Name: Microfluidic genipina Deposizione Tecnica per la cultura estesa di micropatterned vascolari muscolari Thin Films (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Impara la deposizione microfluidica di genipina per colture vascolari estese su film sottili muscolari. Questo metodo migliora la vitalità tissutale e consente lo studio della contrattilità vascolare su scale temporali rilevanti per le malattie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo il sostegno finanziario dell'American Heart Association Scientist Development Grant, 13SDG14670062 (PWA) e della University of Minnesota Doctoral Dissertation Fellowship (ESH). Riconosciamo anche le risorse di microfabbricazione del Minnesota Nano Center (MNC) e le risorse di elaborazione delle immagini degli University Imaging Centers (UIC), entrambi dell'Università del Minnesota. Parte di questo lavoro è stato svolto presso la Characterization Facility dell'Università del Minnesota, che riceve un supporto parziale dalla NSF attraverso il programma MRS.

<ol><li>Humphrey, J. D., Baek, S., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemomechanics+of+cerebral+vasospasm+and+its+resolution%3A+I.+A+new+hypothesis+and+theoretical+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Biochemomechanics of cerebral vasospasm and its resolution: I. A new hypothesis and theoretical framework.</a> Ann. Biomed. Eng. 35, 1485-1497 (2007).</li>
<li>Hald, E. S., Alford, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+phenotype+switching+in+blast+traumatic+brain+injury-induced+cerebral+vasospasm%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle phenotype switching in blast traumatic brain injury-induced cerebral vasospasm.</a> Transl. Stroke Res. 5, 385-393 (2014).</li>
<li>Olivetti, G., Anversa, P., Melissari, M., Loud, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometry+of+medial+hypertrophy+in+the+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Morphometry of medial hypertrophy in the rat thoracic aorta.</a> Lab. Invest. 42, 559-565 (1980).</li>
<li>, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-241 (2000).</li>
<li>Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biohybrid+thin+films+for+measuring+contractility+in+engineered+cardiovascular+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle.</a> Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).</li>
<li>Rhodin, J. A. G. Architecture of the vessel wall. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRhodin%2C+JAG+%22Physiol.+Rev%22">Physiol. Rev</a>. ed, B. erne,R. ., , American Physiology Society. (1979).</li>
<li>Balachandran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+strain+induces+dual-mode+endothelial-mesenchymal+transformation+of+the+cardiac+valve%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 19943-19948 (2011).</li>
<li>Grosberg, A., Alford, P. W., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensembles+of+engineered+cardiac+tissues+for+physiological+and+pharmacological+study%3A+heart+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ensembles of engineered cardiac tissues for physiological and pharmacological study: heart on a chip.</a> 11, 4165-4173 (2011).</li>
<li>Alford, P. W., Nesmith, A. P., Seywerd, J. N., Grosberg, A., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+contractility+depends+on+cell+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle contractility depends on cell shape.</a> Integr. Biol. (Camb). 3, 1063-1070 (2011).</li>
<li>Win, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+architecture+within+cell-dense+vascular+tissues+influences+functional+contractility%29%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle architecture within cell-dense vascular tissues influences functional contractility).</a> Integr. Biol. (Camb). , (2014).</li>
<li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio%2Fnon-bio+interfaces%3A+a+straightforward+method+for+obtaining+long+term+PDMS%2Fmuscle+cell+biohybrid+constructs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Surface+B%22%5BJournal%5D)">Bio/non-bio interfaces: a straightforward method for obtaining long term PDMS/muscle cell biohybrid constructs).</a> Colloid Surface B. 105, 144-151 (2013).</li>
<li>Fessel, G., Cadby, J., Wunderli, S., van Weeren, R., Snedeker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-+and+time-dependent+effects+of+genipin+crosslinking+on+cell+viability+and+tissue+mechanics+-+Toward+clinical+application+for+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Dose- and time-dependent effects of genipin crosslinking on cell viability and tissue mechanics - Toward clinical application for tendon repair.</a> Acta Biomater. , (2013).</li>
<li>Lima, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genipin+enhances+the+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage+and+protects+against+inflammatory+degradation+when+used+as+a+medium+supplement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Genipin enhances the mechanical properties of tissue-engineered cartilage and protects against inflammatory degradation when used as a medium supplement.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 692-700 (2009).</li>
<li>Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadhavan%2C+K+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22">J. Biomed. Mater. Res. A</a>. , (2011).</li>
<li>Satyam, A., Subramanian, G. S., Raghunath, M., Pandit, A., Zeugolis, D. I. In vitro evaluation of Ficoll-enriched and genipin-stabilised collagen scaffolds. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSatyam%2C+A+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22">J. Tissue Eng. Regen. Med</a>. , (2012).</li>
<li>Alford, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blast-induced+phenotypic+switching+in+cerebral+vasospasm%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 12705-12710 (2011).</li>
<li>Song, H., Tice, J. D., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+system+for+controlling+reaction+networks+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">A microfluidic system for controlling reaction networks in time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, 768-772 (2003).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+vascular+contractility+assay+using+genipin-modified+muscular+thin+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Long-term vascular contractility assay using genipin-modified muscular thin films.</a> Biofabrication. 6, 045005(2014).</li>
<li>Han, M., Wen, J. K., Zheng, B., Cheng, Y., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+deprivation+results+in+redifferentiation+of+human+umbilical+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Serum deprivation results in redifferentiation of human umbilical vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C50-C58 (2006).</li>
<li>Feinberg, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+thin+films+for+building+actuators+and+powering+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Muscular thin films for building actuators and powering devices.</a> Science. 317, 1366-1370 (2007).</li>
<li>Volfson, D., Cookson, S., Hasty, J., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+ordering+of+dense+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Biomechanical ordering of dense cell populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 15346-15351 (2008).</li>
<li>Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+remodeling+in+hypertension%3A+roles+of+apoptosis%2C+inflammation%2C+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis.</a> Hypertension. 38, 581-587 (2001).</li>
<li>Kayembe, K. N., Sasahara, M., Hazama, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+aneurysms+and+variations+in+the+circle+of+Willis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cerebral aneurysms and variations in the circle of Willis.</a> Stroke. 15, 846-850 (1984).</li>
<li>McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromolded+gelatin+hydrogels+for+extended+culture+of+engineered+cardiac+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues.</a> Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).</li>
<li>Weir, B., Grace, M., Hansen, J., Rothberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+vasospasm+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Time course of vasospasm in man.</a> 48, 173-178 (1978).</li>
<li>McCain, M. L., Sheehy, S. P., Grosberg, A., Goss, J. A., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+maladaptive%2C+multiscale+remodeling+of+failing+myocardium+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Recapitulating maladaptive, multiscale remodeling of failing myocardium on a chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9770-9775 (2013).</li>
<li>Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+heart+on+a+chip+for+higher+throughput+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies.</a> Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).</li>
<li>Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+physiological+biomimicry%3A+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips.</a> Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).</li>
<li>Meer, A. D., van den Berg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips%3A+breaking+the+in+vitro+impasse%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse.</a> Integr. Biol. (Camb). 4, 461-470 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, vi presentiamo un protocollo che si basa sulla tecnologia vMTF precedentemente sviluppato, consentendo tempi prolungati esperimento più tipico dei percorsi croniche malattie vascolari 1,23,24. Per realizzare ciò, si micropattern genipina, che è stato precedentemente dimostrato di fornire funzionalizzazione a lungo termine di substrati PDMS 11, utilizzando una tecnica di deposizione microfluidi cedere lamelle arteriosa progettato con migliorata viabilità tessuto vascolare per esperimenti contra...

