Determinazione della ossidazione degli acidi grassi e la lipogenesi nel topo primaria Epatociti

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare il metabolismo degli acidi grassi negli epatociti primari di topo. Ciò si ottiene prima perfondendo un fegato di topo con digestione, mezzo, rimuovendolo e quindi isolando gli epatociti. Il secondo passo consiste nel coltivare gli epatociti su piastre rivestite di collagene.

Successivamente, gli epatociti vengono trattati con gli interventi sperimentali da testare. Il passaggio finale consiste nell'incubare le cellule in presenza di un substrato radiomarcato. In definitiva, l'analisi a scintillazione liquida viene utilizzata per mostrare gli effetti di vari interventi farmacologici o genetici sull'ossidazione degli acidi grassi o sulla lipogenesi negli epatociti primari.

Questo metodo può aiutare a rispondere a diverse domande chiave nel campo del metabolismo e del diabete, incluso il modo in cui specifici interventi farmacologici e genetici influenzano la biologia degli epatociti. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per due motivi. Uno, le condizioni di perfusione specifiche che influenzano la salute degli epatociti sono difficili da ottenere e due, la quantificazione del rilascio di anidride carbonica.

Il gas non è intuitivo. A dimostrare questa procedura sarà Tom Akey, uno studente laureato del mio laboratorio. Impostare la pompa peristaltica posizionando un'estremità del tubo sterile nella perfusione epatica preriscaldata, nel terreno e l'altra in un contenitore per rifiuti.

Far funzionare la pompa fino a riempire l'intera lunghezza del tubo con il fluido. Dopo il sacrificio di un topo di interesse, spruzzare abbondantemente l'addome del topo con etanolo al 70%. Quindi usa le forbici smussate per praticare un'incisione sulla linea mediana attraverso il derma, la lunghezza dell'addome e riflettere lateralmente.

Fai un'incisione simile nel peritoneo per esporre i visceri. Usando uno strumento contundente, sposta delicatamente l'intestino. Per esporre il sistema vascolare addominale, individuare la vena cava addominale inferiore e posizionare una sutura sotto il vaso sanguigno distalmente alla vena renale, distalmente alla sutura.

Posizionare un ago e un catetere nella vena cava inferiore e farla avanzare oltre la sutura. Con l'ago ancora in posizione, legare la sutura attorno al catetere per tenerlo in posizione, quindi rimuovere con cura l'ago. Se fatto correttamente, il sangue scorrerà attraverso il catetere utilizzando una pipetta.

Riempire l'area rimanente del catetere con il mezzo di perfusione e assicurarsi che non sia presente aria. Quindi, con grande cura, collegare il tubo al catetere. Successivamente, perforare con cura il diaframma con forbici a punta affilata e praticare un'incisione laterale per esporre la cavità pleurica.

Facendo attenzione a evitare la cistifellea e la vascolarizzazione pleurica, posizionare un morsetto per bulldog attorno alla vena cava inferiore del torace appena prossimale alla vena epatica. Quindi tagliare la vena porta e accendere la pompa a tre o quattro millilitri al minuto. Perfondere il fegato con il terreno di perfusione epatica per cinque minuti utilizzando circa 20 millilitri di terreno di perfusione.

Durante questo periodo, osserva l'immediato cambiamento di colore del fegato dal rosso al grigio marrone chiaro. Se parti del fegato rimangono rosse, questo like indica una scarsa perfusione e la probabilità di successo dell'isolamento è notevolmente diminuita. Dopo la perfusione di cinque minuti, arrestare la pompa e trasferire il tubo nel mezzo di digestione del fegato.

Riavvia la pompa e perfondi il fegato per altri 10-15 minuti. A tre o quattro millilitri al minuto fino all'esaurimento del fluido. Al termine della perfusione, arrestare la pompa.

Il fegato dovrebbe avere una tonalità rosata e apparire un po' ingrandito. A questo punto, asportare il fegato mediante un'attenta dissezione. Trasferire in una piastra di coltura tissutale da 10 centimetri e rimuovere la cistifellea.

Quindi, aggiungi 10 millilitri di terreno di placcatura al fegato e inizia a raschiare delicatamente il fegato usando un bisturi. Per rimuovere gli epatociti, filtrare la sospensione con un colino cellulare da 100 micron e trasferirla in una provetta conica da 50 millilitri. Lavare la piastra con altri 10 millilitri di mezzo di placcatura e tirare il liquido nel tubo conico da 50 millilitri.

Quindi pellettare le celle a quattro gradi Celsius, centrifusion per cinque minuti A 350 Gs, aspirare il mezzo e risospendere il pellet di cella in 10 millilitri di terreno di placcatura. Quindi, aggiungere 10 millilitri di silice colloidale al 90% rivestita con polivinilperone miscelato delicatamente, quindi pellettare le celle come prima. Dopo la centrifugazione, aspirare lo strato di cellule morte che galleggiano sulla parte superiore della miscela.

Quindi lavare due volte le celle pellettate vive con 20 millilitri di placcatura. Produzione media. Sospendere il pellet cellulare finale in 10 millilitri di terreno di placcatura e contare le cellule utilizzando un emocitometro, posizionare 90.000 cellule per pozzetto in piastre di coltura a 24 pozzetti rivestite di collagene, incubare le piastre a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per due ore, da 16 a 20 ore prima di iniziare il saggio.

Lavare le cellule due volte con PBS caldo e cambiare le cellule in siero senza siero. Medium con 20 nanomoli di glucagone. Incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica la mattina del test.

