Microfluidic genipina Deposizione Tecnica per la cultura estesa di micropatterned vascolari muscolari Thin Films

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare un modello in vitro della funzione contrattile del muscolo liscio che possa essere utilizzato per studiare i meccanismi dei disordini vascolari, come le vasospasmi cerebrali, su scale temporali rilevanti per la patologia. Questo risultato viene ottenuto mediante film sottili muscolari vascolari a lungo termine, preparando innanzitutto substrati di elastomero mediante rivestimento a centrifuga seriale di coprioggetti con una striscia di piam seguita da PDMS. Il secondo passaggio consiste nell'utilizzare un dispositivo di deposizione microfluidico per depositare in serie genina e fibronectina sulla superficie.

Al fine di fornire indicazioni per l'auto-organizzazione dei tessuti su film sottili vascolari e muscolari, l'ultimo passaggio consiste nell'eseguire un saggio di contrattilità inducendo la contrazione e il rilascio dei film sottili vascolari e muscolari, mentre si acquisiscono immagini del campione. In definitiva, questo approccio consente di ottenere tessuti che mantengono fedeltà strutturale e contrattilità funzionale fino a due settimane in coltura. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i film sottili muscolari ottenuti mediante microstampa per contatto, è che l'integrità del tessuto e la contrattilità funzionale vengono mantenute per settimane, mentre i tessuti realizzati con metodi precedenti iniziano a degradarsi dopo tre o quattro giorni.

In coltura, questo metodo fornisce una piattaforma per lo studio di domande fondamentali nelle malattie vascolari, come ad esempio in che modo la meccanica funzionale delle arterie viene alterata durante la progressione di una malattia cronica. Qui stiamo studiando la meccanica vascolare, ma questo metodo può essere applicato ad altri sistemi organici modello, come le tecnologie di organo su chip per riprodurre la funzione cardiaca o del muscolo scheletrico. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo cercato di studiare disfunzioni vascolari a sviluppo lento e abbiamo scoperto che i metodi attuali o non potevano essere utilizzati per quantificare la funzione delle cellule muscolari lisce vascolari, oppure non mantenevano l'integrità per un periodo di tempo sufficiente.

La deposizione microfluidica Jin fornisce un modello per l'auto-organizzazione cellulare in modo simile alla stampa microcontatto, ma permette anche ai tessuti stampati di mantenere la loro struttura e integrità su scale temporali adatte allo studio del rimodellamento vascolare. Per iniziare, pulire un lotto di coprioggetti di vetro con diametro di 25 millimetri come descritto nel protocollo testuale allegato; coprire i bordi dei coprioggetti puliti applicando del nastro adesivo sui loro lati, lasciando una striscia di vetro esposta al centro. Successivamente, tagliare i coprioggetti dal piatto e posizionarli uno alla volta su un mandrino rivestito mediante spin coating.

Utilizzando pinzette, aggiungere 150 microlitri di una soluzione al 10% di poli N isop profilo. L'acrilamide, chiamata anche poli pam o Piam, è disciolta in un butanolo. Assicurarsi di coprire completamente l'area esposta del vetrino coprioggetto.

Quindi accendere il centrifugo e aumentare la velocità per 10 secondi fino a 3000 giri/min. Attendere cinque secondi, quindi aumentare per 10 secondi fino a 6.000 giri/min. Mantenere per un minuto a 6.000 giri/min, quindi ridurre nuovamente a 3000 giri/min in 10 secondi.

Mantenendolo in posizione per cinque secondi prima di completare il ciclo di spin coating. Una volta asciutto, rimuovere con attenzione il nastro adesivo da tutti i coverslip, lasciando il coverslip completamente esposto con uno strato sottile di rivestimento di piam al centro del vetrino in vetro. Successivamente, si deposita uno strato di PDMS desgasato su ciascun coverslip mediante spin coating.

Far scivolare e polimerizzare in forno a 90 gradi Celsius per almeno 1,5 ore. Progettare una maschera fotolitografica per microfluidica tissutale e quindi preparare una wafer di silicio con il pattern desiderato come descritto nel protocollo testuale allegato. Una volta realizzato il pattern, inciderre la wafer utilizzando tecniche standard e posizionarla con la superficie strutturata rivolta verso l'alto in una piastra di Petri.

