Name: Lesaurimento selettiva di microglia da cerebellare granuli colture cellulari Utilizzando L-leucina estere metilico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Scopri come eliminare selettivamente le cellule microgliali dalle colture di cellule granulari cerebellari utilizzando l'estere metilico della L-leucina. Questo metodo consente di studiare le interazioni neuronali in assenza di microglia.

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Questa ricerca è stata supportata da una borsa di studio Aims2Cure, Regno Unito e da una borsa di dottorato UCL Impact Award per JMP e da una borsa di dottorato MRC per lo sviluppo delle capacità in Demenza presso JMP.

Tutti gli esperimenti qui descritti sono stati eseguiti in conformità alle Regno Unito Animali (Procedure Scientifiche) Act del 1986. 1. Preparazione degli strumenti, terreni di coltura, e piatti <ol><li> Preparare due forbici laboratorio in acciaio inox di dissezione e due pinze da laboratorio in acciaio inox. Autoclavare tutti gli strumenti e posto in una cappa di coltura O / N sotto luce (UV) ultravioletta per la sterilizzazione. </li><li> Fate 500 ml di mezzi essenziali (MEM) terreno minimo cultura (10% fetale Bovine Serum [FBS], 20 mM KCl, 25 NaHCO mm 3, 30 mm D-glucosio, 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 6 mg / ml di ampicillina) e filtro sterilizzare. Conservare a 4 ° C per mesi. </li><li> Preparare 24 piastre di coltura e contenenti 14 mm, numero 1 coprioggetto spessore. Autoclave i coprioggetti e cappotto a 100 mg / L poli-d-lisina (PDL) come descritto in precedenza 3. Luce UV sterilizzare O / N. </li></ol> 2. Preparazione di CGC Cultura Solutions <ol><li> Preparare &#39;soluzione A&#39; (100 ml) in autoclave, luce UV trattato, dH 2 O sterile contiene 250 mg di glucosio, 300 mg di albumina sierica bovina [ASC], 955 mg di tampone fosfato [PBS] (Ca 2+ e Mg + free), e 1 ml di 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O. </li><li> Preparare &#39;soluzione B&#39; (10 ml) contenente 1 ml di 5 mg / ml di tripsina diluito in 9 ml di soluzione A. </li><li> Preparare &#39;soluzione C&#39; (10 ml) contenente 1.000 unità DNasi, 0,5 mg di inibitore della tripsina di soia, 100 ml di 3,8% MgSO4 · 7H 2 O, diluita a 10 ml con soluzione A. </li><li> Preparare &#39;soluzione D&#39; (20 ml) contenente 3,2 ml di soluzione C, diluita a 20 ml con soluzione A. </li><li> Preparare la soluzione BSA / Earle soluzione salina bilanciata (EBSS) contenente EBSS, 25 NaHCO mm 3, 3 MgSO mm 4 · 7H 2 O, e4% BSA, pH 7,4, come precedentemente descritto 3. </li><li> Preparare LME aggiungendo puro LME in 5 ml di terreno di coltura MEM per dare una concentrazione finale di 150 mM LME, riportare la soluzione a pH 7,4 utilizzando un pHmetro da banco, e filtro sterilizzare utilizzando un polietere solfone 28 mm (PES) 0,2 micron siringa filtro. </li></ol> 3. La coltura le CGC <ol><li> Raccogliere cerebella 4-7 giorni vecchi cuccioli di ratto come descritto in precedenza 3. Mettere subito in piastra Petri contenente 5 ml di soluzione A su ghiaccio. </li><li> Eliminare la soluzione in eccesso da cerebella e luogo del tessuto nel coperchio piastra di Petri. </li><li> Tagliare il tessuto finemente con una lama di rasoio ben fiammato-in almeno tre diverse direzioni. </li><li> Aggiungi il tessuto tagliato a soluzione B (lavare capsula di Petri con una soluzione per garantire il tessuto limitata è perso), e posto in bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 5 minuti. Agitare delicatamente ogni paio di minuti. </li><li> Aggiungere la soluzione D (20 ml) al tubo di neutralizzare la tripsina, scossa e centrifuge a 65 xg per 5 min. </li><li> Eliminare il surnatante. </li><li> Risospendere in 4 ml di soluzione C. Triturare anche (circa 10 volte ciascuna) con tre pipette di vetro fiammati di diametro decrescente, fino a quando la sospensione è più possibile uniforme. </li><li> Lentamente e delicatamente aggiungere qualche goccia di questo omogenato in cima alla BSA / EBSS. Se inizia ad affondare attraverso la BSA / EBSS, triturare più e / o aggiungere un po &#39;di soluzione più C. L&#39;omogeneizzato dovrebbe sedersi in uno strato sopra l&#39;BSA / EBSS. Non agitare. Spin a 100 g per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere pellet (soft) in 1 ml di MEM. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro e piastra a 800.000 cellule / vetrino in 500 ml di MEM. Inserire in termostato a 37 ° C con il 6% di CO 2. </li><li> Cambiare il medio il giorno seguente (24-36 ore dopo la preparazione). Fare una soluzione di MEM contenente 10 mM del ciclo cellulare inibitore arabinofuranosil citidina (AraC). <ol><li> Per ciascunovetrino, conservano 250 microlitri del vecchio medium in 24 pozzetti fresco, aspirare il resto, aggiungere 250 ml di normale media MEM e aspirare questo per lavare le cellule, poi aggiungete 250 ml di vecchio schienale medio alle cellule e rabboccare con 250 ml di medio-AraC contenenti. Nota: Le celle possono essere utilizzati da 6 giorni in vitro (DIV). </li></ol></li></ol> 4. selettivamente L&#39;esaurimento della microglia (eseguiti a 6 DIV) <ol><li> Aggiungere LME puro a 5 ml di un&#39;aliquota separata di MEM per dare una concentrazione finale di 150 mM LME. </li><li> Riportare la soluzione a pH 7,4 e filtro sterilizzare con un solfone polietere 28 mm (PSE) filtro da 0,2 micron siringa. </li><li> Diluire soluzione ad una concentrazione di 50 mM (2 x LME) in terreno MEM e posto in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 10 min con mezzo normale MEM per colture di controllo. </li><li> Rimuovere la metà (250 ml) il terreno MEM dalle culture CGC e mantenere a 37 ° C. </li><li> Cellule Treatcon MEM terreno contenente 2 x LME (250 microlitri), cioè diluito 1: 1 dando una concentrazione di ben 25 mM, o con pre-riscaldato mezzo MEM senza LME (250 microlitri) per colture di controllo. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in atmosfera umidificata con il 6% di CO 2 per 1 ora. </li><li> Lavare le cellule due volte a fresco preriscaldato medio MEM per rimuovere LME contenenti supporti, e quindi sostituire il terreno di coltura conservato e un uguale volume di fresco pre-riscaldato medio MEM per rispettivi pozzetti. </li><li> Culture Ritorna alla incubatrice (inumidito con 6% di CO 2 a 37 ° C) e lasciare riposare per 24 ore prima di ogni ulteriore trattamento. </li></ol>

