Name: Quantificazione dei citosolico vs. vacuolare Salmonella In primarie macrofagi di Permeabilization differenziale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Scopri come quantificare Salmonella citosolica e vacuolare in macrofagi primari derivati da midollo osseo usando la permeabilizzazione differenziale con digitonina. Questo metodo FACS distingue la localizzazione intracellulare del patogeno.

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Vorremmo riconoscere Mathias S. Dick, Roland F. Dreier e Sebastian Rühl per la discussione. Questo lavoro è stato supportato da un FNS Professorship PP00P3_139120 / 1 e Università di Basilea concessione progetto ID2153162 a PB

1. Digitonin Assay con mCherry esprimono Salmonella (FACS-based Analysis) <ol><li> Batteri Preparazione Nota: Salmonella wild-type SL1344 (streptomicina resistente) che esprime mCherry da un plasmide (pFPV codifica mCherry sotto il promotore RPSM) viene utilizzato in questo test. Fagocitosi batterica e la proliferazione in cui non alterata dalla espressione costitutiva di mCherry (dati non riportati) 16. <ol><li> Inoculare il ceppo 1 giorno prima della infezione in 3 ml di terreno LB addizionato con streptomicina (90 mg / ml) e ampicillina (100 ug / ml, mCherry esprimendo vettore) in un agitatore a 37 ° CO / N. </li></ol></li><li> Placcatura cellule per l&#39;infezione. <ol><li> Seed wild-type BMDMs in un piatto ben 24 con una densità di 1,25 x 10 5 cellule / pozzetto in 1 ml di terreno macrofagi primaria (DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino (FCS, inattivato al calore, 56 ° C, 30 min ), 1% HEPES, 1% di aminoacidi non essenziali (NEAA), 1% di L-glutammina e il 10% L929 surnatante (medium condizionato da macrofagi fattore stimolante le colonie (M-CSF) che producono cellule L929). Pozzi seme secondo la tabella 1 per tenere conto di condizioni individuali. Aggiungere coprioggetto ai pozzetti utilizzati come controlli (Tabella 1). </li><li> Incubare le cellule durante la notte in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Permeabilization </td><td colspan="3"> Colorazione </td></tr><tr><td></td><td> Vetrino di vetro </td><td> Salmonella </td><td> Digitonin </td><td> Saponina </td><td> anti-Salmonella </td><td> anti-calnexina </td><td> anti-PDI </td></tr><tr><td> A1 (campione) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A2 (campione) </td><td> - / + * </td><td> + </td&gt; <td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A3 (campione) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A4 (nessun controllo permeabilizzazione) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A5 (controllo completo permeabilizzazione) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> B1 (colorate per calnexina) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B2 (colorate per calnexina) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B3 (colorate per calnexina) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> C1 (macchiatoper PDI) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C2 (colorate per PDI) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C3 (colorate per PDI) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td></tr></tbody></table> Tabella 1: schema di placcatura per midollo osseo macrofagi derivati ​​(BMDMs) in un formato a 24 pozzetti per la successiva infezione da Salmonella, permeabilizzazione, e la colorazione * A seconda se protocollo 1 o il protocollo 2 è fatto.. <ol start="3"><li> Preparare i batteri per l&#39;infezione. <ol><li> Il giorno successivo, determinare la concentrazione di Salmonella nella cultura overnight diluendo cultura 1:10 in PBS e misurando la OD 600 contro un unico controllo PBS. Questo assicura che la OD 600 è misurata nella lgamma inear dello spettrofotometro. </li><li> Calcolare la concentrazione di Salmonella per ml. Un OD600 di 1 corrisponde a 1 x 10 9 batteri. </li><li> Diluire i batteri in media macrofagi per raggiungere una concentrazione di Salmonella 1,25 x 10 6 cellule / ml. </li></ol></li><li> L&#39;infezione di cellule con Salmonella. <ol><li> Rimuovere media da BMDMs. Aggiungere 1 ml di terreno macrofagi di pozzetti di controllo non infetti (B1-B3, C1-C3). Aggiungere 1 ml di sospensione Salmonella nei pozzetti A1 - A5 per raggiungere una molteplicità di infezione (moi) di 10 batteri per cellula. </li><li> Centrifugare la piastra per 15 min a 300 xg a 37 ° C per sincronizzare l&#39;infezione. Trasferire la lastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol></li><li> Uccidere Salmonella extracellulare con Gentamicina. <ol><li> A 1 ora dopo l&#39;infezione, rimuovere la piastra da incubatore e aggiungere 0,1 ml di terreno macrofagi contenenti 0,1 mg / ml Gentamicinaper uccidere i batteri extracellulari. Aggiungere gentamicina a tutti i pozzetti, anche ai controlli non infetti, per garantire che tutte le cellule sono trattate nello stesso modo. Trasferire la lastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol></li><li> Lavare le cellule. <ol><li> A 2 ore dopo l&#39;infezione, rimuovere piatto da incubatore e lavare tutti i pozzetti 2x con 1 ml di DMEM pianura (pre-riscaldato a 37 ° C) e sostituirlo con media macrofagi (pre-riscaldato a 37 ° C), contenente 10 mg / ml &#160; Gentamycin per prevenire la crescita di tutte le rimanenti batteri extracellulari. Trasferire la lastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol></li><li> Preparazione tamponi freschi con detergenti e anticorpi. <ol><li> Poco prima del punto di tempo desiderato di analisi, preparare una soluzione madre fresco digitonina a 1 mg / ml in KHM Buffer (acetato di potassio 110 mM, HEPES 20 mM, MgCl 2 2 mM, pH 7,3). Filtrare il brodo e diluire in KHM tampone a una concentrazione di lavorodi 50 mg / ml di digitonina. Inoltre, preparare una soluzione di 0,1% in saponina KHM Buffer, anti-anticorpo Salmonella accoppiato al FITC (CSA-1-FITC) a 1/500, anti-calnexin a 1/100 o anti-PDI a 1/100 in KHM Buffer integrato con 3% BSA. </li></ol></li><li> Permeabilizzazione cellulare. <ol><li> Rimuovere la piastra da incubatore e lavare i pozzetti 3x con 0,5 ml di KHM Buffer (pre-riscaldato a 37 ° C). Rimuovere KHM Buffer e aggiungere 0,25 ml pianura KHM tampone ai pozzetti A4 e B1 / C1, KHM tampone con digitonina nei pozzetti A1 - A3 e B2 / C2 o KHM tampone con saponina di pozzi A5 e B3 / C3 (secondo la tabella 1). Incubare per esattamente 1 minuti a temperatura ambiente e immediatamente lavare tutti i pozzetti 3x con 0,5 ml di KHM Buffer (pre-riscaldato a 37 ° C). </li></ol></li><li> Colorazione anticorpo primario. <ol><li> Rimuovere il tampone KHM e aggiungere le soluzioni di anticorpo primario (capra anti- Salmonella -FITC, 250 microlitri / bene, 0.1 mg / ml) per i pozzetti (Figura 1 </strong&gt;, Tabella 1). Incubare la piastra per 15 minuti in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Lavare le cellule 1x con 1 ml di PBS. </li></ol></li><li> Cellule infettate (pozzi A1 - A5): analisi FACS <ol><li> Lavare le cellule 3x con PBS e aggiungere 0,5 ml di ghiacciata PBS contenente 0,1% Triton. Trasferire in una provetta 5 ml FACS con tappo colino cella per rompere aggregati di cellule. I campioni in ghiaccio. </li><li> Analizzare i campioni di un FACS. Utilizzando i controlli completamente permeabilizzate, impostare la porta per i batteri totali basati su avanti e scatter laterale (FSC / SSC) in primo luogo, e il segnale mCherry (610 nm ± 20 nm filtro). </li><li> Avanti, analizzare il segnale FITC nella popolazione batterica totale utilizzando i controlli permeabilizzate completamente permeabilizzate e non per impostare le porte per i batteri citosoliche (FITC +, mCherry +) e batteri vacuolari (FITC, mCherry +) (Figura 3). </li><li> Con impostare le porte, analizzare i campioni e determinare la percentuale di rispetto citosolicobatteri vacuolari utilizzando il software FlowJo secondo il protocollo del produttore. </li></ol></li><li> Controlli permeabilizzazione non infette (pozzi B1 - B3, C1 - C3): microscopia <ol><li> Fissazione <ol><li> Rimuovere PBS e aggiungere 250 ml di PFA 4% in PBS. Incubare per 10 minuti a 37 ° C. </li><li> Lavare i pozzetti 2x con 1 ml di PBS e aggiungere 250 ml di 0,1 M glicina in PBS per 10 minuti per placare il fissativo. Lavare i pozzetti 2x con 1 ml di PBS. </li></ol></li><li> Colorazione anticorpo secondario. <ol><li> Controlli permeabilizzazione colorare per 1 ora a RT con appropriati anticorpi secondari accoppiati a fluorofori in PBS integrato con 0,1% saponina e 3% BSA a cellule completamente permeabilize. </li><li> Lavare coprioggetto 3x con 1 ml di PBS e montare le lamelle per analisi a mezzo di montaggio con DAPI (1,5 mg / ml). </li></ol></li><li> Analisi Microscopia. <ol><li> Analizzare i coprioggetti con i controlli a 63X di ingrandimento 40X o utilizzando un fluo confocaleMicroscopio rescence. Se la permeabilizzazione ha funzionato, non ci dovrebbe essere alcuna colorazione per le cellule non-permeabilizzate, calnexina colorazione per entrambe le celle digitonin- e saponina-permeabilizzate e PDI colorazione solo per le celle saponina permeabilizzate (Figura 4). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Digitonin Assay con Unlabeled Salmonella (Analisi basata Microscopia-) <ol><li> Preparazione batteri per O / N culture. <ol><li> Seminare senza etichetta Salmonella wild-type SL1344 (streptomicina resistente) 1 giorno prima della infezione in 3 ml di terreno LB addizionato con streptomicina (90 mg / ml) in un agitatore a 37 ° CO / N. </li><li> Placcatura cellule per l&#39;infezione. <ol><li> BMDMs seme in un piatto ben 24 contenente vetrini sterili ad una densità di 1,25 x 10 5 cellule / pozzetto in 1 ml di terreno macrofagi (DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino (FCS, de-integrato, 56 ° C,30 min), 1% HEPES, 1% acidi L-non-essenziale amino (NEAA), 1% L-glutammina e il 10% L929 surnatante). Pozzi seme secondo la tabella 