Malattie vascolari, come il vasospasmo cerebrale 1,2, ipertensione 3, 4 e aterosclerosi, si sviluppano lentamente, sono tipicamente di natura cronica, e coinvolgere disfunzionale forza-generazione da parte delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC). Il nostro obiettivo è di studiare queste disfunzioni vascolari lenta progressione che utilizzano metodi in vitro con un controllo più preciso delle condizioni sperimentali rispetto ai modelli in vivo. Film Abbiamo già sviluppato vascolari muscolari sottili (vMTFs) per la misurazione della contrattilità funzionale in vitro progettati tessuti cardiovascolari 5, ma questo metodo è stata limitata a relativamente studi a breve termine. Qui vi presentiamo una tecnica modifica substrato che espande la nostra precedente tecnica vMTF per misure a lungo termine. Mentre l&#39;endotelio è fondamentale anche in funzione vascolare generale, lamelle arteriosa progettato fornire un sistema modello utile per valutare i cambiamenti in vascolarecontrattilità durante la progressione della malattia. Per progettare un modello di tessuto malattia vascolare funzionale, sia la struttura e la funzione della lamella arteriosa, l&#39;unità contrattile base del recipiente, deve essere riassunta con alta fedeltà. Arteriosa lamelle sono concentrici, fogli circonferenzialmente allineati di VSMC contrattili separati da fogli di elastina 6. Stampa microcontact di matrice extracellulare (ECM) proteine ​​su polidimetilsilossano (PDMS) substrati è stata precedentemente utilizzata per fornire spunti di orientamento per l&#39;organizzazione dei tessuti di imitare allineato tessuto cardiovascolare 5,7-10. Tuttavia, i tessuti modellati utilizzando la stampa microcontact può perdere integrità dopo 3-4 giorni di cultura, limitando la loro applicabilità in studi cronici. Questo protocollo fornisce una soluzione a questo problema, sostituendo tecniche di stampa microcontact precedenti con una nuova tecnica di deposizione microfluidica. Modificati PDMS substrati con genipina e f Genchi et al.ound prolungata sopravvivenza dei miociti fino a un mese di cultura 11. Qui, usiamo un approccio simile per estendere la cultura delle cellule muscolari lisce vascolari modellate su PDMS. Genipina, un derivato idrolitica naturale della frutta gardenia, è un candidato desiderabile per la modifica del substrato a causa della sua tossicità relativamente bassa rispetto ad agenti reticolanti simili e il suo uso crescente come biomateriale nel campo della riparazione tissutale 12,13 e ECM modifica 14, 15. In questo protocollo, la fibronectina è utilizzata come spunto di orientamento delle cellule, come in metodi di stampa microcontact precedenti; tuttavia, genipina viene depositata su PDMS substrati prima della fibronectina patterning. Così, come le cellule si degradano la matrice fantasia, ECM di nuova sintesi di VSMC collegati può legarsi al substrato PDMS genipina rivestite. Questo protocollo utilizza un dispositivo di somministrazione microfluidica per due fasi genipina e ECM deposizione. Il design della microfluidica imita dispositivo microcomodelli di stampa ntact utilizzati per lamelle arteriosa progettato in studi precedenti 16. Quindi, ci aspettiamo che questo protocollo di cedere imita lamelle arteriosa che ricapitolano successo altamente allineato per struttura vivo e la funzione contrattile del lamelle arteriosa. Si valutano anche contrattilità tessuto per confermare che genipina è un composto modifica substrato adatto a lungo termine in vitro modelli di malattia vascolare.