Successivamente, mescolare 100 grammi di PDMS con un rapporto di 10 a 1 tra base e agente di reticolazione, quindi aspirare il PDMS nella capsula in modo da coprire completamente e uniformemente la wafer strutturata. Collocare la capsula in un essiccatore sotto vuoto per circa 30 minuti, fino a quando tutte le bolle d'aria saranno rimosse. Successivamente, polimerizzare il PDMS nella capsula a 90 gradi Celsius per almeno 1,5 ore.

Dopo la polimerizzazione, rimuovere l'eccesso di PDMS e staccare lentamente il PDMS strutturato rimanente dal lato del wafer contenente il pattern. Tagliare l'eccesso di PDMS attorno ai pattern utilizzando una lametta e sagomare i dispositivi in forma rettangolare per facilitare la rimozione del dispositivo nei passaggi successivi. Successivamente, utilizzare un punch chirurgico per biopsia da un millimetro per creare i fori di ingresso e di uscita.

Sonicare i dispositivi microfluidici in etanolo al 70% per almeno 30 minuti prima di ogni utilizzo. Posizionare fino a 10 coprioggetti con substrato di film sottile muscolare vascolare in un depuratore a ozono ultravioletto per otto minuti. Successivamente, preparare una soluzione di genina a cinque milligrammi per millilitro aggiungendo un millilitro di acqua sterile doppia distillata a un contenitore da cinque milligrammi di genina liofilizzata.

Mescolare la soluzione utilizzando un agitatore vortex e lasciare il vial a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. Posizionare i dispositivi microfluidici puliti con il lato dei componenti rivolto verso il basso su ciascun coperchio. Inserire uno alla volta.

Premere con forza sui dispositivi per assicurare una sigillatura stretta con i cover slip rivestiti di PDMS. Aggiungere rapidamente una goccia di etanolo al 70% all'ingresso di ciascun dispositivo per la preparazione iniziale. Dopo cinque-dieci minuti, aspirare con attenzione l'eccesso di etanolo all'ingresso e sostituirlo immediatamente con circa 100 microlitri di PBS.

Utilizzare un vuoto per far passare il PBS fino all'uscita dei dispositivi, in modo da rimuovere l'etanolo. Fermare quando nel punto di ingresso rimane solo una piccola quantità di PBS. Quindi aggiungere 60 microlitri di soluzione di genina a cinque milligrammi per millilitro in ciascun punto di ingresso, facendo passare la soluzione di genina attraverso i dispositivi sostituendo la punta dell'aspiratore a vuoto all'uscita.

Interrompere l'aspirazione quando rimane solo una piccola quantità di soluzione all'ingresso. Successivamente, aggiungere gocce di PBS sia all'ingresso che all'uscita per evitare che la soluzione si asciughi. Durante l'incubazione, trasferire la piastra contenente i dispositivi in un forno o incubatore umidificato regolato a 37 gradi Celsius e incubare per quattro ore.

Durante l'incubazione, ri-sospendere la fibronectina a una concentrazione di 50 microgrammi per millilitro in acqua distillata sterile e porla sul ghiaccio per almeno 30 minuti dopo l'incubazione con Jin. Far passare attraverso, o aggiungere una quantità minima di PBS all'ingresso. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di una soluzione di fibronectina a 50 microgrammi per millilitro.

Ad ogni ingresso, aspirare la soluzione attraverso i dispositivi utilizzando la punta di un aspiratore a vuoto. All'uscita, trasferire la piastra scoperta contenente i dispositivi in un forno o incubatore impostato a 37 gradi Celsius ed incubare per 24 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere con attenzione i dispositivi dai vetrini staccandoli lentamente a partire da un angolo, tenendo saldamente il vetrino con l'altra mano, quindi posizionare i vetrini in piastre sterili a sei pozzetti.

