Name: A base di seta-collagene Engineered Modello 3D del tessuto neurale polarizzata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Scopri come creare modelli 3D di tessuto neurale usando scaffold di seta e collageno con neuroni corticali di ratto. Questa tecnica consente di studiare reti neurali e malattie neurodegenerative.

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Ringraziamo il laboratorio del Dr. Stephen Moss per aver fornito tessuti embrionali di cervello di ratto. M.D.T. ha progettato il protocollo originale. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health P41 Tissue Engineering Resource Center Grant EB002520. K.C. è stato sostenuto con una borsa di studio post-dottorato dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) (CH 1400/2-1).

Il protocollo di isolamento tessuto cerebrale è stato approvato dal Istituzionale Cura e Comitato uso degli animali Tufts University ed è conforme con il National Institutes of Health Guide per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (Institutional Animal Care and Use Committee B2011-45). 1. Silk Scaffold Preparazione <ol><li> Preparazione della soluzione da seta Bombyx mori bozzoli, come descritto in precedenza 19,20. <ol><li> Tagliare ogni bozzolo in 8 pezzi uguali con le forbici. Usare circa 11 bozzoli per 5 g di bozzoli frammentati. (15 min) </li><li> Preparare 2 L di 0,02 M Na 2 CO 3 soluzione e portarla a bollore con un piatto caldo. (15 min) </li><li> Pesare 5 g di bozzoli frammentate e lessateli in Na 2 CO 3 soluzione per 30 minuti. Mescolare la seta bollente ogni paio di minuti con una spatola. Questa fase, detta anche de-gommatura, purifica fibroina di seta da proteine ​​idrofili, sericins. (30 min) </li><li&gt; Strizzare fibroina a mano e sciacquarlo con acqua distillata almeno tre volte per lavare qualsiasi sericina e prodotti chimici rimanente. (5 minuti) </li><li> Posizionare la fibroina bagnato su una capsula di Petri e asciugare l&#39;estratto fibroina nella cappa a flusso O / N. </li><li> Il giorno dopo pesare la massa fibroina secca e posizionare il fibroina in un bicchiere di vetro. (15 min) </li><li> Per sciogliere la fibroina in soluzione 9,3 M LiBr, calcolare il volume necessario (ml) di LiBr moltiplicando la massa della fibroina secca per 4. Versare lentamente soluzione LiBr sul fibroina di seta e immergere tutte le fibre di fibroina utilizzando una spatola. Coprire il becher per evitare l&#39;evaporazione e posizionarlo a 60 ° C per 4 ore per consentire alle fibre di sciogliere. (15 min) </li><li> Usando la siringa, raccogliere la soluzione fibroina dal bicchiere e caricarlo nei MWCO 3.500 cassette di dialisi. Eseguire la dialisi contro acqua distillata per 48 ore. Cambiare l&#39;acqua ogni due ore. </li><li> Utilizzando la siringa, raccogliere la soluzione da fibroinale cassette in 50 ml provette coniche e centrifughi due volte a 9.000 giri (~ 12,700 xg) a 4 ° C per 20 min. Versare il surnatante in una nuova provetta dopo ogni fase di centrifugazione e scartare il pellet. (40 min) </li><li> Misurare la concentrazione della fibroina stimando il peso secco. Versare 1 ml di soluzione di seta in una barca pesare. Essiccare il campione in stufa a 60 ° C per 2 ore. Pesare il fibroina di seta secca e calcolare la concentrazione della soluzione di fibroina di seta moltiplicando il peso ottenuto per 100. La concentrazione previsto di soluzione seta è 6-9% (w / v). </li><li> Regolare la concentrazione di seta al 6% (w / v) diluendo in acqua distillata. Fermata: La fibroina seta liquida può essere conservato a 4 ° C fino ad un mese in un contenitore chiuso. </li></ol></li><li> Preparazione di scaffold porosi di soluzione di seta. <ol><li> Setacciare la granulari NaCl per separare i granuli di dimensioni 500-600 micron, che verrà utilizzato nei passaggi successivi. Eliminare il granulos dimensioni di sotto di 500 micron e sopra 600 micron. (15 min) </li><li> Versare 30 ml di soluzione di seta 6% nello stampo politetrafluoroetilene (PTFE) (Figura 1). Spargere delicatamente 60 g di NaCl setacciata sulla seta. Premere il contenitore per ottenere uno strato uniforme di sale. Incubare 48 ore a RT per polimerizzare la seta. </li><li> Collocare lo stampo PTFE contenente scaffold in forno a 60 ° C per 1 ora per completare la polimerizzazione e far evaporare il liquido in eccesso. </li><li> Posizionare il contenuto dello stampo PTFE in un bicchiere contenente 2 L di acqua distillata per 48 ore a percolare il sale. Cambiare l&#39;acqua 2-3 volte al giorno. Rimuovere le impalcature spugna dagli stampi quando il sale è completamente colato fuori del punto finale:. Le spugne possono essere conservati immersi in acqua a 4 ° C in un contenitore chiuso per impedire scaffold disidratazione. </li><li> Quando si è pronti, tagliare i ponteggi con diametro 5 mm biopsia. Pre-tagliare le impalcature per raggiungere circa 2 mm di altezza. PuNCH ​​il centro del ponteggio con il punzone di diametro biopsia 2 mm (Figura 2A). (1 ora) </li><li> Autoclavare i ponteggi immersi in acqua per sterilizzarli (ciclo bagnato, 121 ° C, 20 min) del punto finale:. Le spugne possono essere conservati immersi in acqua a 4 ° C in un contenitore chiuso per impedire scaffold disidratazione. </li><li> Prima della semina cellulare programmata, immergere i ponteggi in soluzione sterile 0,1 mg / ml di poli-D-lisina (PDL). Incubare per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Lavare i ponteggi 3x con tampone fosfato salino (PBS) per rimuovere PDL non vincolati. (30 min) </li></ol></li></ol> 2. Isolamento di ratto neuroni corticali <ol><li> Sezionare cortecce da giorno embrionale 18 ratti (E18) Sprague-Dawley come precedentemente descritto da Pacifici e Peruzzi 27 dopo l&#39;ottenimento del protocollo animale approvato. (2 ore) </li><li> Incubare 10 cortecce in 5 ml di 0,25% tripsina con 0.3% DNasi I (da pancreas bovino) per 20 min a 37 ° C. </li><li> Inattivare i tripsina aggiungendo uguale volume di 1 mg / ml di proteine ​​di soia. </li><li> Triturare le cortecce con 10 ml pipetta Pasteur pipettando su e giù per 20 volte fino a quando viene generato una sospensione singola cellula. Sii gentile e evitare la formazione di bolle d&#39;aria. (10 min) </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 127 xg per 5 min. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di terreno di coltura (Neurobasal medio, 1x B27 supplemento, 1x Glutamax, 1% di penicillina / streptomicina). Contare le cellule. La concentrazione cellulare è di circa 2x10 previsto 7 / ml. (20 min) </li></ol> 3. Costruire Montaggio e Cultura <ol><li> Ponteggio semina con le cellule. <ol><li> Spostare i ponteggi sterili e tutti gli utensili necessari all&#39;interno di una cappa di coltura cellulare. Con pinza sterile posto i ponteggi in un piatto di coltura cellulare a 96 pozzetti attribuzione di un ponteggio per pozzetto. (10 min) </li><li> Immergere i ponteggi in terreno di coltura cellulare per equilibrare loro prima di logge dei semiing. Incubare per 1 ora a 37 ° C. (10 min) </li><li> Aspirare l&#39;eccesso del mezzo dalle impalcature. </li><li> Applicare 100 ml di sospensione cellulare / patibolo. (10 min) </li><li> Incubare le cellule a 37 ° CO / N per permettere l&#39;adesione delle cellule al ponteggio. </li><li> La mattina seguente aspirare le cellule non iscritti e applicare 200 pl / pozzetto di terreno di coltura fresco. (10 min) </li></ol></li><li> Impalcatura embedding con matrice di collagene. (2 ore) <ol><li> Mettere 10x PBS, acqua, 1 N NaOH e coda di topo collagene sul ghiaccio. Preparare una soluzione di lavoro di collagene secondo le istruzioni del produttore. Mantenere in ghiaccio fino alle costruzioni cellulari-seeded sono pronti (fino a 1 ora). </li><li> Rimuovere i costrutti di seta cellulari testa di serie dal termostato e aspirare l&#39;eccesso di mezzo. </li><li> Con pinza sterile trasferire i ponteggi nei pozzetti vuoti sulla piastra pozzo e immergono ogni impalcatura in 100 ml di 3 mg / ml soluzione di collagene. Posizionare la piastra di coltura tissutale indietroin incubatrice per 30 min per permettere la polimerizzazione del collagene. </li><li> Applicare 100 ml di pre-riscaldato terreno di coltura cellulare / bene. Cultura i costrutti per uno settimana cambiando il mezzo ogni giorno sostituendo solo la metà del volume del mezzo. </li></ol></li></ol> 4. Microscopia Analisi <ol><li> Vivo colorazione / morti (1 ora) <ol><li> Preparare soluzione stock di ioduro di propidio (PI) 1 mg / ml (1,5 mm) in acqua distillata. </li><li> Preparare soluzione stock di diacetato fluoresceina (FDA) 2 mg / ml in acetone. </li><li> Preparare la soluzione di lavoro contenente 10 micron e 0,15 micron PI FDA diluito in PBS. Pre-riscaldare la soluzione a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Lavare le cellule con PBS preriscaldata a rimuovere le esterasi siero. Aspirare il PBS. </li><li> Applicare la soluzione preriscaldata lavorando sulle cellule per 2 minuti e lavare con PBS. </li><li> Utilizzare microscopio epifluorescente all&#39;immagine delle cellule (PI ex λ = 490 nm, em λ = 570 nm; FDA ex λ = 490 nm, em λ = 514 nm). La macchia rimane stabile nel 40 min. Colorazione prolungata può causare macchie aspecifica risultante da PI captazione da parte delle cellule e co-localizzazione di PI / FDA in cellule. </li></ol></li><li> Immunostaining <ol><li> Al punto di tempo desiderato della cultura fissare le cellule con 4% paraformaldeide (PFA) per 30 minuti a RT. A causa della tossicità dei fumi PFA la fase di fissaggio deve essere eseguito nella cappa. </li><li> Lavare 3x ponteggi con PBS Fermata:. I costrutti PFA-fisse possono essere memorizzati in PBS a 4 ° C per diversi giorni prima di procedere con ulteriori passi. </li><li> Incubare i ponteggi a 0,2% Triton, 0,25% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS contenenti anticorpo primario O / N a 4 ° C. </li><li> Il giorno seguente scartare la soluzione colorante e lavare i ponteggi 3 x 30 minuti con PBS per rimuovere l&#39;anticorpo primario non legato. </li><li> Incubare i campioni con anticorpo secondario diluito in 0,2% Triton, 0,25% BSA in PBS per 2ora a RT. </li><li> Rimuovere la soluzione colorante e lavare i ponteggi 3 x 30 minuti con PBS per rimuovere l&#39;anticorpo secondario non legato. </li><li> Immagine i ponteggi utilizzando un microscopio confocale con obiettivo 20X prendendo 100 micron z-sezioni del campione con 1 micron passo. Per visualizzare le neuriti sottili la risoluzione dell&#39;immagine dovrebbe essere di almeno 1.024 x 1.024 pixel. </li></ol></li><li> RNA, DNA e isolamento delle proteine Nota: RNA, DNA e l&#39;isolamento delle proteine ​​viene eseguita utilizzando un commerciale DNA AllPrep / RNA / proteine ​​Mini Kit secondo le istruzioni del produttore. <ol><li> Con pinza sterile trasferire i ponteggi di piastra di coltura di una provetta sterile 2 ml. Mettere una impalcatura per provetta. </li><li> Aggiungere 200 ml di tampone RLT a ciascuna provetta. </li><li> Interrompere il costrutto frammentando con microscissors sterili. </li><li> Per omogeneizzare il tessuto perturbato, trasferire il contenuto del tubo alla colonna di spin. Spin per 2 minuti a tutta velocità in una microcentrifuga.Il lisato viene omogeneizzata che passa attraverso la colonna di spin. </li><li> Raccogliere il flusso attraverso ed utilizzare immediatamente per isolare l&#39;RNA, DNA e proteine ​​seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Quantificare la resa degli acidi nucleici qualsiasi altro metodo compatibile (ad esempio, NanoDrop). </li><li> Quantificare la resa proteica tramite BCA Protein Assay secondo le istruzioni del produttore. Misurare i risultati di test con lettore di micropiastre alla lunghezza d&#39;onda 562 nm. Nota: La resa prevista di acidi nucleici e proteine ​​per costrutto in relazione alla densità cellulare è mostrato in Figura 4. </li></ol></li></ol>