<table><tbody><tr><td>Rack per la colorazione dei vetrini coprioggetto</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com/</a></td><td>72239-04</td></tr><tr><td>Vetro di copertura del microscopio - 25 mm</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td><a href="http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com</a></td><td>12-545-102</td></tr><tr><td>Poli(N-iso-propilacrilammide) (PIPAAm)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>#21458</td></tr><tr><td>1-butanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>360465</td></tr><tr><td>Spincoater</td><td>Specialty Coating Systems, Inc.</td><td><a href="http://www.scscoatings.com/">www.scscoatings.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsilossano (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives (Dow Corning)</td><td><a href="http://www.ellsworth.com/">www.ellsworth.com</a></td><td>184 KIT SIL ELAST 0.5KG</td></tr><tr><td>Microsfere fluorescenti</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>17151</td></tr><tr><td>Wafer di silicio</td><td>Wafer World, Inc.</td><td><a href="http://www.waferworld.com/">www.waferworld.com</a></td><td>2398</td></tr><tr><td>Photoresist&nbsp;</td><td>MicroChem Corp.</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Allineatore maschera a contatto</td><td>Suss MicroTec</td><td><a href="http://www.suss.com/">www.suss.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Sviluppatore</td><td>MicroChem Corp.</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Tridecafluro-triclorosilano</td><td>UCT Specialties, Inc.</td><td><a href="http://www.unitedchem.com/">www.unitedchem.com</a></td><td>T2492</td></tr><tr><td>Punzone chirurgico per biopsia</td><td>Integra LifeSciences Corp.</td><td><a href="http://www.miltex.com/">www.miltex.com</a></td><td>33-31AA-P/25</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Cayman Chemical</td><td><a href="http://www.caymanchem.com/">www.caymanchem.com</a></td><td>10010622</td></tr><tr><td>1X soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Mediatech, Inc.</td><td><a href="http://www.cellgro.com/">www.cellgro.com</a></td><td>21-031-CV</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Corning, Inc.</td><td><a href="http://www.corning.com/">www.corning.com</a></td><td>356008</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Life Technologies, Inc.</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">www.lifetechnologies.com</a></td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Cellule muscolari lisce dell'arteria ombillale</td><td>Lonza</td><td><a href="http://www.lonza.com/">www.lonza.com</a></td><td>CC-2579</td></tr><tr><td>Componenti della soluzione di Tyrode</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>vari</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Zeiss</td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td><td>4350020000000000</td></tr><tr><td>Piattaforma a temperatura controllata</td><td>Warner Instruments</td><td><a href="http://www.warneronline.com/">www.warneronline.com</a></td><td>641659; 640352; 641922</td></tr><tr><td>Endotelina-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>E7764-50UG</td></tr><tr><td>HA-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>H139-10MG</td></tr></tbody></table>