<ol><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+remarkable%2C+yet+not+extraordinary%2C+human+brain+as+a+scaled-up+primate+brain+and+its+associated+cost%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost.</a> PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).</li>
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<li>Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+release+activators+of+neuronal+proliferation+mediated+by+activation+of+mitogen-activated+protein+kinase%2C+phosphatidylinositol-3-kinase%2FAkt+and+delta-Notch+signalling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades.</a> J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).</li>
<li>Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+establish+microglia-free+astrocyte+cultures%3A+comparison+of+matrix+metalloproteinase+expression+profiles+in+pure+cultures+of+astrocytes+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia.</a> Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).</li>
<li>Kumamaru, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+clodronate+selectively+eliminates+microglia+from+primary+astrocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures.</a> J Neuroinflamm. 9, 116(2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

I passi più importanti per assicurare l&#39;eliminazione selettiva di successo di microglia da CGC e / o colture miste sono: 1) il mantenimento di una cultura CGC sterile e sano; 2) filtro sterilizzante medio LME contenente e ritornando la soluzione a pH 7,4; 3) mantenere i media CGC conservati e LME contenenti supporti a 37 ° C per evitare lo shock termico; e 4) che lavorano rapidamente per ridurre il tempo di cellule sono tenuti all&#39;esterno dell&#39;incubatrice. Abbiamo us...

