Cellule T Capture batteri da Transinfection da cellule dendritiche

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare la transinfezione di cellule T CD4+ da parte di batteri, utilizzando un modello di cellule murine. In vivo, alcuni batteri patogeni come Listeria monocytogenes e Salmonella enteritidis sono in grado di infettare i linfociti T e modificarne il comportamento. Tuttavia, in vitro, le cellule T non sono facili da infettare.

In base a questa osservazione, abbiamo indagato se le cellule T possano catturare batteri da cellule dendritiche infette durante la presentazione dell'antigene, come avviene nelle infezioni virali. Abbiamo scoperto che le cellule T catturano i batteri e successivamente li uccidono. In effetti, abbiamo osservato che le cellule T eseguono questo processo in modo più efficiente rispetto ai fagociti professionali.

Questi risultati contraddicono un principio fondamentale dell'immunologia, dimostrando che cellule dell'immunità adattativa possono svolgere funzioni ritenute esclusive dell'immunità innata. Oggi presentiamo il protocollo utilizzato per studiare il processo di transinfezione batterica in un modello murino. Esteban Veiga e io illustreremo questa procedura insieme a Guillermo Ramirez-Santiago, Raquelle Garcia-Ferreras, due studenti laureati, e Monica Torres-Torresano, una tecnica.

Si noti che tutte le procedure descritte in questo video devono essere eseguite nella cappa, utilizzando esclusivamente mezzi sterili, strumenti, punte di pipetta e piatti di coltura sterili. In una piastra di Petri sterile da 15 centimetri non trattata per coltura di tessuti, aggiungere un microlitro di lipopolisaccaride a una concentrazione di un milligrammo per millilitro alle cellule dendritiche derivate dal midollo osseo di un singolo topo. Incubare le cellule per 24 ore per aumentare l'espressione del complesso maggiore di istocompatibilità di classe II, o MHC II.

Al termine dell'incubazione, eseguire la citometria a flusso per confermare l'espressione di MHC II e la differenziazione. Dopo aver confermato l'espressione di MHC II, come mostrato qui, trasferire le cellule in un tubo sterile in polipropilene da 50 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di PBS contenente 5 millimoli di EDTA, quindi centrifugare le cellule a 600 x g.

Una volta completata la centrifugazione, eseguire un lavaggio risospendendo le cellule in RPMI con FBS al 10%, quindi centrifugare nuovamente. Successivamente, dopo il lavaggio, aggiungere un millilitro di RPMI con FBS al 10% per ogni cinque volte 10 alla sesta cellule dendritiche e pipettare su e giù per risospendere le cellule. Successivamente, dividere le cellule dendritiche risospese in due provette di volume uguale.

A un tubo, aggiungere 10 microgrammi per millilitro di OT-II OVAp. Lasciare l'altro tubo senza trattamento. Fungerà da controllo negativo per il caricamento dell'antigene.

Incubare i tubi per almeno un'ora per caricare le molecole MHC II delle cellule dendritiche con il peptide OVA. Nel frattempo, preparare il *Salmonella enteritidis* per l'infezione lavandolo tre volte con una soluzione di PBS. Centrifugare tra ogni lavaggio a 1800 x g per eliminare il mezzo LB e qualsiasi tossina secreta.

Quindi, risospendere i batteri in RPMI. Dopo l'incubazione, infettare ogni provetta di cellule dendritiche a una multiplicità di infezione, o MOI, di 10 e quindi incubare le cellule per un'ora. Una volta infettate le cellule, lavarle tre volte con PBS e successivamente una volta con RPMI 10%FBS.

Centrifugare tra un lavaggio e l'altro a 450 x g per rimuovere la maggior parte dei batteri extracellulari nel OVAp solubile. Dopo l'ultima centrifugazione, risospendere le cellule in RPMI 10%FBS a una concentrazione di 20 milioni di cellule per millilitro. In una piastra da coltura a 24 pozzetti, aggiungere due milioni di cellule T CD4+ in un volume di 0,5 millilitri in ciascuno dei cinque pozzetti.

Successivamente, per controllare il contatto fisico, posizionare barriere in policarbonato tipo trans-well con un diametro di poro di tre micrometri nelle terza e quarta pozzetta. Alla prima pozzetta, aggiungere 0,1 millilitri di cellule dendritiche sovraccariche infette. Alla seconda pozzetta, aggiungere 0,1 millilitri di cellule dendritiche non cariche infette.

Aggiungere 0,1 millilitri di cellule dendritiche infette sovraccariche in un pozzetto e 0,1 millilitri di cellule dendritiche infette non cariche nell'altro pozzetto. Infine, come controllo negativo, infettare direttamente il quinto pozzetto di cellule T CD4+ a un MOI di 10. Successivamente, portare il volume totale del pozzetto a 0,6 millilitri con RPMI.

Incubare la piastra per 30 minuti per consentire la formazione delle sinapsi immunitarie. Al termine dell'incubazione, aggiungere 100 microgrammi di Gentamicina per millilitro di mezzo in ogni pozzetto e incubare per un'ora. La Gentamicina è un antibiotico aminoglicoside che non è in grado di penetrare nelle cellule eucariotiche.