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Qui abbiamo descritto le linee guida per assemblare un modello di tessuto 3D simile al cervello compartimentato. Il modello è caratterizzato da una densa coltura polarizzata di neuroni con conseguente sviluppo di due compartimenti morfologicamente diversi: uno contenente corpi cellulari densamente impacchettati, il secondo contenente reti assonali pure. Nel complesso, l'architettura dell'impalcatura e il modello di crescita imitano il tessuto corticale cerebrale, compresi i sei strati laminari e i tratti di sostanza bianca21.
Il modello tissutale a forma di ciambella basato sulle proteine della seta consente di modificare e mettere a punto le proprietà meccaniche, le forme strutturali versatili, i riempitivi di idrogel e i componenti cellulari. Pertanto, questo modello tissutale stabilisce una piattaforma di base per un'ampia gamma di studi. La seta è un candidato favorevole per le piattaforme di biomateriali grazie alla sua biocompatibilità, alla lavorazione a base acquosa e alle robuste proprietà meccaniche e di degradazione22. La matrice di seta funge anche da ancoraggio stabile per ridurre la contrazione del gel di collagene nel tempo in coltura. Le proprietà come la concentrazione della seta e la porosità dell'impalcatura utilizzata in questo modello sono state precedentemente regolate per ottenere una crescita cellulare ottimale e proprietà meccaniche con conseguente elasticità del tessuto simile al cervello18,23,24. Si consiglia di mantenere costanti questi parametri per garantire il buon esito e la riproducibilità degli esperimenti.
La formazione della rete neuronale 3D è stata ottenuta combinando due tipi di biomateriali con diverse proprietà meccaniche: un'impalcatura rigida per fornire l'ancoraggio neuronale e una matrice di gel più morbida per consentire la penetrazione degli assoni e la connettività in 3D. Le preferenze selettive dei materiali dell'impalcatura di seta e dell'idrogel morbido forniscono il principio di base per la compartimentazione dei neuroni dalle connessioni assonali. A causa della natura inerte dell'impalcatura di seta, la funzionalizzazione con poli-D-lisina è necessaria per l'attacco neuronale. Tuttavia, possono essere applicati altri fattori che promuovono l'adesione cellulare come RGD25 o fibronectina26. Per ottenere la formazione della rete 3D, l'impalcatura di seta deve essere riempita di idrogel in modo tempestivo non appena i neuroni sono attaccati all'impalcatura. Allo stesso modo, il filler della matrice di collagene può essere sostituito da altri idrogel, consentendo così lo studio dell'influenza degli ambienti extracellulari 3D sulla formazione della rete assonale per fungere da piattaforma per valutare nuovi idrogel in termini di compatibilità neuronale. Inoltre, oltre ai neuroni corticali di ratto, possono essere utilizzate altre fonti neuronali come i neuroni dell'ippocampo o i neuroni derivati da cellule pluripotenti indotte (iPSc). Inoltre, il modello tissutale può essere utilizzato per studiare le interazioni eterocellulari includendo le cellule gliali insieme ai neuroni e per costruire tessuti più complessi simili al cervello.
Come mostrato in precedenza, il nostro modello può essere utilizzato per valutare la funzionalità neuronale nel microambiente 3D con una varietà di saggi come la vitalità cellulare, l'espressione genica, la LC-MS/MS e l'elettrofisiologia, dimostrando così la rilevanza fisiologica del modello18. Altri metodi, che vengono spesso utilizzati per valutare i costrutti di ingegneria tissutale 3D, come l'immunocolorazione e la microscopia8,9,11 possono essere utilizzati anche per valutare la distribuzione cellulare e l'entità della formazione della rete assonale. Tuttavia, va notato che, a causa dell'alta densità della matrice di collagene, la penetrazione degli anticorpi e la profondità dell'imaging sono limitate a poche centinaia di micrometri. Inoltre, il rapporto segnale/rumore può essere influenzato da una fluorescenza di fondo aspecifica. Questo problema può essere superato utilizzando traccianti cellulari lipofili e proteine fluorescenti geneticamente espresse che riducono la necessità di immunocolorazione11. In alternativa, l'imaging può essere eseguito con la microscopia a 2 fotoni invece della solita tecnica a un fotone, che può ridurre la perdita di segnale, il fotosbiancamento e può essere estesa a diverse centinaia di micrometri di profondità.
Riassumendo, il tessuto simile al cervello a base di seta e collagene offre una solida piattaforma per studiare le reti neuronali in 3D ed è un punto di partenza per lo sviluppo di modelli più avanzati di disturbi neurologici in futuro. Indipendentemente dalla modalità di valutazione, la relativa semplicità di questo modello tissutale ne supporta l'utilità, il successo e la riproducibilità.

