Adattamento del processo Electrospinning per fornire tre ambienti unici per un Tri-livello In Vitro Modello della parete delle vie aeree

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di elettro-centrifugare un'impalcatura fasica tridimensionale, consentendo la co-coltura di cellule umane adulte completamente differenziate al fine di replicare la matrice extracellulare naturale che queste cellule incontrano in C due. Ciò si ottiene mediante la prima elettrofilatura, un'impalcatura in microfibra allineata in modo casuale. Il secondo passo consiste nel formare un'impalcatura bifasica mediante elettrofilatura di uno strato di nanofibra allineato in modo casuale direttamente sull'impalcatura in microfibra.

Successivamente, un'impalcatura in nanofibra allineata separata viene fatta girare elettronicamente. Il passaggio finale consiste nel seminare ogni impalcatura con il rispettivo tipo di cellula e nel co-coltivare gli scaffold in un sistema di bioreattori a fusione come un unico costrutto. In definitiva, le interazioni multicellulari possono essere analizzate attraverso la misurazione del rilascio del mediatore e l'immunocolorazione.

Il costrutto. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le membrane trasformate in 2D, è che gli scaffold elettrici forniscono un ambiente fibroso 3D che può essere adattato per fornire una morfologia fisiologicamente rilevante. È una struttura più porosa e consente la coltura di base di più tipi di cellule.

Questo metodo fornisce una piattaforma stabile utilizzando cellule umane coorti, malate o sane come modello in vitro. Ciò contribuirà a ridurre la nostra dipendenza dai modelli animali, che hanno una limitazione nella loro rilevanza per le malattie umane e diminuirà il numero di animali utilizzati nella sperimentazione. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su malattie come l'asma e la BPCO, può essere applicato anche ad altri sistemi, ad esempio per lo studio delle malattie infiammatorie dell'intestino o per lo sviluppo di un modello cutaneo per test chimici.

Per iniziare, preparare tre diverse soluzioni da 10 millilitri di PET sciogliendo l'8%10% e il 30% di PET in miscele uno-a-uno di clorometano e acido tricloroacetico. Mescolare le soluzioni per una notte a temperatura ambiente per sciogliere il PET il giorno successivo. Trasferire le soluzioni di PET nelle siringhe e collegare un ago di calibro 23 alla siringa contenente la miscela all'8% e aghi di calibro 18 alle altre due siringhe contenenti le soluzioni di PET al 10% e al 30%.

Preparare l'impalcatura in microfibra. Per prima cosa, caricare la siringa contenente la soluzione di PET al 30% nella pompa a siringa con la punta dell'ago rivolta verso il basso. Posizionare l'ago a 15 centimetri dalla punta dell'ago e assicurarsi che l'ago sia puntato al centro del tamburo.

Collegare la linea di alimentazione elettrica positiva alla punta dell'ago utilizzando una clip a coccodrillo metallica e mettere a terra il manl collegando la linea di terra alla presa a banana. Accendere il motore e impostare la velocità di rotazione su 60 giri/min. Accendere la pompa a siringa per fornire una portata di 2,0 millilitri all'ora.

Durante la creazione delle impalcature in microfibra. Lasciare in funzione la pompa fino a quando la soluzione non viene estrusa dalla punta dell'ago per adescare il sistema rimuovendo l'aria nell'ago. Quindi arrestare la pompa a siringa.

Impostare il volume totale della soluzione da espellere a due millilitri e avviare la pompa. Quindi, applicare un potenziale di 14 kilovolt tra l'ago e l'elettro spin del mandrino per un'ora fino a quando due millilitri della soluzione di PET al 30% sono stati fatti girare con l'impalcatura in microfibra ancora sul mandrino per spegnere il potenziale di tensione. Rimuovere la clip a coccodrillo e sostituire la siringa contenente la soluzione di PET al 30% con la siringa contenente la soluzione di PET all'8%.

Quindi ricollegare la clip a coccodrillo all'ago calibro 23. Modificare la portata della pompa a siringa a 0,5 millilitri all'ora e adescare l'ago facendo funzionare la pompa a siringa fino a quando la soluzione non fuoriesce dalla punta. Con il mandrino che continua a girare a 60 giri/min, applicare il potenziale di 14 kilovolt tra la punta dell'ago e il mandrino e impostare il volume totale che deve essere estruso dalla pompa a siringa su due millilitri.

Elettrocentrifuga per quattro ore fino a quando due millilitri della soluzione di PET all'8% sono stati elettrocentrifugati. Al termine dell'elettrofilatura, spegnere l'alimentazione e far girare il mandrino al motore. Tagliare l'impalcatura bifasica con una lama lungo la larghezza del mandrino per produrre un foglio di impalcatura 2D delle dimensioni della superficie del mandrino.

Per preparare scaffold in PET allineati, caricare la siringa contenente la soluzione di PET al 10% nella pompa a siringa con la punta dell'ago in basso. Quindi collegare la clip a coccodrillo all'ago. Impostare la portata a 0,5 millilitri all'ora e adescare l'ago con una soluzione PET.

Quindi accendere il motore e impostare la velocità di centrifuga del mandrino su 2000 giri/min. Quindi, accendere la pompa a siringa. Impostare la tensione di alimentazione a 14 kilovolt e accendere l'alimentazione elettrocentrifuga per quattro ore fino a quando non sono stati elettrocentrifugati due millilitri di soluzione.

