando l&#39;acqua è pulita. </li><li> Sterilizzare il MBNC esponendo il MBNC O / N a UV (110-280 nm). </li><li> Autoclave 500 ml di acqua ad elevata purezza deoxygenated a 120 ° C per 20 min e memorizzare il MBNC in 20 ml di questa acqua. </li><li> Asetticamente, immergere il campione in 1% di PEG e mescolare per 2 ore a temperatura ambiente (37 ° C). Questo procedimento migliora la biocompatibilità e la stabilità delle nanoparticelle di ossido di ferro depositato nel BNC, specificamente quelle esposte in superficie 5-7. Il rivestimento PEG sarà distribuita attraverso la rete MBNC 3D. Nota: Naked IONP sono facilmente ossidato in ariaa causa della loro elevata attività chimica 8. Anche se PEG è considerato un materiale non biodegradabile, la sua stabilità chimica dipende dalle condizioni biologiche applicate come contenuto di acqua, pH, temperatura, presenza di enzimi, specie reattive dell&#39;ossigeno, specie reattive, e 9 altri. </li></ol> 3. Caratterizzazione del BNC e MBNC pellicole <ol><li> Proprietà meccaniche <ol><li> Eseguire carico normale e test di scarico nanoindentazione con un penetratore Berkovich. Il raggio di Berkovich diamante penetratore è di 20 nm. </li><li> Utilizzare silice fusa e tungsteno calibrare area di contatto in funzione della profondità di penetrazione a RT. Durante la prova, montare i campioni nello indentazione con colla. Il penetratore avvicinato i campioni nella sua direzione di spessore. </li><li> Selezionerà casualmente posizioni di indentazione su superfici campioni. Mantenere la distanza tra 2 rientri tra 200-300 mm. </li><li> Applicare il carico allacampioni in passi e registrare lo spostamento corrispondente del penetratore. Analizzare la trama di carico vs profondità per trovare il modulo di Young. </li><li> Eseguire il test nanoindentazione dei campioni in presenza di acqua deionizzata (DI acqua), e prova applicando tassi di carico tra 0,0001 mN / sec e 0.005 mN / sec, con carico picco tra 0,01 mN e 0,60 mN. </li><li> Utilizzare una cella di liquido e mantenere i campioni in ambiente liquido. Questa configurazione unica per la caratterizzazione nanomeccaniche immerso in un ambiente fluido è ideale per simulare efficacemente la portata funzionalità biomeccanica delle membrane BNC e MBNC. </li></ol></li><li> Caratterizzazione strutturale da SEM <ol><li> Caratterizzare la struttura della fibra nanocellulose microscopio elettronico a scansione (SEM). </li><li> Lyophilize i campioni per 24 ore a -80 ° C. Poi montare su borchie SEM, polverizzare con il film Au-Pd per 10 secondi e analizzare mediante SEM. </li><li> Prende le immagini con un ingrandimento di 22,000Xe 60,000X, con una tensione di accelerazione di 5 kV. </li></ol></li><li> domini magnetici <ol><li> Lasciare le pellicole MBNC asciugare completamente a temperatura ambiente, e successivamente esporre per 5 minuti per un magnete permanente (1 Tesla). </li><li> Immediatamente, effettuare le misure di forza magnetica utilizzando un bio-AFM secondo il protocollo del produttore. </li><li> Per ciascuna misurazione, catturare prima le caratteristiche topografia e acquisire i domini magnetici durante un secondo passaggio. Ottenere entrambe le misure con la bio-AFM in modalità senza contatto. </li><li> Caratterizzazione magnetica delle nanoparticelle è condotta utilizzando vibrante magnetometro campione (VSM) nel sistema misurazioni proprietà fisiche (PPMS) di Quantum Design, a temperatura ambiente (300 K), con un campo magnetico nell&#39;intervallo da -10000 a 10.000 Oe. </li></ol></li><li> citocompatibilità <ol><li> Seme umano aortica cellule muscolari lisce (HASMC) in una piastra di coltura tissutale 6 pozzetti ad una densità di 1.0x10 <sup&gt; 3 cellule / cm 2 e incubare per 24 ore in presenza dei campioni: pellicole BNC e MBNC (ciascuna con uno schermo da 15,6 mm di diametro). </li><li> Utilizzare popolazioni di cellule non trattate e perossido trattata idrogeno come controlli negativi e positivi rispettivamente. </li><li> Eseguire il test di Comet secondo protocolli del produttore e le linee guida suggerite da A. Azqueta &amp; AR Collins 10. </li><li> Utilizzare il colorante acido nucleico SYBR oro in questo saggio di intercalare e fluorescente etichettare il DNA contenuto nei campioni elettroforesi secondo il protocollo del produttore. Nota: le cellule che non sono sottoposti ad alcuna danni al DNA in presenza di campioni BNC e MBNC, mostrerà una fluorescenza rotonda nucleoide verde, mentre le cellule danneggiate del DNA avranno lungo comete - campioni positivi avranno nucleoidi (la testa della cometa) seguito da code che contengono materiale DNA frammentato (percentuale di DNA nella coda). </li></ol></li></ol>