Il sistema nervoso centrale (CNS) può essere influenzata da una varietà di disturbi che coinvolgono vascolare, strutturale, funzionale, infettiva o degenerativa. Si stima che 6,8 milioni di persone muoiono ogni anno a causa di disturbi neurologici, che rappresenta un crescente onere socioeconomico in tutto il mondo 1. Tuttavia, solo alcuni dei disturbi sono trattamenti disponibili. Pertanto, vi è una necessità critica per strategie terapeutiche innovative per i pazienti affetti da disturbi neurologici. Purtroppo, molte terapie CNS-mirate falliscono durante gli studi clinici, in parte a causa dell&#39;utilizzo di modelli inadeguati di ricerca pre-clinica, che non consentono la valutazione degli impatti acuti e cronici con fisiologicamente rilevanti letture funzionali. Nonostante i significativi sforzi di ricerca nel corso degli ultimi decenni, vi è una grande quantità sconosciuto circa la struttura e la funzione del sistema nervoso centrale. Al fine di acquisire maggiori conoscenze, i modelli animali sono spesso noied al modellare stati patologici, come i traumi cerebrali (TBI) o demenza, soprattutto in studi pre-clinici. Tuttavia, gli animali differiscono significativamente dagli esseri umani sia in anatomia del sistema nervoso centrale, nonché in funzione, l&#39;espressione genica e metabolismo 2-4. D&#39;altra parte, culture 2D in vitro sono il metodo comune per indagare la biologia cellulare e sono abitualmente utilizzati per la scoperta di farmaci. Tuttavia, le colture cellulari 2D mancano della complessità e rilevanza fisiologica rispetto al cervello umano 5-7. Mentre non vi è alcun sostituto per il basso costo e la semplicità di studi su colture cellulari in 2D o la complessità fornito da modelli animali, l&#39;ingegneria dei tessuti 3D potrebbe generare modelli di ricerca migliorati per colmare il divario che esiste tra il 2D in vitro e in vivo approcci. Ingegneria dei tessuti 3D fornisce più fisiologicamente rilevanti condizioni sperimentali ottenuti da interazioni cellula-cellula 3D e segnali extracellulari forniti dalle impalcature biomateriale. Despite le prove significative dietro il valore delle culture in 3D, ci sono attualmente solo pochi modelli di tessuto 3D del sistema nervoso centrale, come staminali derivati ​​dalle cellule culture organoide 8-10, neurospheroids 11 e dispersi culture idrogel 12,13. Modalità tecniche avanzate che includono multilayer litografia 14, e la stampa 3D 15 sono stati utilizzati per lo studio del polmone, del fegato e tessuto renale. Tuttavia, vi è la mancanza di modelli 3D SNC che permettono la crescita neuronale compartimentato, come mimando l&#39;architettura corticale e biologia. Separato crescita dei neuriti da corpi cellulari neuronali è stato precedentemente dimostrato nelle culture 2D utilizzando microfabbricazione 16,17 permettendo lo studio di tracciato del tratto assoni, flusso di calcio, l&#39;architettura di rete e attività. Questa idea ci ha ispirato a sviluppare un tessuto neurale polarizzata 3D in cui i corpi cellulari e tratti assonali sono situati in diversi comparti che mimano l&#39;architettura a strati del cervello 18 </sup&gt;. Il nostro approccio è basato sull&#39;uso di design unico scaffold seta alloggiante alta densità di cellule in un volume confinato e permette conseguenza di rete assonale fitta in un gel di collagene. Qui mostriamo l&#39;intera procedura di assemblaggio del tessuto cerebrale simile tra cui la fabbricazione patibolo e la cultura neuronale.