Il cervello umano è composto una stima di 85 miliardi di neuroni e un ulteriore 85 miliardi di cellule non neuronali tra cui glia 1. Per la maggior parte degli ultimi 100 anni i neuroscienziati si sono concentrati prevalentemente sulla popolazione delle cellule neuronali, cellule gliali credendo di essere poco più di cellule di supporto passivi che hanno fornito supporto strutturale per i neuroni - da qui l&#39;etimologia greca del &#39;glia&#39; tradotto in inglese come &#39;colla&#39;. Recentemente, tuttavia, è diventato sempre più evidente che le interazioni neuronali gliali possono essere molto più fondamentale per aspetti fondamentali della neurobiologia, neurofisiologia, e la genesi e progressione di molte malattie neurodegenerative. Cellule cerebellari granulari (CGC), il più abbondante popolazione neuronale omogenea nel cervello umano, dominano il cervelletto e costituiscono oltre il 90% dei suoi componenti cellulari. Di conseguenza, queste cellule sono stati ampiamente utilizzati in vitro come sistema modello per tegli studio dello sviluppo neuronale, funzione e patologia 2-6. Tuttavia, le culture CGC contengono ancora microglia e glia altri in proporzioni probabilmente significativi. Di conseguenza, i dati che mostrano CGC putatively risposte neuronali scalo a trattamenti con le cellule differenti possono infatti insorgere - in tutto o in parte - dalla risposta secondario indiretta della vicina glia nella cultura. Per valutare questo, abbiamo selettivamente eliminato microglia da colture neuronali CGC con l&#39;ausilio di estere metilico L-leucina (LME). LME è un agente lysomotropic originariamente utilizzato per distruggere selettivamente macrofagi 7, e da allora è stato usato per esaurire anche selettivamente microglia da neurale, astrociti, e le culture gliali miste 8,9,10. LME è interiorizzato da macrofagi e microglia, in cui esso provoca un&#39;interruzione lisosomiale e la successiva apoptosi 13,14. Macrofagi e microglia sono caratteristicamente ricchi di lisosomi, causando loro di essere particularly vulnerabile in seguito all&#39;esposizione al trattamento LME. Questo protocollo fornisce un modo potente, ma semplice e facile stabilire il contributo della microglia in esperimenti utilizzando altri sistemi di coltura gliali / neuronali CGC e.

<table><tbody><tr><td>Pinze&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td>L'estremità curva facilita la rimozione del cervelletto&nbsp;</td></tr><tr><td>Forbici per micro-dissezione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146</td><td>La punta diritta e affilata facilita la dissezione del roditore P4-7&nbsp;</td></tr><tr><td>L-leucina metil estere cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7517-19-3</td><td></td></tr><tr><td>EBSS soluzione&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7510-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27964-99-4</td><td>Coprioggetti 1 giorno prima dell'uso&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DNasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina di soia&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6414</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-ED1 per topo&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab31630</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;esaurimento selettiva di microglia da cerebellare granuli colture cellulari utilizzando l-leucina estere metilico