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<li>Cai, Z., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cellulose%2Fpoly%28ethylene+glycol%29+composite%3A+characterization+and+first+evaluation+of+biocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Cellulose%22%5BJournal%5D)">Bacterial cellulose/poly(ethylene glycol) composite: characterization and first evaluation of biocompatibility.</a> Cellulose. 17, 83(2010).</li>
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<li>Lina, F., Ping, Z., Shengmin, Z., Guang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+bacterial+nanocellulose-based+uniform+wound+dressing+for+large+area+skin+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Sci.+Eng.+C%22%5BJournal%5D)">Evaluation of bacterial nanocellulose-based uniform wound dressing for large area skin transplantation.</a> Mater. Sci. Eng. C. 33, 2995(2013).</li>
<li>Olsson, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+flexible+magnetic+aerogels+and+stiff+magnetic+nanopaper+using+cellulose+nanofibrils+as+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Making flexible magnetic aerogels and stiff magnetic nanopaper using cellulose nanofibrils as templates.</a> Nature Nanotech. 5 (8), 584-588 (2010).</li>
<li>Torre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+force+microscopy+and+energy+loss+imaging+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Magnetic force microscopy and energy loss imaging of superparamagnetic iron oxide nanoparticles.</a> Sci. Rep. 1 (202), 1-8 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lo spessore e la dimensione della pellicola BNC possono essere facilmente manipolati variando il tempo di incubazione e la dimensione del pallone in cui è cresciuto durante la coltivazione statica. I microproprietà del BNC, quali la porosità, possono essere modificate cambiando il rapporto di ossigeno nella cultura statica. Le concentrazioni di ossigeno maggiore resa più difficile BNC 11. A. Bodin e collaboratori hanno prodotto tubi di BNC con una pressione di scoppio fino al 880 mm Hg modificando il rapporto...