<table><tbody><tr><td>Na2CO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223530</td><td></td></tr><tr><td>LiBr</td> Cassette per dialisi <td>Sigma-Aldrich</td><td>213225</td><td></td></tr><tr><td>MWCO 3500&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>66110</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 R</td><td>Setaccio Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>n. 270, n. 35, n. 30</td></tr><tr>Stampo <td></td><td></td> in<td>PTFE</td><td>realizzato in casa (Figura 1) 10 cm di diametro, 2 cm di altezza</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia 5&#160; mm</td><td>World Precision Instrument</td><td>501909</td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia 2&#160; mm</td><td>World Precision Instrument</td><td>501908</td><td></td></tr><tr><td>poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>concentrazione finale 10&#160; &#956; g/ml, disciolto in acqua</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1283-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>10104159001 concentrazione</td><td>finale 0,3%</td></tr><tr><td>Proteina di soia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522-100MG</td><td>concentrazione finale 1&#160; mg/ml</td></tr><tr><td>Mezzo neurobasale</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>riscaldare fino a 37&#160; &deg; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Integratore di B27 50x</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Streptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Collagene I, coda di topo, 100&#160; mg</td><td>di Corning</td><td>354236</td><td>concentrazione finale 3&#160; mg/ml</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>corrosivo</td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170-10MG</td><td>tossico</td></tr><tr><td>Fluoresceina Diacetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Olympus MVX10</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>tossico, concentrazione finale 4%</td></tr><tr><td>Bovino Siero Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-10G</td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta; IIITubulina anticorpo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2200</td><td>coniglio 1:500</td></tr><tr><td>anti-coniglio Alexa-546</td><td>Sonde molecolari</td><td>A11010</td><td>capra 1:250</td></tr><tr><td>siero di capra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 microscopio confocale</td> obiettivo <td>Leica</td><td></td><td>20X</td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80004</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico, Puro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c/2000 Spettrofotometro UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saggio delle proteine BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre Spectramax M2</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>assorbanza 562 nm</td></tr><tr><td>Micro forbici, Economy, tipo Vannas</td><td>TedPella</td><td>1346</td><td></td></tr></tbody></table>

a base di seta-collagene engineered modello 3d del tessuto neurale polarizzata

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Nonostante gli enormi sforzi per decifrare l'anatomia, la composizione e la funzione del cervello, rimane l'organo meno compreso del corpo umano. Per ottenere una comprensione più profonda del sistema neurale, gli scienziati mirano a ricostruire semplicisticamente il tessuto assemblandolo in vitro a partire da elementi costitutivi di base utilizzando un approccio di ingegneria tissutale. Il nostro gruppo ha sviluppato un modello 3D simile al cervello basato su seta e collagene che assomiglia alla materia bianca e grigia della corteccia. Il modello è costituito da una spugna porosa di seta, che è pre-seminata con neuroni derivati dal cervello di ratto, immersi in una matrice di collagene morbido. La crescita neuronale polarizzata e la formazione di reti si osservano con localizzazione assonale e del corpo cellulare separate. Questa architettura compartimentale consente lo sviluppo unico di nicchie che imitano il tessuto neurale nativo, consentendo così la ricerca sull'assemblaggio della rete neuronale, la guida assonale, le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice e le funzioni elettriche.