microfluidic genipina deposizione tecnica per la cultura estesa di micropatterned vascolari muscolari thin films

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

La natura cronica della progressione della malattia vascolare richiede lo sviluppo di tecniche sperimentali che simulano comportamenti vascolari fisiologici e patologici su scale temporali rilevanti per la malattia. In precedenza, la stampa a microcontatto è stata utilizzata per fabbricare imitazioni arteriose funzionali bidimensionali attraverso la modellazione di proteine della matrice extracellulare come segnali di guida per l'organizzazione dei tessuti. I film sottili muscolari vascolari hanno utilizzato questi imitatori per valutare la contrattilità funzionale. Tuttavia, la tecnica di fabbricazione della stampa a microcontatto utilizzata incorpora tipicamente substrati PDMS idrofobici. Quando il tessuto gira la matrice extracellulare sottostante, le nuove proteine devono subire un cambiamento conformazionale o una denaturazione al fine di esporre i residui di amminoacidi idrofobici alle superfici idrofobiche del PDMS per l'attaccamento, con conseguente alterazione della bioattività delle proteine della matrice, delaminazione e morte dei tessuti.
Qui, presentiamo una tecnica di deposizione microfluidica per la modellazione del composto reticolante genipina. La genipina funge da intermediario tra i tessuti modellati e i substrati PDMS, consentendo alle cellule di depositare la proteina della matrice extracellulare appena sintetizzata su una superficie più idrofila e di rimanere attaccate ai substrati PDMS. Abbiamo anche dimostrato che le proteine della matrice extracellulare possono essere modellate direttamente sulla genipina depositata, consentendo la dettatura della struttura del tessuto ingegnerizzato. I tessuti fabbricati con questa tecnica mostrano un'elevata fedeltà sia nell'allineamento strutturale che nella funzione contrattile del tessuto muscolare liscio vascolare in un modello a film sottile muscolare vascolare. Questa tecnica può essere estesa utilizzando altri tipi di cellule e fornisce il quadro per lo studio futuro della funzionalità cronica a livello di tessuto e organo.

L&#39;obiettivo principale di questo lavoro è stato quello di estendere la validità di VSMCs micropatterned su PDMS idrofobiche substrati. Ciò è stato realizzato incorporando un sistema di consegna microfluidico depositare genipina modellata e fibronectina su PDMS (Figura 1). Deposizione di proteine ​​ECM utilizzando l&#39;invio microfluidica prodotto alto trasferimento fedeltà del modello di canale con PDMS nude tra le linee di genipina e fibronectina (Figura 1D). Le cellule attaccate ...

Presentiamo un metodo per la deposizione microfluidica di genipina e fibronectina modellate su substrati PDMS, consentendo una maggiore vitalità di tessuti densi di cellule muscolari lisce vascolari. Questo metodo di fabbricazione dei tessuti è combinato con la precedente tecnologia a film sottile muscolare vascolare per misurare la contrattilità vascolare nel corso del tempo rilevante per la malattia.