Il nanocellulose batteriologica (BNC) viene sintetizzato Acetobacter xylinum ceppo, noto anche come Gluconacetobacter xylinus, e depositato sotto forma di film o pellicole sulla interfaccia aria-liquido in coltura stazionaria. Queste pellicole BNC adottano la forma del contenitore in cui vengono coltivati, ed il loro spessore dipende dal numero di giorni in coltura. A. xylinus utilizza il glucosio nel mezzo per la sintesi delle microfibrille di cellulosa attraverso un processo di polimerizzazione e successiva cristallizzazione. La polimerizzazione dei residui di glucosio viene effettuata a membrana extracellulare batterica in cui le catene glucano sono estrusi da singoli pori distribuiti su cellule envelope. La cristallizzazione delle microfibrille di cellulosa verifica nello spazio extracellulare con la formazione di strati di catena glucano da van der Waals legame seguita impilando dei fogli da H-bonding 1. Magnetenanoparticelle ic integrati ad una matrice BNC possono essere manipolati facilmente da un campo magnetico esterno al fine di aumentare la forza necessaria per dirigere e confinare cellule muscolari lisce (SMC) contenente nanoparticelle magnetiche, al sito danneggiato della parete arteriosa. Questa strategia mantiene il CML lontano da altri tessuti, e tiene le celle al posto contro la forza esercitata dal flusso sanguigno. E &#39;stato dimostrato che SMCs svolgono un ruolo importante nella vasoelasticity del vaso sanguigno, dove formano strati abbondanti situate prevalentemente nella tunica media 2. Il metodo utilizzato per la sintesi di MBNC comporta BNC pellicle immerso e agitata in una soluzione di ferro (III) cloruro esaidrato e ferro (II) cloruro tetraidrato a 80 ° C. idrossido di ammonio viene aggiunta per formare nanoparticelle di ossido di ferro all&#39;interno della maglia BNC. L&#39;aggiunta di idrossido di ammonio cambia il colore della soluzione da arancione al nero. La compatta IONPs insieme lungo la fibrilla BNCs con una distribuzione non uniforme. Questo protocollo concentra sulla progettazione di un batterica pellicle nanoparticelle nanocellulose-magnetico, che abbiamo chiamato magnetica nanocellulose batterica (MBNC), che intende utilizzare in sostituzione di mancanti, vasi sanguigni di piccolo diametro danneggiati o feriti. HS Barud e collaboratori hanno recentemente pubblicato un lavoro simile per la produzione di una carta magnetica flessibile BNC a base mescolando pellicole BNC in una dispersione acquosa stabile di PEG e nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche 3. Qui, descriviamo la produzione di cellulosa batterica e la sua impregnazione in situ con nanoparticelle magnetiche. Un test di citotossicità in base alla rilevazione del singolo rotture del DNA è stato utilizzato per testare la biocompatibilità delle pellicole BNC e MBNC.

<table><tbody><tr><td>Glucoacetobacter xylinus</td><td>ATCC</td><td>700178</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296-500G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitolo Bioxtra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9546-250G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Peptone batteriologico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0556</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio, soluzione al 50% in acqua</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ferro (III) esaidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>236489-100G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio&nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>6665-46</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glicole etilenico), media Mn 400</td><td>Sigma Aldrich</td><td>202398-250G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ferro (II) tetraidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44939-250G</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri monouso</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BR452000</td><td></td></tr><tr><td>Anello di inoculazione monouso</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-604&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di calcio anidro</td><td>W.A. Hammond Drierite&nbsp;</td><td>13001</td><td></td></tr><tr><td>Grasso per alto vuoto</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Ago per pipettaggio da laboratorio con estremità smussate a 90 gradi</td> Strisce reattive <td>per pH Sigma Aldrich</td><td>CAD7937-12EA</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4786-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Pallone da distillazione a fondo tondo con angolo a tre colli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4965250</td><td></td></tr><tr><td>Olio siliconico per bagni d'olio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85409-250ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubo di essiccazione</td><td>Chemglass</td><td>CG-1295-01</td><td></td></tr><tr><td>Tappo del setto, tipo di manicotto</td><td>Chemglass</td><td>CG-3022-98</td><td></td></tr><tr><td>Barra di agitazione magnetica</td><td>Chemglass</td><td>CG-2001-05</td><td></td></tr><tr><td>Condensatore</td><td>Chemglass</td><td>CG-1218-01</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura</td><td>BriskHeat</td><td>SDC120JC-A</td><td></td></tr><tr><td>Piastra</td> <td>riscaldante per agitazioneFisher Scientifico</td><td>11-100-49SH&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi della cometa</td><td>Trevigen</td><td>4250-050-K</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>bio-AFM</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard 4a BioScience AFM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoindenter</td><td>Micro Materials Ltd</td><td>Tester meccanico multimodulo&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica a scansione (SEM)</td><td>Hitachi High Technologies America</td><td>Hitachi S-4800</td><td></td></tr></tbody></table>

realizzazione di un funzionalizzato magnetico batterica nanocellulose con nanoparticelle di ossido di ferro