Solid spugne seta pretagliato alla forma di ciambella rappresentano un&#39;idea unica e semplice da realizzare un&#39;architettura compartmentalized simile tessuto neurale (Figura 2A). La struttura altamente porosa del ponteggio con la dimensione dei pori di circa 500 micron risultati in eccezionalmente elevata area superficiale permettono la semina e la crescita di alta densità cellulare in un piccolo volume (2x10 7 / ml) (Figura 2B). Inoltre, l&#39;elevata porosità del patibolo permette per la diffusione illimitata di sostanze nutritive e di rifiuti con conseguente redditività superiore di colture cellulari dense un lasso di tempo prolungato. Dopo la semina i neuroni rapidamente ed uniformemente fissarle con la superficie dei pori ponteggio. Dopo l&#39;adesione cellulare è completa e le cellule sono in equilibrio sul substrato di seta, l&#39;impalcatura spugna è riempito con la matrice di collagene morbido per fornire un ambiente 3D per la formazione della rete assonale (Figura 3 </strong&gt;). In assenza della matrice di collagene la compartimentazione di assoni e corpi cellulari non è possibile in quanto i neuroni crescono estensioni solo sulla superficie dei pori con conseguente reti miste come trovata con superfici 2D (Figura 3B). Al contrario, il gel di collagene fornisce un reticolo che supporta una vasta crescita degli assoni in 3D, mentre i corpi cellulari neuronali rimangono attaccate al ponteggio seta (Figura 3C). Questo modello di crescita porta a compartimentazione dei corpi cellulari e reti assonale puri (Figura 3D), che ricorda la materia grigia e bianca della corteccia del cervello. Oltre microscopia, i costrutti possono essere valutati con una varietà di altri metodi 18, a seconda della domanda dietro l&#39;esperimento. Ad esempio, l&#39;isolamento di DNA, RNA e di proteine ​​dei costrutti può essere facilmente realizzato utilizzando kit commerciali (Figura 4). La resa degli acidi nucleici e proteine ​​per costrutto dipende dal numero di cellule inizialmente seminate su scaffold seta. Più cellule seminate maggiore la resa di DNA, RNA e proteine. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig1.jpg" /> Figura 1. stampo in PTFE utilizzati per la preparazione di spugna di seta patibolo le dimensioni:.. 10 cm di diametro, 2 cm altezza <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig2.jpg" /> Figura 2. Modello 3D tessuto cerebrale-like. (A) poroso spugna seta patibolo. (B) Risultati in diretta colorazione / morti di neuroni al giorno 1 su semina sull&#39;impalcatura di seta prima di collagene embedding (cellule verdi-live, le cellule rosse-morti). I pannelli sul lato destro mostrano la magnification di area catturata in cornici rosse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig3.jpg" /> Figura 3. neuronale escrescenza compartimenti stagni nel modello di tessuto cerebrale 3D-like (A) scompartimenti impalcature:. Red-cell vano corpo, vano Blu-assonale. (B) modello di crescita neuronale al giorno 1 su semina prima collagene incorporamento. (C). Escrescenza neuronale al giorno 7 su seminare nel vano corpo cellulare. (D) escrescenza neuronale al giorno 7 su semina nel compartimento assonale. Verde -. ΒIIITubulin <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo</a>figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig4.jpg" /> Figura 4. Rendimento atteso di (A) RNA e DNA, e (B) proteine ​​per costrutto in relazione alla quantità di cellule seminati per ponteggio (± SD, n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .</a>

La comprensione delle complesse azioni del cervello richiede strumenti di ricerca avanzati. Qui dimostriamo un nuovo modello ingegnerizzato in 3D basato su collagene di seta di tessuto neurale che assomiglia a un'architettura simile a un cervello. Il modello può essere utilizzato per studiare l'assemblaggio della rete neuronale, la guida assonale, le interazioni cellula-cellula e l'attività elettrica.