Preparare il terreno di pre-incubazione e poi sostituire il siero per fame. Terreno per il terreno di pre-incubazione. Incubare le cellule in questa miscela a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per due ore durante l'incubazione.

Essiccare 0,5 micro curie per pozzetto di C 14 palmitato facendo evaporare il solvente etanolo sotto azoto circa 15 minuti prima della fine dell'incubazione, risospendere il C 14 palmitato a 12,5 microlitri per micro curie in 0,1. Idrossido di sodio normale incubare la miscela a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi aggiungere tre volumi di preincubazione calda, terreno e mescolare pipettando su e giù.

Versare ogni pozzetto con 25 microlitri di miscela diluita di palmitato C 14 facendo oscillare delicatamente la piastra e incubare a 37 gradi Celsius per 90 minuti. Questa è la piastra di analisi Durante l'incubazione, rimuovere il coperchio da una piastra sterile a 24 pozzetti e posizionare un pezzo di carta da filtro di due centimetri per due centimetri sul fondo di ciascuno dei pozzetti. Quindi sovrapporre la piastra con un pezzo di param che misura quattro pollici per sette pollici utilizzando un grande oggetto rettangolare come una scatola per puntali per micropipetter.

Strofinare la paraforma sui pozzetti per perforare la paraforma alle aperture dei pozzetti e creare una tenuta sul resto della piastra. Quindi rimuovere i cerchi forati di profumo. Ora coprendo i pozzetti 10 minuti prima della fine dell'incubazione, aggiungere 200 microlitri di idrossido di sodio normale a ciascun pozzetto della piastra di carta da filtro, assicurandosi che la carta da filtro assorba tutto il liquido.

Al termine dell'incubazione, congelare la piastra di saggio in azoto liquido. Quindi, aggiungere 100 microlitri di acido calorico al 70% in ciascun pozzetto della piastra di analisi. Coprire immediatamente con una piastra di carta da filtro e posizionare le piastre su uno shaker orbitale.

Far oscillare le piastre a una velocità orbitale di 80 giri/min a temperatura ambiente per due ore. Quindi misurare la frazione di anidride carbonica trasferendo i quadrati di carta da filtro in quattro millilitri di fluido di scintillazione liquido in fiale di scintillazione e misurare il segnale C 14 su un contatore di scintillazione per misurare il materiale solubile in acido. Trasferire 400 microlitri di terreno in una centrifuga per provette micro fuge da 1,5 millilitri alla massima velocità per 10 minuti, quindi aggiungere 100 microlitri del surnatante risultante a 500 microlitri di una miscela due a uno di cloroformio e metanolo.

Agitare brevemente la miscela e poi aggiungere 250 microlitri di acqua alla miscela e vortice. Ancora una volta, centrifugare i campioni per 10 minuti a migliaia di Gs.Quindi trasferire 200 microlitri della fase superiore a quattro millilitri di liquido di scintillazione in una fiala di scintillazione e misurare il segnale C 14 dopo la fame di siero delle cellule. Trasformare le cellule in terreno di lipogenesi.

Aggiungere tutti i composti di interesse da testare, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per due ore dopo il periodo di incubazione. Lavare le cellule due volte con PBS prima di lisare le cellule aggiungendo 120 microlitri di acido cloridrico normale 0,1. Per ciascuno, raschiare bene i pozzetti per rilasciare il lisato e poi pipettare 100 microlitri di lisato in una provetta micro fuge da 1,5 millilitri.

Quindi, aggiungi 500 microlitri di una miscela due a uno di cloroformio e metanolo in ogni tubo. Agitare brevemente, quindi incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo l'incubazione a 250 microlitri di vortice d'acqua, quindi incubare il campione per altri cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi centrifugare i campioni per 10 minuti a 3000 Gs.Trasferire con cura la fase inferiore del liquido separato in quattro millilitri di liquido di scintillazione in una fiala di scintillazione e misurare l'attività del trizio utilizzando un contatore di scintillazione. Questa procedura comporta in genere l'isolamento di 10-30 milioni di epatociti per topo. Dopo l'incubazione notturna, le cellule sane appaiono esagonali, molte delle quali saranno nucleate.

Le colture malsane spesso contengono granulazioni o bolle, che sono indicative della morte cellulare. I risultati di un saggio di ossidazione degli acidi grassi sono mostrati qui in cui l'aggiunta del promotore della respirazione cellulare F-C-C-P-A e dell'oligomicina, un inibitore della respirazione, sono stati confrontati con un controllo del veicolo per misurare l'ossidazione completa. Viene calcolato il rapporto tra anidride carbonica e materiale solubile in acido.

Le sostanze che promuovono la respirazione cellulare come l'FCCP sposteranno questo rapporto verso l'anidride carbonica, indicando una maggiore ossidazione attraverso il TC. Un ciclo di inibitori della catena respiratoria diminuirà l'ossidazione nel complesso quando misurato. Per quanto riguarda l'attività della lipo, i composti che aumentano l'ossidazione degli acidi grassi come l'FCCP o diminuiscono la sintesi di TP, come l'oligomicina, ridurranno l'attività della lipo negli epatociti in coltura rispetto ai controlli del veicolo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi che la profusione avvenga completamente e in modo tempestivo dopo il sacrificio animale.

Inoltre, durante il saggio di ossidazione degli acidi grassi, il congelamento completo del terreno è fondamentale per misure riproducibili dell'anidride carbonica gassosa. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare gli epatociti primari e utilizzare queste cellule per analizzare l'ossidazione degli acidi grassi e la lipogenesi in vitro.