1 per tenere conto di condizioni individuali. </li><li> Incubare le cellule O / N in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol></li><li> Preparare i batteri per l&#39;infezione. <ol><li> Il giorno dopo, a determinare la concentrazione di Salmonella nella / cultura O N diluendo la cultura 1:10 in PBS e misurando l&#39;OD 600 nei confronti di un solo controllo PBS. Questo assicura che la OD 600 è misurato nel range lineare dello spettrofotometro. </li><li> Determinare la concentrazione di Salmonella per millilitro. Un OD 600 di 1 corrisponde a 1 x 10 9 batteri. </li><li> Diluire i batteri in media macrofagi per raggiungere una concentrazione di Salmonella 1,25 x 10 6 cellule / ml. </li></ol></li><li> L&#39;infezione di cellule con Salmonella. <ol&gt; <li> Rimuovere media da tutti i pozzetti. Aggiungere 1 ml di terreno macrofagi pianura di pozzetti di controllo non infetti (B1 - B3, C1 - C3). Aggiungere 1 ml di sospensione Salmonella nei pozzetti A1 - A5 per raggiungere una molteplicità di infezione (moi) di 10 batteri per cellula. </li><li> Centrifugare la piastra per 15 min a 300 xg a 37 ° C per sincronizzare l&#39;infezione. Trasferire la lastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol></li><li> Uccidere Salmonella extracellulare con Gentamicina. <ol><li> A 1 ora dopo l&#39;infezione, rimuovere la piastra da incubatore e aggiungere 0,1 ml di terreno macrofagi contenenti 1 mg / ml di gentamicina per uccidere i batteri extracellulari tutti i pozzetti. Trasferire la lastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol></li><li> Lavare le cellule. <ol><li> A 2 ore dopo l&#39;infezione, rimuovere la piastra da incubatore e lavare i pozzetti 3x con 1 ml di mezzo fresco macrofagi contenente 10 mg / ml Gentamycin evitarela crescita di tutte le rimanenti batteri extracellulari. Trasferire la lastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol></li><li> Preparazione tamponi freschi con detergenti e anticorpi. <ol><li> Poco prima del punto di tempo desiderato di analisi, preparare una soluzione madre fresco digitonina a 1 mg / ml in KHM Buffer (acetato di potassio 110 mM, HEPES 20 mM, MgCl 2 2 mM, pH 7,3). Filtrare il brodo e diluire in KHM tampone a una concentrazione di lavoro di 50 mg / ml di digitonina. </li><li> Inoltre, preparare una soluzione di 0,1% in saponina KHM Buffer, anti- Salmonella -FITC (CSA-1, 0,1 mg / ml), anti-calnexin a 1/100 o anti-PDI a 1/100 in KHM Buffer integrato con 3% di BSA (vedi tabella materiali per la concentrazione di anticorpi). </li></ol></li><li> Permeabilizzazione cellulare. <ol><li> Rimuovere la piastra da incubatore e lavare i pozzetti 3x con 0,5 ml di KHM Buffer (pre-riscaldato a 37 ° C). Rimuovere KHM Buffer e aggiungere 0,25 ml pianura KHM Bufferper pozzi A4 e B1 / C1, KHM Buffer con digitonina nei pozzetti A1 - A3 e B2 / C2 o KHM tampone con saponina di pozzi A5 e B3 / C3 (secondo la tabella 1). Incubare per esattamente 1 minuti a temperatura ambiente e immediatamente lavare tutti i pozzetti 3x con 0,5 ml di KHM Buffer (pre-riscaldato a 37 ° C). </li></ol></li><li> Colorazione anticorpo primario. <ol><li> Rimuovere il tampone KHM e aggiungere le soluzioni di anticorpo primario (capra anti- Salmonella CSA1-FITC, 250 microlitri / bene, 0.1 mg / ml) per i pozzetti (Figura 2, Tabella 1). Incubare la piastra per 15 minuti in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2. Lavare 3x con 1 ml di PBS. </li></ol></li><li> Fissazione. <ol><li> Rimuovere PBS e aggiungere 250 ml di PFA 4% in PBS. Incubare per 10 minuti a 37 ° C. </li><li> Lavare i pozzetti 2x con 1 ml di PBS e aggiungere 250 ml di 0,1 M glicina in PBS per 10 minuti per placare il fissativo. Lavare i pozzetti 2x con 1 ml di PBS. </li></ol></li><li> TotaleSalmonella colorazione dei campioni infetti. <ol><li> Lavare 3x coprioggetto con PBS con 0,1% saponina / 3% BSA e incubare i campioni con un anticorpo anti-CSA1 (capra anti-CSA1, 0,1 mg / ml, topo anti-LPS funziona pure, 0,1 mg / ml) per 1 ora a RT in PBS con 0,1% saponina / 3% BSA. </li><li> Lavare 3x in PBS con 0,1% saponina / 3% BSA. Incubare i campioni con un anticorpo anti-capra secondario accoppiato al fluoroforo di scelta in PBS con 0,1% saponina / 3% BSA per 30 minuti a RT al buio. </li><li> Lavare coprioggetto 3x con 1 ml di PBS e montare le lamelle per analisi a mezzo di montaggio con DAPI (1,5 mg / ml). </li></ol></li><li> Analisi Microscopia. <ol><li> Acquisire dati con un microscopio confocale contando Salmonella citosolica (anti-Salmonella -FITC positivo) e totale Salmonella (doppia positivo) (Figura 5). Controlli permeabilizzazione dovrebbe mostrare: nessuna colorazione per le cellule non-permeabilizzate, calnexina scontenente per le cellule permeabilizzate con digitonina e PDI colorazione per le celle saponina permeabilizzate (Figura 4). Wells A4 e A5 serviranno controlli interni per la colorazione Salmonella. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Kumar, Y., Valdivia, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leading+a+sheltered+life%3A+intracellular+pathogens+and+maintenance+of+vacuolar+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments.</a> Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).</li>