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In questo studio, nanocellulose batterica (BNC) prodotto dal batterio Gluconacetobacter xylinus è sintetizzata e impregnato in situ con nanoparticelle di ossido di ferro (IONP) (Fe 3 O 4) per ottenere un nanocellulose batterica magnetica (MBNC). La sintesi di MBNC è un processo preciso e specificamente progettato multi-step. In breve, nanocellulose batterica (BNC) pellicole sono formate da conservato G. xylinus ceppo in base alle nostre esigenze sperimentali di dimensioni e morfologia. Una soluzione di ferro (III) esaidrato (FeCl 3 · 6H 2 O) e ferro (II) cloruro tetraidrato (FeCl 2 · 4H 2 O) con un 2: rapporto molare 1 viene preparata e diluita in acqua ad elevata purezza deossigenato. Una pellicola BNC viene quindi introdotto nel recipiente con i reagenti. Questa miscela viene agitata e riscaldata a 80 ° C in un bagno di olio di silicone e idrossido di ammonio (14%) viene quindi aggiunta da cadere per precipitare ilferrosi ioni nella maglia BNC. Questo ultimo passaggio consente di formare in situ di nanoparticelle di magnetite (Fe 3 O 4) all&#39;interno della rete nanocellulose batterica per conferire proprietà magnetiche a BNC pellicola. Un test tossicologico è stato utilizzato per valutare la biocompatibilità del pellicle BNC-IONP. Polietilenglicole (PEG) è stato utilizzato per coprire i IONPs al fine di migliorare la loro biocompatibilità. microscopia elettronica a scansione (SEM) immagini ha mostrato che la IONP si trovavano preferenzialmente nella fibrilla interlacciamento spazi della matrice BNC, ma alcuni di loro sono stati trovati anche lungo i nastri BNC. misurazioni microscopio a forza magnetiche eseguite sul MBNC rilevati i domini magnetici di presenza con il campo magnetico ad alta e debole intensità, a conferma della natura magnetica della pellicola MBNC. I valori modulo di Young ottenuti in questo lavoro sono anche in un accordo ragionevole con quelli riportati da diversi vasi sanguigni in studi precedenti.

Il periodo di incubazione di G. xylinus era un totale di 9 giorni, ma le pellicole cominciò a formare prima ed erano evidenti dopo circa 2 giorni. L&#39;aspetto macroscopico del BNC è illustrato nella Figura 1, la cui forma imita quella della cultura piatto coltivate. Figura 2 descrive il procedimento per produrre pellicole BNC-IONP, che riassume le principali fasi del protocollo di cui sopra nonché la configurazione dei compone...

Qui, presentiamo un protocollo per rendere magnetica una nanocellulosa batterica (BNC) per applicazioni nella ricostruzione di vasi sanguigni danneggiati. Il BNC è stato sintetizzato dal ceppo G. xylinus. D'altra parte, la magnetizzazione del BNC è stata realizzata attraverso la precipitazione in situ di ioni ferrosi Fe2+ e Fe3+ all'interno della rete BNC.

Realizzazione di un funzionalizzato magnetico batterica Nanocellulose con nanoparticelle di Ossido di Ferro

