Adattamento del processo Electrospinning per fornire tre ambienti unici per un Tri-livello

L'obiettivo generale di questa procedura è elettrofilare un impalcatura tridimensionale bifasica, che consenta la coltura congiunta di cellule umane adulte completamente differenziate al fine di replicare la matrice extracellulare naturale che queste cellule incontrano in C due. Questo risultato si ottiene innanzitutto mediante elettrofilatura di un'impalcatura di microfibre allineate in modo casuale. Il secondo passaggio consiste nel formare un'impalcatura bifasica elettrofilando direttamente sull'impalcatura di microfibre uno strato di nanofibre allineate in modo casuale.

Successivamente, viene elettrofilato un impalcatura separata di nanofibre allineate. L'ultimo passaggio consiste nell'inoculare ciascuna impalcatura con il rispettivo tipo cellulare e nel coltivare insieme le impalcature in un sistema di bioreattore perfuso come un unico costrutto. Infine, le interazioni multiceellulari possono essere analizzate mediante la misurazione del rilascio di mediatori e l'immunomarcatura.

Il costrutto. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le membrane trasformate 2D, è che i supporti elettrici offrono un ambiente fibroso tridimensionale che può essere adattato per fornire una morfologia fisiologicamente rilevante. Si tratta di una struttura più porosa, che permette la coltura centrale di più tipi cellulari.

Questo metodo fornisce una piattaforma stabile che utilizza cellule umane, sane o malate, raggruppate in coorti, come modello in vitro. Ciò contribuirà a ridurre la dipendenza dai modelli animali, i quali presentano limitazioni riguardo alla loro rilevanza per le malattie umane, e a diminuire il numero di animali impiegati negli esperimenti. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su malattie come l'asma e la BPCO, può essere applicato anche ad altri sistemi, ad esempio per lo studio delle malattie infiammatorie dell'intestino o per lo sviluppo di un modello cutaneo destinato ai test chimici.

Per iniziare, preparare tre diverse soluzioni di PET da 10 millilitri sciogliendo l'8%, il 10% e il 30% di PET in miscele uno a uno di clorometano e acido tricloroacetico. Mescolare le soluzioni per tutta la notte a temperatura ambiente per sciogliere il PET; il giorno successivo, trasferire le soluzioni di PET in siringhe e applicare un ago da 23 gauge alla siringa contenente la miscela all'8% e aghi da 18 gauge alle altre due siringhe contenenti le soluzioni di PET al 10% e al 30%.

Preparare il supporto in microfibra. Innanzitutto, inserire la siringa contenente la soluzione di PET al 30% nella pompa per siringhe con la punta dell'ago rivolta verso il basso. Posizionare il tamburo a 15 centimetri dalla punta dell'ago e assicurarsi che l'ago sia puntato al centro del tamburo.

Collegare il cavo di alimentazione positivo alla punta dell'ago utilizzando una clip metallica a coccodrillo e mettere a terra il mandrino collegando il cavo di massa alla presa banana. Accendere il motore e impostare la velocità del mandrino a 60 giri al minuto. Accendere la pompa per siringa per ottenere una portata di 2,0 millilitri all'ora.

Durante la creazione dei supporti in microfibra, lasciare funzionare la pompa fino a quando la soluzione non viene estrusa dalla punta dell'ago, in modo da preparare il sistema rimuovendo l'aria presente nell'ago. Successivamente, arrestare la pompa sulla pompa per siringa.

Impostare il volume totale della soluzione da espellere a due millilitri e avviare la pompa. Successivamente, applicare un potenziale di 14 chilovolt tra l'ago e il mandrino per elettrofilare per un'ora, fino a quando due millilitri della soluzione di PET al 30% sono stati elettrofilati con l'impalcatura di microfibre ancora sul mandrino, quindi spegnere il potenziale elettrico. Rimuovere la clip a coccodrillo e sostituire la siringa contenente la soluzione di PET al 30% con la siringa contenente la soluzione di PET all'8%.

Ricollegare quindi la clip a coccodrillo all'ago da 23 gauge. Modificare la portata della pompa a siringa a 0,5 millilitri all'ora ed eseguire la messa a punto dell'ago azionando la pompa a siringa finché la soluzione non inizia a fuoriuscire dalla punta. Mentre il mandrino continua a ruotare a 60 giri al minuto, applicare una tensione di 14 kilovolt tra la punta dell'ago e il mandrino e impostare il volume totale da erogare dalla pompa a siringa su due millilitri.

Eseguire l'elettrofilatura per quattro ore fino a quando due millilitri della soluzione di PET all'8% sono stati elettrofilati. Al termine dell'elettrofilatura, spegnere l'alimentatore elettrico e il motore che fa ruotare il mandrino. Tagliare la struttura biphasica con una lama lungo la larghezza del mandrino per ottenere un foglio bidimensionale di struttura delle dimensioni della superficie del mandrino.

Per preparare scaffold di PET allineati, caricare la siringa contenente la soluzione di PET al 10% nella pompa per siringa con la punta dell'ago rivolta verso il basso. Quindi collegare il morsetto a coccodrillo all'ago. Impostare la velocità di flusso a 0,5 millilitri all'ora ed eseguire la messa a punto dell'ago con la soluzione di PET.

Quindi accendere il motore e impostare la velocità di rotazione del mandrino a 2000 giri al minuto. Successivamente, accendere la pompa a siringa. Impostare l'alimentazione di tensione a 14 chilovolt e accendere l'alimentazione elettrica per la filatura elettrostatica per quattro ore, fino a quando non sono stati elettrofilati due millilitri di soluzione.