<li>Chong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+phagosomal+stage+of+Francisella+tularensis+determines+optimal+phagosomal+escape+and+Francisella+pathogenicity+island+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression.</a> Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).</li>
<li>Mellouk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+subverts+the+host+recycling+compartment+to+rupture+its+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole.</a> Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).</li>
<li>Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-mediated+reentry+of+Francisella+tularensis+into+the+endocytic+compartment+after+cytoplasmic+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).</li>
<li>Broz, P., Monack, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+described+pattern+recognition+receptors+team+up+against+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens.</a> Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).</li>
<li>Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+LPS+activates+caspase-11%3A+implications+in+TLR4-independent+endotoxic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock.</a> Science. 341, 1250-1253 (2013).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+of+intracellular+Shigella+from+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Escape of intracellular Shigella from autophagy.</a> Science. 307, 727-731 (2005).</li>
<li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonellae+interplay+with+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li>
<li>Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+controls+Salmonella+infection+in+response+to+damage+to+the+Salmonella-containing+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole.</a> J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).</li>
<li>Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bimodal+lifestyle+of+intracellular+Salmonella+in+epithelial+cells%3A+replication+in+the+cytosol+obscures+defects+in+vacuolar+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication.</a> PLoS One. 7, e38732(2012).</li>
<li>Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+Toxoplasma+gondii+parasitophorous+vacuole+by+IFNgamma-inducible+immunity-related+GTPases+%28IRG+proteins%29+triggers+necrotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death.</a> PLoS Pathog. 5, e1000288(2009).</li>
<li>Meunier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-11+activation+requires+lysis+of+pathogen-containing+vacuoles+by+IFN-induced+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases.</a> Nature. 509, 366-370 (2014).</li>
<li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+interferon-gamma-inducible+p65+GTPases+plays+a+critical+role+in+host+defense+against+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii.</a> Immunity. 37, 302-313 (2012).</li>
<li>Degrandi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+guanylate+binding+protein+2+%28mGBP2%29+controls+Toxoplasma+gondii+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).</li>
<li>Mariathasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+of+the+inflammasome+by+caspase-1+adaptors+ASC+and+Ipaf%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf.</a> Nature. 430, 213-218 (2004).</li>
<li>Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+cytosolic+Salmonella+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells.</a> PLoS One. 9, e84681(2014).</li>
<li>Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+flow+cytometry+to+determine+differential+redistribution+of+cytochrome+c+and+Smac%2FDIABLO+from+mitochondria+during+cell+death+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling.</a> PLoS One. 7, e42298(2012).</li>
<li>Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+orientation+of+the+human+papillomavirus+type+16+E5+oncoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein.</a> J Virol. 84, 1696-1703 (2010).</li>
<li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+measurements+of+vacuolar+rupture+caused+by+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens.</a> J Vis Exp. , e50116(2013).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Permeabilizzazione differenziale è un metodo facile e robusto per analizzare e quantificare la distribuzione subcellulare di batteri patogeni tra compartimenti vacuolari e citoplasma. Lo stesso test è stato utilizzato con successo con batteri come Francisella novicida 2,4 e Shigella flexneri 12. Tuttavia, dal momento che molti patogeni intracellulari alterare o modificare le strutture endomembrane ospitanti, la robustezza della permeabilizzazione digitonina dovrà essere determinat...