Microfluidic genipina Deposizione Tecnica per la cultura estesa di micropatterned vascolari muscolari Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare un modello in vitro della funzione contrattile del muscolo liscio che possa essere utilizzato per studiare i meccanismi dei disordini vascolari, come le vasospasmi cerebrali, su scale temporali rilevanti per la patologia. Questo risultato viene ottenuto mediante film sottili muscolari vascolari a lungo termine, preparando innanzitutto substrati di elastomero mediante rivestimento a centrifuga seriale di coprioggetti con una striscia di piam seguita da PDMS. Il secondo passaggio consiste nell'utilizzare un dispositivo di deposizione microfluidico per depositare in serie genina e fibronectina sulla superficie.Al fine di fornire indicazioni per l'auto-organizzazione dei tessuti su film sottili vascolari e muscolari, l'ultimo passaggio consiste nell'eseguire un saggio di contrattilità inducendo la contrazione e il rilascio dei film sottili vascolari e muscolari, mentre si acquisiscono immagini del campione. In definitiva, questo approccio consente di ottenere tessuti che mantengono fedeltà strutturale e contrattilità funzionale fino a due settimane in coltura. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i film sottili muscolari ottenuti mediante microstampa per contatto, è che l'integrità del tessuto e la contrattilità funzionale vengono mantenute per settimane, mentre i tessuti realizzati con metodi precedenti iniziano a degradarsi dopo tre o quattro giorni.In coltura, questo metodo fornisce una piattaforma per lo studio di domande fondamentali nelle malattie vascolari, come ad esempio in che modo la meccanica funzionale delle arterie viene alterata durante la progressione di una malattia cronica. Qui stiamo studiando la meccanica vascolare, ma questo metodo può essere applicato ad altri sistemi organici modello, come le tecnologie di organo su chip per riprodurre la funzione cardiaca o del muscolo scheletrico. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo cercato di studiare disfunzioni vascolari a sviluppo lento e abbiamo scoperto che i metodi attuali o non potevano essere utilizzati per quantificare la funzione delle cellule muscolari lisce vascolari, oppure non mantenevano l'integrità per un periodo di tempo sufficiente.La deposizione microfluidica Jin fornisce un modello per l'auto-organizzazione cellulare in modo simile alla stampa microcontatto, ma permette anche ai tessuti stampati di mantenere la loro struttura e integrità su scale temporali adatte allo studio del rimodellamento vascolare. Per iniziare, pulire un lotto di coprioggetti di vetro con diametro di 25 millimetri come descritto nel protocollo testuale allegato; coprire i bordi dei coprioggetti puliti applicando del nastro adesivo sui loro lati, lasciando una striscia di vetro esposta al centro. Successivamente, tagliare i coprioggetti dal piatto e posizionarli uno alla volta su un mandrino rivestito mediante spin coating.Utilizzando pinzette, aggiungere 150 microlitri di una soluzione al 10% di poli N isop profilo. L'acrilamide, chiamata anche poli pam o Piam, è disciolta in un butanolo. Assicurarsi di coprire completamente l'area esposta del vetrino coprioggetto.Quindi accendere il centrifugo e aumentare la velocità per 10 secondi fino a 3000 giri/min. Attendere cinque secondi, quindi aumentare per 10 secondi fino a 6.000 giri/min. Mantenere per un minuto a 6.000 giri/min, quindi ridurre nuovamente a 3000 giri/min in 10 secondi.Mantenendolo in posizione per cinque secondi prima di completare il ciclo di spin coating. Una volta asciutto, rimuovere con attenzione il nastro adesivo da tutti i coverslip, lasciando il coverslip completamente esposto con uno strato sottile di rivestimento di piam al centro del vetrino in vetro. Successivamente, si deposita uno strato di PDMS desgasato su ciascun coverslip mediante spin coating.Far scivolare e polimerizzare in forno a 90 gradi Celsius per almeno 1,5 ore. Progettare una maschera fotolitografica per microfluidica tissutale e quindi preparare una wafer di silicio con il pattern desiderato come descritto nel protocollo testuale