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

L'obiettivo generale di questa procedura è sintetizzare la nano-cellulosa batterica, o BNC, e renderla magnetica impregnandola in situ con nanoparticelle di ossido di ferro. Le membrane di BNC magnetiche sono progettate per attrarre e trattenere localmente cellule magnetizzate contro il flusso emodinamico. Il principale vantaggio della BNC magnetica sintetizzata in questa procedura è che consente un trattamento minimamente invasivo nelle vicinanze di aneurismi cerebrali.I trattamenti convenzionali degli aneurismi cerebrali, come la clipatura e l’emulizzazione del nucleo neurale e vascolare, sono invasivi e traumatici e non adatti alla maggior parte dei pazienti con rischi aumentati. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie vascolari, poiché innesti vascolari realizzati con impalcature magnetiche possono accelerare la guarigione migliorando il trattenimento cellulare nel sito della lesione. Iniziare questa procedura preparando il mezzo di coltura liquido come descritto nel protocollo testuale.Trasferire due millilitri di mezzo di coltura liquido in ogni pozzetto di una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti. Prelevare due colonie con un ago da inoculazione dalle piastre di Petri inoculate al passaggio precedente e posizionarle nel primo pozzetto della piastra per colture cellulari. Ripetere la stessa procedura per i restanti 23 pozzetti.Incubare la piastra per coltura cellulare a 30 gradi Celsius per sette giorni. Ciò produrrà un totale di 24 pellicole di BNC con un diametro di 16 mm e uno spessore di circa 2-3 mm. Raccogliere le pellicole di BNC dal mezzo di crescita e sterilizzarle in 200 millilitri di soluzione all'uno percento di idrossido di sodio per un'ora a 50 gradi Celsius per rimuovere ogni traccia di G. xylinus.Scartare la soluzione e aggiungere 200 millilitri di una soluzione di idrossido di sodio al uno percento appena preparata. Ripetere lo stesso processo ancora una volta o fino a quando le pellicole di BNC in soluzione assumono un aspetto traslucido. Risciacquare le pellicole di BNC con acqua per tre volte e conservarle in acqua ad alta purezza a temperatura ambiente.Assicurarsi che le pellicole di BNC siano completamente immerse nell'acqua e che non si secchino in nessun momento. Successivamente, sterilizzare le pellicole di BNC in autoclave a 121 gradi Celsius per 20 minuti. Per iniziare la sintesi, spurgare 1000 millilitri di acqua ad alta purezza con gas azoto per rimuovere qualsiasi ossigeno disciolto nell'acqua e sostituirlo con azoto.Utilizzare un pallone a fondo rotondo con tre collo per preparare una soluzione in rapporto molare 2 a 1 di cloruro ferrico esaidrato e cloruro ferroso tetraidrato, diluita con acqua ad alta purezza deossigenata. Utilizzare due colli del pallone per garantire un ingresso e un'uscita costante di gas azoto, collegando la fonte di azoto a un ago inserito in un tappo settato fissato al collo del pallone. Posizionare una pellicola BNC all'interno del pallone insieme ai reagenti.Assicurarsi che il campione sia completamente immerso nel liquido. Quindi, riempire tutti i giunti di vetro con grasso da vuoto. Collegare il collo rimanente del recipiente a un tubo condensatore sormontato da un tubo essiccante riempito con solfato di calcio anidro.Fare scorrere acqua attraverso il tubo del condensatore. Successivamente, riscaldare la soluzione in un bagno di olio siliconico a 80 gradi Celsius, utilizzando una piastra magnetica riscaldante e mantenere questa temperatura. Utilizzare un piccolo agitatore magnetico per mescolare i reagenti a 350 giri al minuto per 5 minuti.Assicurarsi che la BNC sia adeguatamente impregnata con la soluzione ferrosa e che i reagenti siano completamente sciolti. Aumentare la velocità di agitazione a 700 giri/min. In un intervallo di tempo di cinque minuti, aggiungere cinque millilitri di idrossido di ammonio ai 10 millilitri di soluzione ferrosa utilizzando un ago da pipetta inserito in un tappo settato. Dopo l'aggiunta dell'idrossido di ammonio, il colore della soluzione cambia da giallo-arancio a nero.Continuare a mescolare la soluzione a 80 gradi Celsius per altri cinque minuti. Evitare velocità elevate del mescolamento per mantenere l'integrità del campione. Abbassare la temperatura della soluzione a 30 gradi Celsius utilizzando il controllo della temperatura della piastra magnetica riscaldante e continuare a mescolare per altri cinque minuti.Quindi, spegnere la piastra riscaldante. A questo punto, le nanoparticelle di ossido di ferro sono state incorporate nella rete di BNC. Successivamente, raffreddare