Batteri patogeni intracellulari replicano direttamente nel citoplasma della cellula ospite, o in scomparti vacuolari specializzati 1. Durante la fase iniziale dell&#39;infezione maggior patogeni vengono internalizzati mediante fagocitosi da cellule specializzate (come macrofagi) o promuovendo attivamente il proprio assorbimento nelle cellule non fagocitiche. Nelle cellule fagocitiche, phagosome normalmente fonde con lisosomi per formare un vano degradativa, dove vengono digeriti particelle fagocitati. Batteri citosolici specializzati, come ad esempio Francisella novicida o Shigella flexneri, fuga degrado phagosomal inducendo la rottura del phagosome e successivamente fuga nel 2,3 citoplasma. Ciò richiede meccanismo di virulenza associata come la Francisella patogenicità Island (FPI) o la Shigella flexneri T3SS, che inietta le proteine ​​effettrici che promuovono vacuolar rottura 2-4. Le caratteristiche citosol della cellula ospiteun numero di recettori pattern recognition conservati che normalmente riconoscono la presenza di agenti patogeni e inducono immunitaria innata segnalazione 5. Inoltre, xenophagy, una forma antimicrobica dell&#39;autofagia può degradare batteri che entrano nel citosol. Batteri citosoliche sono normalmente ben adattati per smussare o aggirare queste risposte utilizzando diverse strategie. Ad esempio, Francisella modifica le sue LPS per non farsi riconoscere host e Shigella impedisce l&#39;autofagia reclutamento utilizzando secrete proteine ​​effettrici 6,7. Un&#39;altra strategia per sfuggire degradazione lisosomiale è impiegato dal modello vacuolare patogeno Salmonella enterica sierotipo Typhimurium, di seguito la Salmonella typhimurium. Salmonella utilizza un T3SS per iniettare effettori che rimodellano phagosome iniziale in sua nicchia intracellulare, la Salmonella -contenenti vacuolo (SCV) 8,9. Manipolazione continua di percorsi di accoglienza ènecessaria per mantenere questo vacuolo attraverso l&#39;assunzione di lipidi e altre sostanze nutritive per il vacuolo. In effetti, un mutante Sifa di Salmonella non riesce a mantenere la stabilità vacuolar, ed entra nel citoplasma delle cellule ospiti poche ore dopo l&#39;infezione, che si traduce nell&#39;attivazione di percorsi immunitario innato e l&#39;autofagia reclutamento 8. Fuga vacuolare di Salmonella varia a seconda del tipo di cellula che gli studi e numerose relazioni hanno dimostrato che nelle cellule epiteliali anche WT Salmonella può sfuggire la SCV e hyperreplicate nel citosol 10. Recenti rapporti indicano che la diagnosi immunitario innato di patogeni vacuolari dipende anche dalla capacità di accoglienza di riconoscere e destabilizzare vacuoli da organismi patogeni che contiene (PCV) 11-14. Dato che sia l&#39;host o batteri genotipo possono influenzare la distribuzione dei batteri intracellulari tra vacuolare e compartimento citosolico, è necessario quantificare il numero di vacuolare vs.batteri citosolici. Poiché, in configurazioni più sperimentali cellule ospiti sono infettate con più di un batterio, e successivamente può ospitare diversi batteri in differenti compartimenti subcellulari, è necessaria una tecnica che consente la quantificazione del livello di singoli batteri. Permeabilizzazione differenziale (noto anche come test di protezione phagosomal) fornisce la presente risoluzione 2,4,10,12. Il saggio si basa sulla permeabilizzazione selettiva della membrana plasmatica della cellula ospite con la digitonina detersivo, che lascia membrane vacuolare intatta e consente così la colorazione selettiva di batteri citosolici con anticorpi. Qui forniamo due protocolli per la quantificazione dei citosolica e vacuolare Salmonella typhimurium con permeabilizzazione differenziale. Il principio di questo metodo è descritto nella Figura 1: di midollo osseo macrofagi derivati ​​(BMDMs) sono infettati con fase stazionaria mCherry esprimono Salmonella. Fase stazionaria Salmonella bisogno to essere utilizzato in quanto downregulate l&#39;espressione della SPI-1 T3SS, la cui attività sarebbe altrimenti essere riconosciuto dal inflammasome NLRC4 e indurre la morte delle cellule rapido (pyroptosis) del BMDMs 15. Dopo l&#39;infezione le cellule sono lavate e trattati con 50 ug / ml di digitonina per 1 minuto. Le cellule vengono nuovamente lavati immediatamente e incubate con anticorpi anti-Salmonella accoppiati a FITC marcare