allegato. Una volta realizzato il pattern, inciderre la wafer utilizzando tecniche standard e posizionarla con la superficie strutturata rivolta verso l'alto in una piastra di Petri.Successivamente, mescolare 100 grammi di PDMS con un rapporto di 10 a 1 tra base e agente di reticolazione, quindi aspirare il PDMS nella capsula in modo da coprire completamente e uniformemente la wafer strutturata. Collocare la capsula in un essiccatore sotto vuoto per circa 30 minuti, fino a quando tutte le bolle d'aria saranno rimosse. Successivamente, polimerizzare il PDMS nella capsula a 90 gradi Celsius per almeno 1,5 ore.Dopo la polimerizzazione, rimuovere l'eccesso di PDMS e staccare lentamente il PDMS strutturato rimanente dal lato del wafer contenente il pattern. Tagliare l'eccesso di PDMS attorno ai pattern utilizzando una lametta e sagomare i dispositivi in forma rettangolare per facilitare la rimozione del dispositivo nei passaggi successivi. Successivamente, utilizzare un punch chirurgico per biopsia da un millimetro per creare i fori di ingresso e di uscita.Sonicare i dispositivi microfluidici in etanolo al 70% per almeno 30 minuti prima di ogni utilizzo. Posizionare fino a 10 coprioggetti con substrato di film sottile muscolare vascolare in un depuratore a ozono ultravioletto per otto minuti. Successivamente, preparare una soluzione di genina a cinque milligrammi per millilitro aggiungendo un millilitro di acqua sterile doppia distillata a un contenitore da cinque milligrammi di genina liofilizzata.Mescolare la soluzione utilizzando un agitatore vortex e lasciare il vial a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. Posizionare i dispositivi microfluidici puliti con il lato dei componenti rivolto verso il basso su ciascun coperchio. Inserire uno alla volta.Premere con forza sui dispositivi per assicurare una sigillatura stretta con i cover slip rivestiti di PDMS. Aggiungere rapidamente una goccia di etanolo al 70% all'ingresso di ciascun dispositivo per la preparazione iniziale. Dopo cinque-dieci minuti, aspirare con attenzione l'eccesso di etanolo all'ingresso e sostituirlo immediatamente con circa 100 microlitri di PBS.Utilizzare un vuoto per far passare il PBS fino all'uscita dei dispositivi, in modo da rimuovere l'etanolo. Fermare quando nel punto di ingresso rimane solo una piccola quantità di PBS. Quindi aggiungere 60 microlitri di soluzione di genina a cinque milligrammi per millilitro in ciascun punto di ingresso, facendo passare la soluzione di genina attraverso i dispositivi sostituendo la punta dell'aspiratore a vuoto all'uscita.Interrompere l'aspirazione quando rimane solo una piccola quantità di soluzione all'ingresso. Successivamente, aggiungere gocce di PBS sia all'ingresso che all'uscita per evitare che la soluzione si asciughi. Durante l'incubazione, trasferire la piastra contenente i dispositivi in un forno o incubatore umidificato regolato a 37 gradi Celsius e incubare per quattro ore.Durante l'incubazione, ri-sospendere la fibronectina a una concentrazione di 50 microgrammi per millilitro in acqua distillata sterile e porla sul ghiaccio per almeno 30 minuti dopo l'incubazione con Jin. Far passare attraverso, o aggiungere una quantità minima di PBS all'ingresso. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di una soluzione di fibronectina a 50 microgrammi per millilitro.Ad ogni ingresso, aspirare la soluzione attraverso i dispositivi utilizzando la punta di un aspiratore a vuoto. All'uscita, trasferire la piastra scoperta contenente i dispositivi in un forno o incubatore impostato a 37 gradi Celsius ed incubare per 24 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere con attenzione i dispositivi dai vetrini staccandoli lentamente a partire da un angolo, tenendo saldamente il vetrino con l'altra mano, quindi posizionare i vetrini in piastre sterili a sei pozzetti.Aggiungere almeno cinque millilitri di soluzione di penicillina-streptomicina in ogni pozzetto, quindi posizionare le piastre in un incubatore sterile a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Dopo la sterilizzazione, aspirare la soluzione di penicillina-streptomicina e seminare i coverslip con cellule muscolari lisce vascolari umane dell'arteria ombelicale coltivate a una concentrazione di 80.000 cellule per centimetro quadrato. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per almeno 24 ore prima del test.Per iniziare il test, posizionare un campione di tessuto in una piastra da 100 millimetri. Aggiungere soluzione di Tyro sterile preriscaldata a pH 7,4 per coprire il campione. Utilizzando una lametta, effettuare diversi tagli paralleli attraverso il foglietto cellulare perpendicolarmente al bordo del braccio della pipetta.Effettuare tagli che producano sezioni di tessuto più ampie, di circa due millimetri di spessore. Queste costituiranno i film sottili vascolari muscolari alternati a strisce sottili da rimuovere successivamente. Quindi ruotare la piastra di 90 gradi ed effettuare due tagli paralleli e dritti al centro del tessuto, paralleli alla striscia di piam.Rimuovere le sottili strisce presenti tra i film vascolari e muscolari per evitare che film adiacenti entrino in contatto. Successivamente, posizionare la piastra su una piattaforma a temperatura controllata montata sullo stadio del microscopio stereoscopico e iniziare ad acquisire immagini in luce trasmessa e fluorescente, con riprese sequenziali a intervalli desiderati durante il saggio di trattamento. Trattare in successione i film sottili vascolari e muscolari con 50 nanomolar di endotelio per 20 minuti per indurre contrazioni, seguiti da 100 micromolar di HA 10 77 per 30 minuti per indurre rilassamento durante il raffreddamento a temperature inferiori a 32 gradi Celsius.Piam si dissolve rilasciando i sottili film muscolari vascolari. La misurazione della lunghezza della proiezione può essere convertita in un raggio di curvatura, utilizzato per calcolare lo sforzo medio nello strato cellulare sul film, mostrato qui nelle immagini in luce trasmessa sequenziale di un saggio rappresentativo di contrattilità. Queste immagini possono essere convertite in valori di sforzo dai quali vengono calcolati il tono basale e la contrattilità indotta.In questo video viene mostrato un esempio rappresentativo di time-lapse relativo a un saggio completo di contrattilità. I film sottili muscolari raggiungono l'equilibrio contrattile, quindi si contraggono ulteriormente dopo l'aggiunta di 50 nM di endotelina. Un film si rilassa dopo l'aggiunta di 100 µM di HA-1077.Il leggero calo del tono basale e della contrattilità del tessuto alla fine del saggio è probabilmente il risultato diretto della ridotta quantità di cellule che compongono il tessuto. Poiché le cellule muscolari lisce vascolari sottoposte a privazione di siero non proliferano, qui vengono mostrate immagini a contrasto di fase di cellule muscolari lisce coltivate su superfici modificate con genina, a diversi tempi di sacrificio che vanno da un giorno a due settimane. L'immunohistochimica è stata utilizzata per evidenziare la confluenza e l'allineamento cellulare dei tessuti, colorando i filamenti di actina F, in verde, dopo uno, quattro e sette giorni di privazione di siero.La valutazione quantitativa della confluenza del tessuto durante questo intervallo di tempo ha mostrato un deterioramento minimo su queste superfici. L'allineamento dei filamenti di actina F è stato quantificato ed è stato confermato che l'allineamento è stato mantenuto per due settimane. In coltura, una volta padroneggiata questa tecnica di fabbricazione del tessuto in vitro, essa può essere eseguita in due giorni.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di iniziare la deposizione microfluidica un giorno prima della semina cellulare prevista e di mantenere una temperatura fisiologica costante durante gli esperimenti con film sottili. Seguendo questo protocollo, è possibile applicare metodi tradizionali di biochimica come il Western blot e la PCR per studiare le variazioni nell'espressione proteica e genica, al fine di correlare il fenotipo cellulare con il comportamento funzionale. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per esplorare l'evoluzione di disfunzioni vascolari a sviluppo lento, come vasospasmo cerebrale, ipertensione e aterosclerosi, nonché modelli in vitro della parete arteriosa umana.