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Le microglia, le cellule immunocompetenti residenti del SNC, svolgono un ruolo multiforme nella modulazione e nel controllo della funzione neuronale, oltre a mediare l'immunità innata. I modelli primari di colture cellulari di roditori hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione delle interazioni neuronali-gliali, ma solo di recente sono stati utilizzati metodi per eliminare specificamente la microglia da colture miste. Una di queste tecniche – qui descritta – è l'uso dell'estere metilico di L-leucina, un agente lisomotropo che viene internalizzato dai macrofagi e dalla microglia, in cui provoca l'interruzione lisosomiale e la successiva apoptosi13,14. Gli esperimenti che utilizzano l'estere metilico di L-leucina hanno il potere di identificare il contributo della microglia all'ambiente cellulare circostante in diverse condizioni di coltura. Utilizzando un protocollo ottimizzato nel nostro laboratorio, descriviamo come eliminare la microglia dalla coltura cellulare di granuli cerebellari di roditori P5. Questo approccio consente di valutare l'impatto relativo delle microglia sui dati sperimentali, nonché di determinare se le microglia svolgono un ruolo neuroprotettivo o neurotossico nei modelli di coltura di condizioni neurologiche, come l'ictus, l'Alzheimer o il morbo di Parkinson.

La capacità di questa tecnica per eliminare selettivamente microglia da CGC e / o colture miste si basa sulla successiva capacità del ricercatore di identificare accuratamente e differenziare microglia dalle celle circostanti. Ciò può essere ottenuto usando una macchina per cella specifica-microglia, come isolectin-B4, come illustrato in figura 1. Come mostrato nella Figura 2, nessun cambiamento osservabile astrociti e la densità neuronale e morfologia sono stati registrati con riferime...

Le microglia possono influenzare i neuroni e altre gliali in coltura attraverso vari meccanismi autonomi non cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per esaurire selettivamente le microglia da colture neuronali primarie. Questo metodo ha il potenziale per chiarire il ruolo delle interazioni microgliali-neuronali, con implicazioni per le condizioni neurodegenerative in cui la neuroinfiammazione è una caratteristica distintiva.

L&#39;esaurimento selettiva di microglia da cerebellare granuli colture cellulari Utilizzando L-leucina estere metilico

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eliminare selettivamente le cellule microgliali dalle colture di cellule granulari. Questo risultato si ottiene innanzitutto coltivando una popolazione di cgc e conservandola in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 6% di anidride carbonica. Il secondo passaggio consiste nel preparare una soluzione di LME nel mezzo MEM per ottenere una concentrazione finale di 150 millimolare di LME.La metà successiva del mezzo MEM proveniente dalle colture di CGC viene rimossa e mantenuta nell'incubatore, quindi le colture di CGC vengono sostituite con un volume equivalente di LME contenente mezzo MEM e collocate nell'incubatore a 37 gradi Celsius con il 6% di anidride carbonica per un'ora. L'ultimo passaggio consiste nel lavare le colture di CGC due volte con mezzo MEM fresco preriscaldato.Sostituire il mezzo di coltura conservato con un volume uguale di mezzo fresco, quindi reinserire le cellule nell'incubatore per 24 ore prima di qualsiasi ulteriore trattamento. Infine, l'immunochimica e la microscopia a fluorescenza vengono utilizzate per dimostrare la deplezione specifica delle cellule microgliali dalle colture di cellule granulari cerebellari. Qu

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Il video dimostra una tecnica per isolare la microglia dalla corteccia del cervello di un topo adulto. In primo luogo, la corteccia subisce la segmentazione e l'omogeneizzazione per rimuovere i neuroni e altre cellule gliali, preservando la microglia. Successivamente, la sospensione cellulare viene esposta a microsfere magnetiche anti-mielina e a un campo magnetico, separando efficacemente le microglia e le cellule mieloidi dai detriti di mielina e dalle cellule contenenti mielina.

Isolamento della microglia dalla corteccia di un cervello di topo adulto

Questo video dimostra la tecnica per isolare e coltivare i neuroni dei granuli cerebellari primari del topo. Le cellule vengono trattate con un antimetabolita per eliminare le cellule gliali proliferanti e produrre una coltura pura di neuroni granulari cerebellari.

Isolamento e coltura dei neuroni dei granuli cerebellari primari di topo

Questo video dimostra una tecnica per la rimozione selettiva della microglia da una coltura neuronale primaria di ratto. I neuroni dei granuli cerebellari vengono trattati con un antimetabolita per eliminare le cellule gliali proliferanti. Inoltre, vengono trattati con agenti mirati ai lisosomi per esaurire la microglia dalla coltura.