la miscela a temperatura ambiente e trasferirla in un matraccio per separare le nanoparticelle magnetiche, o MNPs, e la BNC utilizzando un magnete permanente potente.Per fare ciò, mantenere il magnete vicino al contenitore per trattenere le MNPs e la BNC mentre si decanta il soprannatante. Ri-sospendere le MNPs e la BNC in 100 millilitri di acqua. Agitare delicatamente la soluzione per rimuovere tutte le MNPs che non sono fortemente incorporate nella BNC.Quindi, versare nuovamente il soprannatante mantenendo le MNPs e la BNC in posizione mediante l'utilizzo di un magnete. Lavare le MNPs e la BNC diverse volte con acqua finché il soprannatante non raggiunge un pH neutro, misurato utilizzando una striscia colorimetrica. Separare la BNC funzionalizzata magneticamente, o MBNC, dalle MNPs utilizzando pinzette e risciacquare le MBNC diverse volte con acqua finché l'acqua non diventa limpida.Sterilizzare il MBNC esponendolo tutta la notte ai raggi UV. Conservare il MBNC in 20 millilitri di acqua deossigenata ad alta purezza, sterilizzata in autoclave a 120 gradi Celsius per 20 minuti. Immergere in modo asettico il campione nell'uno percento di polietilenglicole, o PEG, e agitare per due ore a temperatura ambiente. La rivestitura con PEG migliora la biocompatibilità e la stabilità delle nanoparticelle di ossido di ferro depositate nel BNC, poiché si distribuisce sulla rete tridimensionale del MBNC.L'aspetto macroscopico del BNC è mostrato qui. Il recipiente di coltura conferisce la forma alle pellicole. La microscopia elettronica a scansione rivela che nastri sottili formano la microstruttura del BNC con un diametro di circa 50 nanometri, i quali creano pori aperti lungo tutta la rete.La funzionalizzazione magnetica della BNC conferisce una struttura di fibrille meno compatta rispetto alla BNC. Le nanoparticelle di ossido di ferro si localizzano preferenzialmente tra i pori formati dall'intreccio delle fibrille. La topografia ottenuta mediante microscopia a forza atomica ha rilevato un gradiente di forza magnetica caratterizzato da due domini lungo la superficie del MBNC.Un campo magnetico ad alta intensità, mostrato in giallo, e un campo magnetico a bassa intensità, mostrato in verde. La presenza di domini magnetici osservata mediante microscopia a forza magnetica (MFM) è confermata dai dati ottenuti con il magnetometro a campione vibrante, che mostrano come le nanoparticelle di ossido di ferro siano superparamagnetiche, rendendo così il BNC magnetico. L'integrità del DNA nelle cellule muscolari lisce aortiche umane è preservata dopo un periodo di incubazione di 24 ore, quando le cellule sono coltivate in assenza e in presenza di BNC o MBNC, come evidente confrontando con le cellule sottoposte a trattamento con perossido di idrogeno.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rendere magnetica la nanocellulosa batterica per applicazioni nella ricostruzione di vasi sanguigni danneggiati. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo avuto la necessità di indurre un gradiente di densità di nanoparticelle magnetiche da disperdere all'interno della complessa matrice della rete di nanocellulosa batterica. L'integrazione delle nanoparticelle di ossido di ferro in questa rete ha richiesto che effettuassimo un metodo durante la sintesi della BNC.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà perché vi sono diversi passaggi complessi per impregnare le nano-particelle di ossido di ferro nella BNC.

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Bioengineering

Bioingegneria

Fonte: Arias, S. L., et al. Fabbricazione di una nanocellulosa batterica magnetica funzionalizzata con nanoparticelle di ossido di ferro. J. Vis. Esp. (2016)Questo video dimostra la sintesi in situ di nanoparticelle di magnetite all'interno di una pellicola batterica di nanocellulosa prodotta da Gluconacetobacter xylinus. Spiega come la nanocellulosa batterica magnetica venga generata tramite infusione di ioni ferro, precipitazione alcalina e purificazione.

Generazione di pellicole batteriche nanocellulose incorporate nella magnetite

Fonte: Arias, S. L., et al. Fabbricazione di una nanocellulosa batterica magnetica funzionalizzata con nanoparticelle di ossido di ferro.  J. Vis. Esp. (2016).Questo video dimostra la produzione di nanocellulosa coltivando batteri produttori di cellulosa in un mezzo nutriente contenente manitolo. I batteri metabolizzano il mannitolo in glucosio, che viene poi polimerizzato ed estruso come catene di glucani che cristallizzano in fogli di cellulosa, formando una matrice tridimensionale...

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