microfluidic-genipin-deposition-technique-for-extended-culture

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

In questo protocollo, dimostriamo la realizzazione di una serie di messaggi microattuatore verticalmente sfollati su cui si basa la tecnologia, e come questa tecnologia di base può essere modificato per condurre high-throughput di coltura cellulare meccanicamente dinamica sia la cultura bidimensionale e tridimensionale paradigmi.

Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

Semplici tecniche sono descritte per la produzione rapida di microfabbricazione sistemi di coltura neurali utilizzando un dispositivo digitale micromirror per litografia dinamica proiezione maschera su substrati regolari colture cellulari. Questi sistemi di coltura possono essere più rappresentativo dell'architettura naturale biologico, e le tecniche descritte potrebbe essere adattato per numerose applicazioni.

Fabbricazione di idrogel Micropatterned per i sistemi Cultura neurali utilizzando Dynamic Fotolitografia proiezione Mask

Un metodo per la cultura un monostrato di cellule endoteliali durante l'intera superficie interna 3D di un dispositivo a microfluidi con microvascolare canali di dimensioni (&lt;30 micron) è descritta.

Microfluidica Endothelialized per lo studio delle interazioni microvascolari nelle patologie ematologiche

Una piattaforma microcanali-on-a-chip è stato sviluppato dalla combinazione di tecnica fotolitografica reflowable photoresist, litografia soft, e microfluidica. La piattaforma microcanali endothelialized imita il tridimensionale (3D) geometria in vivo microvasi, corre sotto flusso perfusione continua controllato, permette l'imaging di alta qualità e in tempo reale e può essere applicato per la ricerca microvascolare.

Procedura per lo sviluppo di multi-profondità circolare a sezione trasversale Endothelialized microcanali-on-a-chip

La creazione di microtessuti funzionali all'interno di dispositivi microfluidici richiede la stabilizzazione dei fenotipi cellulari adattando le tecniche tradizionali di coltura cellulare alle limitate dimensioni spaziali dei microdispositivi. La modifica del collagene consente la deposizione strato per strato di assemblaggi di collagene ultrasottili in grado di stabilizzare le cellule primarie, come gli epatociti, come modelli di tessuto microfluidico.

Layer-by-layer collagene Deposizione nel Microfluidic Dispositivi per microtessuto Stabilizzazione

Questo manoscritto presenta un metodo di stampaggio ad iniezione di progettare microvasi che ricapitolano le proprietà fisiologiche di endotelio. Il processo di microfluidica-based crea reti vascolari brevetto 3D con condizioni tailorable, come il flusso, composizione cellulare, la geometria, e gradienti biochimici. Il processo di fabbricazione ed esempi di possibili applicazioni sono descritte.

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

Questo protocollo delinea l'implementazione della degradazione dell'idrogel basata su laser guidata da immagini per fabbricare reti microfluidiche biomimetiche di derivazione vascolare incorporate in idrogel di poli(etilenglicole) diacrilato (PEGDA). Questi sistemi microfluidici biomimetici possono essere utili per applicazioni di ingegneria tissutale, generazione di modelli di malattie in vitro e fabbricazione di dispositivi avanzati "on-a-chip".

Immagine-guidate, Fabrication laser a base di reti microfluidici vascolare-derivati

Forniamo un protocollo generalizzato basato su una strategia di multimateriali microfluidici per un letto vascolare di microfibrous, dove un tipo di cellula secondaria potrebbe essere ulteriormente seminato nello spazio interstiziale di questa struttura di microfibrous per generare organoids e tessuti vascolarizzati di ingegneria.

Vascularized microfluidic multimateriali per l'ingegneria dei tessuti e Organoids

Il protocollo descrive come progettare una rete vascolare perfusable in uno sferoide. Microambiente circostante di sferoide è inventato per indurre l'angiogenesi e collegare la sferoide a microcanali in un dispositivo microfluidico. Il metodo consente la perfusione della sferoide, che è una tecnica tanto atteso nelle culture tridimensionale.

Perfusable rete vascolare con un modello di tessuto in un dispositivo microfluidico

Qui forniamo un chip microfluidico e un sistema microfluidico di circolazione automaticamente controllato e altamente efficiente che ricapitola il microambiente iniziale della neovascolarizzazione, consentendo alle cellule endoteliali (EC) di essere stimolate da elevate sollecitazioni di taglio luminali, livello fisiologico di flusso transendoteliale e distribuzione simultanea di vari fattori di crescita endoteliali vascolari (VEGF).

Modello microfluidico per imitare l&apos;evento iniziale di neovascolarizzazione

Qui, presentiamo un protocollo per generare un modello di pelle tridimensionale semplificato e indifferenziato utilizzando una piattaforma microfluidica microlavorazione. Un approccio a flusso parallelo consente la deposizione in situ di un compartimento dermico per la semina di cellule epiteliali sulla parte superiore, il tutto controllato da pompe a siringa.

Generazione di un modello skin-on-a-chip tridimensionale semplificato in una piattaforma microfluidica microlavorazione

Impara la deposizione microfluidica di genipina per colture vascolari estese su film sottili muscolari. Questo metodo migliora la vitalità tissutale e consente lo studio della contrattilità vascolare su scale temporali rilevanti per le malattie.

Microfluidic genipina Deposizione Tecnica per la cultura estesa di micropatterned vascolari muscolari Thin Films

Esplora altri video