Rimozione selettiva della microglia da una coltura di neuroni di granuli cerebellari di ratto

Questo video dimostra l'isolamento e la coltivazione di cellule progenitrici neurali cerebellari dal cervelletto di un cucciolo di topo. I progenitori dei neuroni dei granuli cerebellari vengono isolati e purificati attraverso l'adesione differenziale, rimuovendo efficacemente gli astrociti. Questi progenitori in coltura si differenziano successivamente in neuroni granulari cerebellari.

Isolamento e coltura di progenitori di neuroni granulari cerebellari murini

Questo video mostra un protocollo per estrarre cellule microgliali da lesioni demielinizzanti nel cervello di topo utilizzando la selezione magnetica delle cellule. Il protocollo prevede la sezionazione del tessuto cerebrale lesionato contenente cellule microgliali, il trattamento del tessuto con enzimi specifici per ottenere una sospensione di una singola cellula e l'utilizzo di microsfere magnetiche specifiche del recettore microgliale per isolare le cellule microgliali.

Isolamento della microglia da lesioni demielinizzanti del cervello di topo mediante smistamento cellulare attivato magneticamente

Questo video delinea la generazione di un modello di lesione neuronale utilizzando specie reattive dell'ossigeno (ROS) nei neuroni primari dei granuli cerebellari di topo. Descrive in dettaglio il processo di induzione dello stress ossidativo aggiungendo alte concentrazioni di perossido di idrogeno. L'esposizione ai ROS provoca rotture del filamento di DNA e instabilità genomica. Inoltre, l'ossidazione delle proteine cellulari ne compromette le funzioni, mentre la perossidazione lipidica...

Modellazione della morte neuronale indotta da specie reattive dell'ossigeno nei neuroni dei granuli cerebellari di topo

Una chiave per il successo indagini di biologia microglia è la conservazione dei immunofunction microglia ex vivo durante l'isolamento dal tessuto del sistema nervoso centrale. Isolare microglia via rotanti risultati si stringono in colture cellulari altamente puri e immunofunctional come valutato da immagini fluorescenti, immunocitochimica, ed ELISA dopo l'attivazione della microglia con il lipopolisaccaride stimoli pro-infiammatori (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento della corticale Microglia con Immunofenotipo conservato e funzionalità dal murini neonati

Questo protocollo descrive come misurare con precisione la vitalità neuronale utilizzando la doppia colorazione di Fluorescein diacetato (FDA) e Propidium Iodide (PI) nei neuroni granulari cerebellari coltivati, una coltura neuronale primaria utilizzata come modello in vitro nella ricerca neuroscienza e neurofarmacologia.

Valutazione della vitalità neuronale utilizzando la fluoresceina diacetato-propidium ioduro a doppia colorazione nel granulo cerebrale Neuron Culture

Questo protocollo descrive un metodo semplice per isolare e neuroni di granulo cerebrale primario del mouse (CGNs) da cuccioli di 6-7 giorno vecchio, trasduzione efficiente di CGNs per la perdita e guadagno di funzione studia, la coltura e la modellazione eccitotossicità neuronale indotta da NMDA, basso-potassio-indotta delle cellule morte, danni al DNA e stress ossidativo utilizzando lo stesso modello di cultura.

Modellazione di morte neuronale e degenerazione in neuroni cerebellari del granello primario del Mouse

Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e purificare la microglia primaria in modelli animali di malattie demielinizzanti, utilizzando lo smistamento cellulare magnetico-attivato colonnare.

Isolamento di microglia primarie di topo mediante smistamento cellulare ad attivazione magnetica in modelli animali di demielinizzazione

Scopri come eliminare selettivamente le cellule microgliali dalle colture di cellule granulari cerebellari utilizzando l'estere metilico della L-leucina. Questo metodo consente di studiare le interazioni neuronali in assenza di microglia.

L'esaurimento selettiva di microglia da cerebellare granuli colture cellulari Utilizzando L-leucina estere metilico

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