Pertanto, in questo passaggio, l'amminoglicoside ucciderà i batteri extracellulari ma non quelli intracellulari. Dopo l'incubazione, raccogliere le cellule non aderenti in provette da 15 millilitri e risospendere in 10 millilitri di tampone PBS BSA EDTA. Scartare la piastra di coltura in plastica a cui rimangono attaccate la maggior parte delle cellule dendritiche.

Successivamente, agitare delicatamente i tubi al vortex per assicurare la disgregazione cellulare. Centrifugare i tubi a 600 x g. Poi, da qualsiasi tubo, aspirare 500 microlitri del sopranatante cellulare e trasferirlo con una pipetta in un nuovo tubo.

Questo verrà utilizzato come controllo per dimostrare che il trattamento con gentamicina è stato efficace. Posizionare tutti i campioni sul ghiaccio. A questo punto, ci sono sei provette: quattro provette di campioni in esame e due controlli.

Sebbene la maggior parte delle cellule dendritiche sia stata scartata con la piastra, i campioni che non sono stati separati dai diaframmi trans-well potrebbero comunque contenerne alcune. Per ridurre la contaminazione, utilizzare l'isolamento cellulare magnetico o il sorting cellulare per re-isolare le cellule T CD4+ dai campioni che non sono stati separati dai diaframmi trans-well. L'isolato finale dovrebbe contenere meno del 2% di cellule dendritiche.

Mantenere il resto dei campioni sul ghiaccio. Una volta che le cellule T CD4+ sono state purificate, è il momento di valutare l'infezione da batteri della classe. Questo può essere fatto eseguendo conte colonie o mediante citometria a flusso.

Qui, vi mostreremo come eseguire il conteggio delle colonie. Lavare le cellule T CD4+ transinfettate due volte con PBS. Centrifugare a 600 x g tra un lavaggio e l'altro.

Quindi conta le cellule e sospendile in PBS a una concentrazione di due per 10 alla sesta cellule per millilitro. Aggiungi a 500 microlitri di cellule T 500 microlitri di Triton X-100 allo 0,1% per lisarle. Questo rilascia i batteri intracellulari dalle cellule T.

Per ogni campione di cellule lisate, preparare tre diluizioni seriali. Quindi, dividere una piastra in agar LB in quattro parti e distribuire 50 microlitri di ciascuna diluizione, inclusa la sospensione non diluita, su ciascuna sezione della piastra. Su una piastra in agar LB separata, distribuire il sopranatante cellulare conservato come controllo dell'efficacia della gentamicina.

Quindi, su un'altra piastra, distribuire le cellule T infette direttamente come ulteriore controllo. Incubare durante la notte. Il giorno successivo, contare le colonie in ogni settore della piastra e calcolare il numero di unità formanti colonie per ogni campione.

Se si verifica una contaminazione da cellule dendritiche a basso livello, definita come inferiore al 2%, sottrarre le unità formanti colonie corrispondenti alla bassa contaminazione da cellule dendritiche. L'infezione trasmissiva dei linfociti T è stata eseguita utilizzando Salmonella enteritidis e quantificata mediante saggio di sopravvivenza alla gentamicina come descritto in questo video. Quando i linfociti T infettati direttamente sono stati seminati, come mostrato a sinistra, non è stata osservata crescita di colonie, indicando che i linfociti T sono refrattari alle infezioni batteriche dirette.

Quando il soprannatante proveniente dai saggi di trasinfezione è stato seminato, come mostrato a destra, non sono state osservate colonie, indicando che la gentamicina ha funzionato correttamente. Qui sono mostrati i risultati dei saggi di trasinfezione eseguiti in presenza di barriere trans-well. Sono osservate solo tre colonie nella sospensione non diluita sia nei campioni caricati con OVA che in quelli non caricati.

Al contrario, numerose colonie sono osservate quando vi è un contatto diretto tra linfociti T e cellule dendritiche infette. Inoltre, quando cellule dendritiche caricate con OVAp sono state incubate con linfociti T, l'assorbimento dei batteri è aumentato di circa cinque volte. Nel complesso, questi dati indicano che il contatto diretto tra cellule dendritiche infette e linfociti T facilita l'assorbimento batterico e che la transinfezione cellulare è potenziata durante il riconoscimento dell'antigene.

Dopo questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare la transinfezione utilizzando cellule T marine. Il vantaggio della quantificazione della transinfezione con il saggio di sopravvivenza alla gentamicina è l'elevata sensibilità. Siamo in grado di rilevare un singolo batterio infettivo.

È importante ricordare che il passaggio di purificazione di questa procedura è critico. La purezza deve essere molto elevata se si utilizzano i conteggi di colonie per determinare la percentuale di trasinfettività. La quantificazione mediante citometria a flusso non presenta questo limite, poiché è possibile distinguere facilmente le cellule dendritiche dalle cellule T, ma la limitazione consiste nel fatto che i batteri esprimenti GFP devono essere sufficientemente luminosi da permettere di rilevare le cellule infette rispetto allo sfondo di fluorescenza esterno.

Ricordare che il lavoro con agenti patogeni può essere estremamente pericoloso e che le opportune precauzioni di sicurezza devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.