Aggiungere almeno cinque millilitri di soluzione di penicillina-streptomicina in ogni pozzetto, quindi posizionare le piastre in un incubatore sterile a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Dopo la sterilizzazione, aspirare la soluzione di penicillina-streptomicina e seminare i coverslip con cellule muscolari lisce vascolari umane dell'arteria ombelicale coltivate a una concentrazione di 80.000 cellule per centimetro quadrato. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per almeno 24 ore prima del test.

Per iniziare il test, posizionare un campione di tessuto in una piastra da 100 millimetri. Aggiungere soluzione di Tyro sterile preriscaldata a pH 7,4 per coprire il campione. Utilizzando una lametta, effettuare diversi tagli paralleli attraverso il foglietto cellulare perpendicolarmente al bordo del braccio della pipetta.

Effettuare tagli che producano sezioni di tessuto più ampie, di circa due millimetri di spessore. Queste costituiranno i film sottili vascolari muscolari alternati a strisce sottili da rimuovere successivamente. Quindi ruotare la piastra di 90 gradi ed effettuare due tagli paralleli e dritti al centro del tessuto, paralleli alla striscia di piam.

Rimuovere le sottili strisce presenti tra i film vascolari e muscolari per evitare che film adiacenti entrino in contatto. Successivamente, posizionare la piastra su una piattaforma a temperatura controllata montata sullo stadio del microscopio stereoscopico e iniziare ad acquisire immagini in luce trasmessa e fluorescente, con riprese sequenziali a intervalli desiderati durante il saggio di trattamento. Trattare in successione i film sottili vascolari e muscolari con 50 nanomolar di endotelio per 20 minuti per indurre contrazioni, seguiti da 100 micromolar di HA 10 77 per 30 minuti per indurre rilassamento durante il raffreddamento a temperature inferiori a 32 gradi Celsius.

Piam si dissolve rilasciando i sottili film muscolari vascolari. La misurazione della lunghezza della proiezione può essere convertita in un raggio di curvatura, utilizzato per calcolare lo sforzo medio nello strato cellulare sul film, mostrato qui nelle immagini in luce trasmessa sequenziale di un saggio rappresentativo di contrattilità. Queste immagini possono essere convertite in valori di sforzo dai quali vengono calcolati il tono basale e la contrattilità indotta.

In questo video viene mostrato un esempio rappresentativo di time-lapse relativo a un saggio completo di contrattilità. I film sottili muscolari raggiungono l'equilibrio contrattile, quindi si contraggono ulteriormente dopo l'aggiunta di 50 nM di endotelina. Un film si rilassa dopo l'aggiunta di 100 µM di HA-1077.

Il leggero calo del tono basale e della contrattilità del tessuto alla fine del saggio è probabilmente il risultato diretto della ridotta quantità di cellule che compongono il tessuto. Poiché le cellule muscolari lisce vascolari sottoposte a privazione di siero non proliferano, qui vengono mostrate immagini a contrasto di fase di cellule muscolari lisce coltivate su superfici modificate con genina, a diversi tempi di sacrificio che vanno da un giorno a due settimane. L'immunohistochimica è stata utilizzata per evidenziare la confluenza e l'allineamento cellulare dei tessuti, colorando i filamenti di actina F, in verde, dopo uno, quattro e sette giorni di privazione di siero.

La valutazione quantitativa della confluenza del tessuto durante questo intervallo di tempo ha mostrato un deterioramento minimo su queste superfici. L'allineamento dei filamenti di actina F è stato quantificato ed è stato confermato che l'allineamento è stato mantenuto per due settimane. In coltura, una volta padroneggiata questa tecnica di fabbricazione del tessuto in vitro, essa può essere eseguita in due giorni.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di iniziare la deposizione microfluidica un giorno prima della semina cellulare prevista e di mantenere una temperatura fisiologica costante durante gli esperimenti con film sottili. Seguendo questo protocollo, è possibile applicare metodi tradizionali di biochimica come il Western blot e la PCR per studiare le variazioni nell'espressione proteica e genica, al fine di correlare il fenotipo cellulare con il comportamento funzionale. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per esplorare l'evoluzione di disfunzioni vascolari a sviluppo lento, come vasospasmo cerebrale, ipertensione e aterosclerosi, nonché modelli in vitro della parete arteriosa umana.