Al termine della filatura elettrostatica, spegnere l'alimentatore e il motore. Tagliare l'impalcatura con una lama lungo la larghezza del mandrino per ottenere un foglio bidimensionale di impalcatura allineato. Conservare le impalcature ottenute mediante filatura elettrostatica in fogli di alluminio per ridurre la carica elettrostatica.

Utilizzare una penna per biopsia con diametro di 0,8 millimetri per prelevare dischi di scaffold bifasici o allineati dai fogli di SPU. Quindi incollare il disco di scaffold bifasico a una guarnizione utilizzando una colla per acquari non tossica. Posizionare le guarnizioni e gli scaffold in una piastra per colture cellulari a 12 pozzetti.

Sterilizzare le guarnizioni e le strutture mediante radiazione ultravioletta di tipo I per 30 minuti su ciascun lato delle strutture. Successivamente, immergere in una soluzione antibiotica antimicotica al 20% per tutta la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Lavare le strutture con PP S per 3 volte e conservare le strutture in PBS a quattro gradi Celsius fino al loro utilizzo.

Trasferire i scaffold bifasici dal PBS in una nuova piastra a 12 pozzetti e riscaldarli in un mezzo DMEM integrato con il 10% di FCS per un'ora a 37 gradi Celsius. Rimuovere il mezzo DMEM integrato e posizionare la fase di microfibra dei scaffold; seminare 15.000 cellule fibroblastiche MRC-5 in 30 microlitri di mezzo DMEM integrato su ciascun scaffold per favorire la penetrazione dei fibroblasti all'interno del scaffold. Posizionare la piastra su un agitatore orbitale e agitare gli scaffold a 100 giri/min per due ore.

Quindi aggiungere due millilitri di terreno DMEM integrato a ciascun scaffold e incubare gli scaffold per tutta la notte a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, rimuovere il terreno dai pozzetti e capovolgere gli scaffold in modo che la fase in nanofibra degli scaffold sia rivolta in senso apicale. Quindi seminare 30.000 cellule epiteliali Cali tre in 30 microlitri di terreno D-M-E-M-F 12 integrato con il 10% di FCS sulla fase in nanofibra dello scaffold.

Incubare l'impalcatura per due ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica prima di immergere le impalcature in una miscela 70 30 di D-M-E-M-F 12 e mezzo integrato DMEM e proseguire con l'incubazione statica per ulteriori 12 ore per coltivare le cellule muscolari lisce delle vie aeree. Trasferire innanzitutto le impalcature allineate dal PBS in una nuova piastra a 12 pozzetti e riscaldarle insieme al mezzo integrato DMEM per un'ora a 37 gradi Celsius. Rimuovere il mezzo integrato DMEM e aggiungere 25.000 cellule muscolari lisce delle vie aeree in 30 microlitri di mezzo integrato DMEM su ciascuna impalcatura, quindi incubare per due ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Dopo il fissaggio, immergere gli scaffold in un mezzo integrato con DMEM. Rimetterli nell'incubatore e lasciarli in overnight prima di allestire una tri-coltura nel bioreattore. Il giorno successivo, posizionare lo scaffold seminato bifasico nella camera del bioreattore con la fase epiteliale rivolta verso l'alto, all'interno della camera.

Quindi posizionare l'impalcatura allineata al di sotto dell'impalcatura bifasica in modo che sia adiacente alla fase di microfibra dell'impalcatura bifasica. Bloccare insieme le due camere del bioreattore. Successivamente, assemblare due circuiti di flusso per perfusione all'interno di un incubatore come descritto nel protocollo testuale allegato e pompare il mezzo nei due circuiti a circa 0,1 millilitri al minuto utilizzando una pompa peristaltica dopo una settimana.

Rimuovere il mezzo dalla camera apicale e proseguire la coltura. Le cellule epiteliali all'interfaccia aria-liquido vengono mantenute per un'ulteriore settimana prima dell'analisi. Dopo due settimane nel biorreattore, l'impalcatura della tricolocultura mostrata qui è stata fissata e sezionata per mostrare i nuclei cellulari distribuiti in tutti e tre gli strati della costruzione; i nuclei cellulari sono stati colorati con DPI e appaiono blu, mentre il materiale dell'impalcatura appare grigio. Qui sono mostrate immagini al microscopio elettronico a scansione di impalcature di nanofibre e microfibre elettrofilate, nonché impalcature allineate, preparate rispettivamente per la semina di cellule epiteliali, fibroblasti e cellule muscolari lisce.

Tutti e tre i tipi cellulari hanno mostrato un aumento della vitalità quando coltivati sui rispettivi scaffold per un periodo di due settimane. Ciascuno di essi ha inoltre continuato ad esprimere proteine specifiche del tipo cellulare al termine del periodo di coltura di due settimane. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di studiare la matrice extracellulare nativa che si sta cercando di ricreare con le fibre elettrofilate.

Le cellule si comporteranno in modo diverso quando si attaccano a diverse topografie 3D. Ad esempio, le cellule epiteliali formeranno una barriera funzionale solo se coltivate su fibre nanometriche. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come costruire un sistema di co-colture multistrato, che può essere utilizzato per lo studio delle interazioni intercellulari in un ambiente di coltura dinamico.

Ricordare che è importante regolare i parametri di elettrofilatura, come la portata e la tensione, in base al polimero e al sistema solvente che si intende utilizzare durante questa procedura. Questo aspetto è cruciale per ottenere le fibre desiderate. Inoltre, ricordare di effettuare l'elettrofilatura all'interno di una cappa o armadio ventilato per consentire l'adeguata estrazione dei solventi.