Al termine dell'elettrofilatura, spegnere l'alimentazione e il motore. Tagliare l'impalcatura con una lama lungo la larghezza del mandrino per produrre un foglio di impalcatura 2D allineato. Conservare gli scaffold elettrofilati in un foglio di alluminio per ridurre la carica elettrostatica.

Utilizzare una penna per biopsia di 0,8 millimetri di diametro per perforare dischi di scaffold bifasici o allineati dai fogli SPU. Quindi incollare il disco dell'impalcatura bifasica a una guarnizione utilizzando colla per acquari atossica. Posizionare le guarnizioni e gli scaffold in una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti.

Sterilizzare le guarnizioni e gli scaffold utilizzando la radiazione ultravioletta I per 30 minuti su ciascun lato degli scaffolds. Quindi immergere in una soluzione antimicotica antibiotica al 20% per una notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Lavare i ponteggi con PP S3 volte e conservare i ponteggi in PBS a quattro gradi Celsius fino al momento del loro utilizzo.

Trasferire gli scaffold bifasici dal PBS in una piastra fresca a 12 pozzetti e riscaldarli in terreno DMEM integrato con il 10% di FCS per un'ora a 37 gradi Celsius. Rimuovere il terreno integrato con DMEM e posizionare la fase in microfibra degli scaffold con circa 15.000 MRC di cinque cellule di fibroblasti in 30 microlitri di terreni integrati con DMEM su ciascun scaffold per aiutare i fibroblasti a penetrare nello scaffold. Posizionare la piastra su un agitatore orbitale e agitare gli scaffold a 100 giri/min per due ore.

Quindi aggiungere due millilitri di terreno integrato con DMEM a ciascuna impalcatura e incubare gli scaffold durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, rimuovere il terreno dai pozzetti e capovolgere gli scaffold in modo che la fase di nanofibra degli scaffold sia rivolta apicalmente. Quindi seminare 30.000 cellule epiteliali Cali three in 30 microlitri di terreno D-M-E-M-F 12 integrati con il 10% di FCS sulla fase di nanofibra dell'impalcatura.

Incubare l'impalcatura per due ore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica prima di immergere gli scaffold in una miscela 70 30 di D-M-E-M-F 12 e terreni integrati con DMEM e continuare con l'incubazione statica per altre 12 ore per coltivare le vie aeree. Per prima cosa, trasferire gli scaffold allineati dal PBS in una piastra fresca a 12 pozzetti e riscaldarli e il terreno integrato con DMEM per un'ora a 37 gradi Celsius. Rimuovete il terreno integrato con DMEM e aggiungete 25.000 cellule muscolari lisce delle vie aeree in 30 microlitri di terreno integrato con DMEM a ciascuna impalcatura e incubatele per due ore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.

Una volta fissati, immergere gli scaffold in supporti integrati con DMEM. Rimettili nell'incubatrice e lasciali per una notte prima di allestire una tricoltura nel bioreattore. Il giorno successivo, posizionare l'impalcatura bifasica del seme nella camera del bioreattore con la fase epiteliale rivolta verso l'alto nella camera.

Quindi posizionare l'impalcatura allineata sotto l'impalcatura bifasica in modo che sia adiacente alla fase in microfibra dell'impalcatura bifasica. Bloccare insieme le due camere del bioreattore. Quindi assemblare due circuiti di flusso di perfusione all'interno di un incubatore come descritto nel protocollo di testo allegato e pompare il fluido attorno ai due circuiti a circa 0,1 millilitri al minuto utilizzando una pompa peristaltica dopo una settimana.

Rimuovere il terreno dalla camera apicale e la coltura. Le cellule epiteliali all'interfaccia aria-liquido per un'ulteriore settimana prima dell'analisi dopo due settimane nel bioreattore, l'impalcatura a tre colture mostrata qui è stata fissata e sezionata per mostrare che i nuclei cellulari distribuiti in tutti e tre gli strati dei nuclei cellulari del costrutto sono stati colorati con DPI e appaiono blu dove il materiale dell'impalcatura appare grigio. Ecco le immagini al microscopio elettronico a scansione della microfibra di nanofibra filata con elettroni e degli scaffold allineati che sono stati preparati per la semina rispettivamente di cellule epiteliali, fibroblasti e cellule muscolari lisce.

Tutti e tre i tipi di cellule hanno mostrato un aumento della vitalità quando sono stati coltivati sui loro scaffold individuali per un periodo di due settimane. Ognuno di loro ha anche continuato a esprimere proteine specifiche del tipo di cellula dopo il periodo di coltura di due settimane. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ricercare la matrice extracellulare nativa che si sta cercando di ricreare con le fibre elettroniche.

Le celle A si comportano in modo diverso quando si collegano a diverse topografie 3D. Ad esempio, le cellule epiteliali formeranno una barriera funzionale solo quando coltivate su nanofibre. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire un sistema di co-coltura multistrato, che può essere utilizzato per lo studio delle interazioni intercellulari all'interno di un ambiente di coltura dinamico.

Non dimenticare che è importante adattare i parametri di elettrofilatura, come la portata e la tensione, per adattarli al sistema di polimeri e solventi che si intende utilizzare durante l'esecuzione di questa procedura. Questo è fondamentale per generare le fibre desiderate. Inoltre, ricordarsi di scegliere di girare una cappa o un armadio ventilato per consentire una corretta estrazione dei solventi.