batteri con accesso al citosol. Dopo un ulteriore lavaggio cellule passo vengono lisate e la percentuale di batteri mCherry + (vacuolare) e FITC + / + mCherry (citosolica) è determinata da FACS. Riportiamo anche un adattamento di questo metodo che può essere utilizzato se non ceppi proteine ​​esprimono fluorescenti sono disponibili (Figura 2). I passaggi aggiuntivi vengono introdotte dopo l&#39;etichettatura FITC in cui le cellule sono fissi e completamente permeabilizzate. Successivamente tutti i batteri sono macchiati con anticorpi anti-Salmonella e anticorpi secondari corrispondenti. Detezione viene poi eseguita al microscopio invece di analisi FACS.

<table><tbody><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D5628</td><td>50 &mu; g/ml</td></tr><tr><td></td><td>PFA mpbio</td><td>219998380</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di potassio</td><td>Sigma</td><td>791733</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>anti-Salmonella CSA-1-FITC</td><td>KPL</td><td>01-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>anti-Salmonella CSA-1</td><td>KPL</td><td>02-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>anti-Calnexin</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-860D</td><td>1/100</td></tr><tr><td>anti-PDI</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-890</td><td>1/100</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio Vectashield</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti Coniglio-488</td><td>Molecolare Sonde</td><td>A-11070</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15710-49</td><td>100 &mu; g/ml e 10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Amimed</td><td>5-13K00-H</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 Microscopio confocale Imaging</td><td>Zeiss</td><td></td><td>fatto a 63X</td></tr><tr><td>FACS Fortessa</td><td>BD tecnologie</td><td></td><td>rilevamento mCherry 610 nm</td></tr><tr><td>Tecnologie</td><td></td> <td>FACS Fortessa</td> BD <td>rilevamento FITC 530 nm</td></tr></tbody></table>

quantificazione dei citosolico vs. vacuolare<em&gt; salmonella</em&gt; in primarie macrofagi di permeabilization differenziale

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Batteri patogeni intracellulari possono replicarsi nel citosol o in vacuoli-patogeni contenenti specializzati (PCV). Per raggiungere il citosol, batteri come Shigella flexneri e Francisella novicida devono indurre la rottura del phagosome. Al contrario, Salmonella typhimurium replica in un vano vacuolare, conosciuto come Salmonella vacuole -contenenti (SCV). Tuttavia alcuni mutanti di Salmonella non riescono a mantenere l&#39;integrità SCV e sono quindi rilasciate nel citoplasma. La percentuale di citosolico contro batteri vacuolare a livello di singoli batteri può essere misurata permeabilizzazione differenziale, noto anche come test fagosoma protezione. L&#39;approccio fa uso della proprietà di detersivo digitonina di legarsi selettivamente colesterolo. Poiché la membrana plasmatica contiene più colesterolo che altre membrane cellulari, digitonina può essere utilizzato per permeabilize selettivamente la membrana plasmatica lasciando membrane intracellulariintatto. In breve, dopo l&#39;infezione con l&#39;agente patogeno che esprimono una proteina marcatore fluorescente (es mCherry tra gli altri), la membrana plasmatica delle cellule ospiti è permeabilizzate con una breve incubazione in digitonina contenente tampone. Le cellule vengono quindi lavate ed incubate con un anticorpo primario (accoppiato ad un fluoroforo di scelta) diretto contro il batterio di scelta (ad esempio anti-Salmonella -FITC) e nuovamente lavati. Se si utilizzano i batteri non marcati, un passaggio aggiuntivo può essere fatto, in cui tutte le membrane vengono permeabilizzate e tutti i batteri colorate con un anticorpo corrispondente. Dopo la colorazione, la percentuale di vacuolari e citosolici batteri può essere quantificata mediante FACS o microscopia contando eventi singoli o doppi-positive. Qui forniamo dettagli sperimentali per l&#39;uso di questa tecnica con il batterio Salmonella typhimurium. Il vantaggio di questo saggio è che, a differenza di altre analisi, fornisce una quantificazione del livello di singola bacteria, e se analizzata al microscopio fornisce il numero esatto di citosolico e batteri vacuolari in una data cellula.