A base di seta-collagene Engineered Modello 3D del tessuto neurale polarizzata

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare il processo ingegneristico di tessuti simili al cervello in 3D. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando degli scaffold porosi a partire da una soluzione di seta, utilizzando una tecnica di lisciviazione con sale. Il secondo passaggio consiste nel tagliare preventivamente gli scaffold in forme a ciambella e nel prepararli per la coltura cellulare mediante sterilizzazione e rivestimento con poli-d-lisina o PDL.Successivamente, gli scaffold preparati vengono seminati con neuroni corticali primari di ratto appena isolati. L'ultimo passaggio consiste nell'inclusione degli scaffold in collagene e nel trasferimento nelle piastre di coltura. Infine, la microscopia a immunofluorescenza viene utilizzata per mostrare la crescita neurale e lo sviluppo delle reti neurali.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi di malattie che colpiscono il cervello, poiché tale tecnica può essere utilizzata come base per lo sviluppo di nuovi modelli di ricerca sul Parkinson o sull'Alzheimer. Prima di iniziare, preparare la soluzione di seta al 6% come descritto nel protocollo del testo e conservarla a quattro gradi Celsius. Per preparare gli scaffold porosi, setacciare innanzitutto il cloruro di sodio granulare e raccogliere i granuli con diametro compreso tra 500 e 600 micrometri.Versare 30 millilitri della soluzione di seta nel modulo in politetrafluoroetilene o PTFE, quindi distribuire uniformemente 60 grammi di cloruro di sodio setacciato sulla soluzione. Incubare per 48 ore a temperatura ambiente per polimerizzare la seta.Posizionare l'impalcatura contenente lo stampo in un forno impostato a 60 gradi Celsius per un'ora per completare il reticolaggio della seta ed evaporare qualsiasi liquido residuo. Successivamente, immergere lo stampo e l'impalcatura in un becher da due litri contenente acqua distillata per 48 ore. Per rimuovere il sale, cambiare l'acqua da due a tre volte al giorno.Rimuovere l'impalcatura dallo stampo e tagliarla in piccoli pezzi. Inizialmente utilizzare un punch per biopsia di cinque millimetri di diametro. Successivamente, tagliare l'impalcatura in modo che abbia un'altezza di due millimetri e rimuovere il centro di ogni pezzo con un punch per biopsia di due millimetri.Autoclavare le impalcature in un ciclo umido per 20 minuti. All'interno di una cappa a flusso laminare, posizionare una coppia di pinzette sterili, il mezzo di coltura cellulare e le impalcature autoclavate. Rimuovere una piastra a 96 pozzetti dall'involucro e posizionarla all'interno per seminare le impalcature.Posizionare innanzitutto un'impalcatura sterile per pozzetto. Nella piastra a 96 pozzetti, aggiungere il mezzo di coltura cellulare per immergere le impalcature e incubare a 37 gradi Celsius in un'incubatrice per colture tessutali per almeno 30 minuti al fine di equilibrarle. Al termine dell'incubazione, aspirare il mezzo in eccesso dalle impalcature.Quindi aggiungere due volte 10 alla sesta di cellule neuronali corticali di ratto in 100 microlitri di mezzo neurobasale per ogni scaffold. Rimettere la piastra nell'incubatore e lasciare tutta la notte per consentire alle cellule di aderire allo scaffold. Nella mattina seguente.Aspirare con attenzione le cellule non aderenti e sostituirle con 200 microlitri di mezzo di coltura fresco. Incubare a 37 gradi Celsius per un breve periodo. Successivamente, aspirare il mezzo dai pozzetti utilizzando pinze sterili.Trasferire i supporti contenenti le cellule in pozzetti vuoti della piastra a 96 pozzetti, quindi aggiungere a ciascun supporto 100 microlitri di soluzione di collagene di coda di ratto, appena diluita e fredda (3 milligrammi per millilitro). Reintrodurre le cellule nell'incubatore a 37 gradi Celsius per consentire la polimerizzazione del collagene per 30 minuti.Rimuovere la piastra dall'incubatore e aggiungere 100 microlitri di mezzo di coltura cellulare preriscaldato per pozzetto. Riposizionare la piastra nell'incubatore per il periodo desiderato di crescita cellulare, sostituendo ogni giorno metà del mezzo in ciascun pozzetto con mezzo fresco, per un massimo di una settimana.In questi scaffold altamente porosi, le cellule neuronali possono essere coltivate ad alta densità, come mostrato. Di seguito sono riportati i risultati sulla vitalità cellulare. Un giorno dopo la semina, le cellule vive marcate con diacetato fluorescente appaiono in verde e lo ioduro di propidio e lo scaffold in seta.In rosso, notare l'elevata percentuale di cellule vive osservate a basso ingrandimento. Questa immagine mostra la compartimentalizzazione dei corpi cellulari neuronali e dei processi assonali all'interno dell'impalcatura a forma di ciambella. I corpi cellulari neuronali rimangono attaccati all'impalcatura di seta, come mostrato qui a un giorno dalla semina; le cellule sono state immunomarcate per la beta-tubulina tre e appaiono verdi.Come previsto, le cellule hanno colonizzato densamente lo scaffold entro il settimo giorno di coltura. Al contrario, la matrice di collagene nella cavità centrale dello scaffold fornisce un supporto per una crescita assonale estesa. Qui viene mostrata la rete assonale.Sette giorni dopo la semina. Questo filmato mostra una scansione confocale in Z della finestra centrale di collagene dell'impalcatura contenente le cellule della rete neurale, marcate mediante colorazione per la beta-tubulina tre. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come allestire costrutti tessutali tridimensionali simili al cervello.

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Bioingegneria

Questo video mostra la creazione di un modello di tessuto neurale polarizzato in 3D utilizzando scaffold di seta-collagene. Descrive in dettaglio il processo di semina delle cellule neuronali su scaffold di seta porosa, l'incubazione per l'attaccamento cellulare, l'incorporazione dell'impalcatura con il collagene e sottolinea l'importanza della matrice di collagene di supporto nella formazione di un modello di tessuto neurale polarizzato 3D.