Figura 1 e Figura 2 mostra gli schemi del test digitonina descritti nel protocollo 1 e 2 del protocollo che illustrano le fasi critiche del protocollo e dei risultati ottenuti. La figura 3 mostra tipici FACS risultati. I controlli positivi e negativi vengono utilizzati per impostare le porte per mCherry + / batteri FITC (vacuolar Salmonella) e mCherry + / FITC + batteri (citosolico Salmonella). Sulla base di queste porte la percentuale di batteri citosolici e vacuolari può...

Descriviamo la quantificazione di Salmonella typhimurium citosolica e vacuolare nei macrofagi derivati dal midollo osseo utilizzando la permeabilizzazione differenziale della digitonina.

Quantificazione dei citosolico vs. vacuolare<em&gt; Salmonella</em&gt; In primarie macrofagi di Permeabilization differenziale

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare la percentuale di *Salmonella* citosolica e vacuolare in macrofagi derivati dal midollo osseo infettati. Questo viene ottenuto infettando i macrofagi con *Salmonella Typhimurium* esprimente M-cherry. Come secondo passaggio, le cellule vengono trattate con il detergente digitonina, che permeabilizza la membrana plasmatica ma non le membrane vacuolari.Successivamente, le cellule vengono colorate con un anticorpo anti Salmonella accoppiato al fluorocromo Zi. Per etichettare Salmonella typhimurium citosolica, i risultati mostrano la percentuale di batteri citosolici rispetto al numero totale di batteri, basata sul sorting cellulare attivato da fluorescenza o FACS. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle interazioni con i patogeni, ad esempio se un patogeno intracellulare si replica in una vacuolo o nel citosol. Inoculare il ceppo batterico un giorno prima dell'infezione in tre millilitri di brodo Luria-Bertani, integrato con streptomicina e ampicillina, in agitazione a 37 gradi Celsius per tutta la notte, tenendo conto delle condizioni specifiche. Aggiungere coprioggetti nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti che verranno utilizzati come controlli per la semina delle cellule; seminare macrofagi derivati dal midollo osseo di tipo selvaggio, o BMdM, a una densità di 0,125 milioni di cellule per pozzetto in un millilitro di mezzo per macrofagi primari, quindi incubare le cellule per tutta la notte in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Il giorno successivo. Determinare la concentrazione di salmonella nella coltura ottenuta per crescita notturna misurando la densità ottica a 600 nanometri o OD 600 della coltura diluita rispetto al soluzione salina tamponata al fosfato. Questo garantisce che l'OD 600 venga misurato nell'intervallo lineare dello spettrofotometro.Calcolare la concentrazione di salmonella per millilitro e che un OD a 600 corrisponde a un miliardo di batteri. Diluire i batteri nel mezzo per macrofagi per raggiungere una concentrazione di salmonella di 1,25 milioni di cellule per millilitro al fine di infettare le cellule con salmonella. Rimuovere il mezzo dai B MDMs.Aggiungere un millilitro di mezzo per macrofagi nei pozzetti di controllo non infetti, da B1 a B3 e da C1 a C3. Quindi aggiungere un millilitro di sospensione di Salmonella nei pozzetti da A1 a A5 per raggiungere una molteplicità di infezione di 10 batteri per cellula. Centrifugare la piastra per 15 minuti a 300 × g e a 37 °C per sincronizzare l'infezione, prima di trasferire la piastra in incubazione a 37 °C e 5% CO₂ all'ora post-infezione. Rimuovere la piastra dall'incubatore per aggiungere 0,1 millilitro di mezzo per macrofagi contenente gentamicina al fine di eliminare i batteri extracellulari.Aggiungere la gentamicina in tutti i pozzetti, inclusi i controlli non infetti, per garantire che tutte le cellule siano trattate allo stesso modo. Successivamente, trasferire la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica due ore dopo l'infezione. Rimuovere la piastra dall'incubatore e lavare tutti i pozzetti due volte con un millilitro di mezzo di Eagle modificato (DMEM) preriscaldato.Sostituire il DMEM con il mezzo per macrofagi preriscaldato contenente gentamicina per prevenire la crescita di eventuali batteri extracellulari residui, prima di reinserire la piastra nell'incubatore appena prima del tempo desiderato di analisi. Preparare soluzioni fresche di buffer KHM, buffer KHM con digitonina e buffer KHM con saponina. Oltre alle soluzioni di anticorpi descritte nel protocollo testuale per eseguire la permeabilizzazione cellulare, rimuovere la piastra dall'incubatore e lavare le pozzette tre volte con 0,5 millilitri di buffer KHM preriscaldato.Quindi rimuovere il buffer KHM e aggiungere 0,25 millilitri di buffer KHM semplice nelle pozzette A4, B1 e C1, buffer KHM con digitone nelle pozzette da A1 ad A3, B2 e C2, e buffer KHM con saponina nelle pozzette A5, B3 e C3. Incubare esattamente per un minuto a temperatura ambiente prima di lavare immediatamente tutte le pozzette tre volte con 0,5 millilitri di buffer KHM PRE-RISCALDATO. Infine, rimuovere il buffer KHM e aggiungere le soluzioni di anticorpo primario nelle rispettive pozzette, quindi incubare la piastra per 15 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule una volta con un millilitro di PBS per le cellule infette nelle pozzette da A1 ad A5.Prepararsi per l'analisi in fax lavando le cellule tre volte con PBS. Successivamente, aggiungere 0,5 millilitri di PBS freddo contenente lo 0,1% di Triton. Poi, trasferire la sospensione cellulare in una provetta fax da cinque millilitri con cappuccio filtrante per rompere gli aggregati cellulari, mantenendo i campioni sul ghiaccio.Analizzare i campioni su un fax mediante l'uso di controlli completamente permeabili. Impostare la finestra per i batteri totali in base allo scatter anteriore e laterale e al segnale mCherry. Successivamente, analizzare il segnale fitz nella popolazione batterica totale utilizzando i controlli permeabili e non permeabili per definire le finestre di selezione per i batteri citosolici e i batteri vacuolari con la finestra già impostata.Analizzare i campioni e determinare la percentuale di batteri citosolici rispetto a quelli vacuolari utilizzando il software FlowJo. Secondo il protocollo del produttore per i controlli di permeabilizzazione non infetti nelle pozzette da B1 a B3 e da C1 a C3, preparare per la microscopia rimuovendo il PBS e aggiungendo 250 microlitri di paraformaldeide al 4% in PBS, incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius al termine dell'incubazione. Lavare le pozzette due volte con un millilitro di PBS e aggiungere 250 microlitri di glicina 0,1 M in PBS per 10 minuti per neutralizzare il fissativo, quindi lavare nuovamente le pozzette due volte con un millilitro di PBS per eseguire la colorazione con anticorpo secondario.Incubare i controlli di permeazione per un'ora a temperatura ambiente con gli opportuni anticorpi secondari coniugati a fluorocromi in PBS, integrato con saponina 0,1% e BSA 3%. Per permeabilizzare completamente le cellule, lavare le lamelle tre volte con un millilitro di PBS e montarle per l'analisi in un mezzo di montaggio con DAPI.Analizzare le lamelle con i controlli a un'ingrandimento di 40 x o 63 x utilizzando un microscopio a fluorescenza confocale. Qui vengono mostrati risultati tipici. I risultati dei controlli positivi e negativi vengono utilizzati per impostare le soglie per i batteri positivi per m cherry, positivi per FITS, che sono salmonella citosolica, e per i batteri positivi per m cherry e negativi per FITS, che sono salmonella valar.In base a questi parametri, viene determinata la percentuale di batteri citosolici e vacuolari nei campioni sperimentali. In questo esempio, il ceppo selvatico di Salmonella typhimurium positivo per mCherry viene confrontato con un mutante di delezione CA in macrofagi derivati da midollo osseo. Qui sono mostrate la colorazione per calnexina e PD-1 ottenuta in controlli di permeabilizzazione trattati con digitonina o saponina. Poiché la calnexina è una proteina di membrana del reticolo endoplasmatico, la sua colorazione è visibile in tutto il citoplasma e intorno al nucleo sia nelle cellule permeabilizzate con digitonina che in quelle con saponina. Nei controlli permeabilizzati con digitonina, non è visibile alcuna colorazione per PD-1.Sebbene la colorazione possa essere osservata nelle cellule sasin e perme, qui viene mostrato un risultato di colorazione anti salmonella in cellule permeabilizzate con tonin. I batteri totali sono in rosso, mentre i batteri citosolici sono in verde.La popolazione E positiva comprende salmonella con accesso al citosol. Mentre la popolazione fite negativa è costituita da batteri che risiedono all'interno di una vacuolo contenente salmonella integro, o SCV, e che sono quindi protetti dall'etichettatura mediante FSE di salmonella. In questo caso, salmonella di tipo selvatico viene confrontata con un ceppo mutante privo di CFE. Poiché CA è necessaria per salmonella al fine di mantenere l'integrità dello SCV, si osserva una percentuale maggiore di salmonella. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come determinare la percentuale di batteri vascolari e citosolici.

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