Sviluppo di un modello 3D ingegnerizzato basato su seta-collagene di tessuto neurale polarizzato

Fonte: Struzyna, L. A. et. al., Reti neurali ingegnerizzate tridimensionali di microtessuti anatomicamente ispirate per la ricostruzione, la modulazione e la modellazione del sistema nervoso. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra lo sviluppo di reti neurali micro-tessili utilizzando una micro-colonna in idrogel con un nucleo a matrice extracellulare. Gli aggregati neuronali seminati aderiscono, estendono le proiezioni e formano reti neurali strutturate, contribuendo ai progressi nello sviluppo...

Sviluppo di una rete neurale micro-tessutale utilizzando una micro-colonna basata su idrogel

In questo lavoro, un nuovo modello sperimentale in cui le colture neuronali 3D sono accoppiate a array di microelettrodi planari (MEA) è presented. 3D le reti sono costruite seminando i neuroni in un'impalcatura composta da microsfere di vetro su cui i neuroni crescono e formano strutture 3D interconnesse.

Interfacciamento 3D Engineered neuronali Culture a Micro-Electrode Array: Un innovativo<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello sperimentale

Questo manoscritto specifica la realizzazione di reti neurali rivelate micro-tessuto: costruzioni tridimensionali di dimensioni microniche costituite da tratti longitudinali allineati allineati che comprendono la popolazione neuronale aggregata racchiuse in un idrogel tubolare. Questi impalcature viventi possono servire come relè funzionali per ricostruire o modulare la circuiteria neurale o come test-letti biofidelici che imitano la neuroanatomia della materia grigio-bianca.

Le reti neurali ricalcolate anatomicamente tridimensionali dei micro-tessuti per la ricostruzione, la modulazione e la modellazione del sistema nervoso

Presenteremo lo sviluppo di auto-assemblati, tridimensionale fasci di somata astrocytic allineati longitudinalmente e processi all'interno di un encasement romanzo biomateriale. Questi ingegnerizzato "ponteggi vivente", che esibiscono micron-scala diametro ancora estendere centimetri di lunghezza, può servire come banchi di prova per lo studio dei meccanismi dello sviluppo neurologico o facilitare la neurorigenerazione di regia della migrazione neuronale e/o assonale path-finding.

Tessutale tridimensionale allineato Astrocyte reti per ricapitolare i meccanismi dello sviluppo e facilitare la rigenerazione del sistema nervoso

Qui, forniamo un metodo per analizzare il comportamento degli assoni in crescita in matrici 3D, imitando il loro sviluppo naturale.

Generazione di idrogel 3D basati su collagene per analizzare la crescita e il comportamento assonali durante lo sviluppo del sistema nervoso

Questo documento presenta una strategia per la costruzione di modelli agli elementi finiti di materiali conduttivi fibrosi esposti a un campo elettrico (EF). I modelli possono essere utilizzati per stimare l'input elettrico che le cellule seminate in tali materiali ricevono e valutare l'impatto della modifica delle proprietà, della struttura o dell'orientamento del materiale costitutivo dell'impalcatura.

Modellazione agli elementi finiti di un microambiente elettrico cellulare

Questo documento elenca i passaggi necessari per seminare linee cellulari di neuroblastoma su scaffold tridimensionali a base di collagene precedentemente descritti, mantenere la crescita cellulare per un periodo di tempo predeterminato e recuperare scaffold per diverse analisi della crescita cellulare e del comportamento cellulare e applicazioni a valle, adattabili per soddisfare una serie di obiettivi sperimentali.

Modello biomimetico tridimensionale in vitro di neuroblastoma utilizzando scaffold a base di collagene

Questo lavoro descrive un protocollo per la stampa 3D incorporata a forma libera di cellule staminali neurali all'interno di compositi di matrice extracellulare ricottura autorigeneranti. Il protocollo consente la modellazione programmabile di costrutti di tessuto neurale umano interconnessi con alta fedeltà.

Supporto composito a matrice microgel-extracellulare per la stampa 3D embedded di costrutti neurali umani

Qui, presentiamo un protocollo per produrre cocolture biostampate in 3D di neuroni e astrociti derivati da iPSC. Questo modello di cocoltura, generato all'interno di un'impalcatura di idrogel in formati a 96 o 384 pozzetti, dimostra un'elevata vitalità post-stampa e la crescita dei neuriti entro 7 giorni e mostra l'espressione di marcatori di maturità per entrambi i tipi di cellule.

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Scopri come creare modelli 3D di tessuto neurale usando scaffold di seta e collageno con neuroni corticali di ratto. Questa tecnica consente di studiare reti neurali e malattie neurodegenerative.

A base di seta-collagene Engineered Modello 3D del tessuto neurale polarizzata

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