Kupffer isolamento delle cellule di nanoparticelle test di tossicità

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare e purificare la tazza di topo per le cellule in numero elevato per studiare la tossicità delle nanoparticelle. Ciò si ottiene perfondendo i fegati di topo con una soluzione di H-B-S-S-E-G-T-A e un collagene, una soluzione per digerire delicatamente il tessuto epatico. Successivamente le cellule epatiche vengono purificate mediante densità, centrifugazione e adesione selettiva per ottenere una coltura di coppa purificata per cellule.

Quindi viene eseguita l'analisi della citometria a flusso per confermare la purezza e le proprietà F acide della tazza per cellule. Si ottengono risultati che dimostrano che la tossicità del nanotubo di carbonio funzionalizzato può essere misurata in tazza per cellule. Basato sul L-D-H-S-A modificato che supporta che questo modello può essere applicato ai test di tossicità delle nanoparticelle.

Il metodo che miriamo a mostrarvi oggi può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della nano tossicologia, come la valutazione della tossicità dei vettori di farmaci sviluppati di recente, questo è molto importante in quanto la maggior parte delle linee cellulari immortalizzate utilizzate, mostrano proprietà significativamente diverse dai tessuti da cui sono state derivate. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Se il metodo viene eseguito con successo, si otterrà un'elevata resa e purezza di cellule ke, che possono quindi essere utilizzate come modello per lo screening di una serie di nanoparticelle per tale tossicità.

Dopo aver preparato di fresco tutti i reagenti elencati nella tabella dei materiali e dei reagenti che si trovano con il protocollo di testo allegato, riscaldare la soluzione E-G-T-A-H-B-S-S e la soluzione di collagenasi a 40 gradi Celsius per 30 minuti, utilizzare etanolo al 70% per sciacquare il tubo flessibile della pompa. Versare quindi 40 millilitri di soluzione E-G-T-A-H-B-S-S in una provetta da centrifuga immersa nel bagnomaria e utilizzare il preriscaldamento E-G-T-A-H-B-S-S per risciacquare il tubo flessibile della pompa. Dopo l'eutanasia di un topo, secondo il protocollo di testo, radere i peli addominali e utilizzare il 70% di etanolo per disinfettare la superficie addominale.

Confermare l'anestesia pizzicando le dita dei piedi. Tagliare la cavità addominale ed esporre la vena porta e la vena cava inferiore spostando l'intestino lateralmente a sinistra dell'addome. Avviare la pompa a una velocità da uno a tre millilitri al minuto con la soluzione E-G-T-A-H-B-S-S e con un ago a farfalla calibro 23 cannulare la vena porta, bloccare la sezione cannulata della vena porta, quindi capovolgere la pinza sinusoidale sulla superficie dell'addome del topo aperto.

Il fegato dovrebbe diventare pallido entro i primi 30 secondi di perfusione, incidere rapidamente la parte inferiore della vena cava inferiore per evitare l'accumulo di pressione eccessiva nel fegato e aumentare gradualmente la velocità di flusso fino a sette millilitri al minuto nel primo minuto di perfusione. Quando nella provetta da centrifuga rimangono meno di cinque millilitri di soluzione E-G-T-A-H-B-S-S. Aggiungere da 40 a 50 millilitri di collagene in soluzione, quindi aumentare gradualmente la portata fino a 10 millilitri al minuto in 30 secondi.

Fai gonfiare il fegato usando una pinzetta per applicare periodicamente pressione sulla vena cava inferiore per intervalli dal 10 al 32°. Ciò migliorerà la dissociazione cellulare e ridurrà il tempo di perfusione con la collagenasi. Quando rimangono meno di 10 millilitri di soluzione di collagenasi all'interno della provetta da centrifuga, aggiungere altri 40-50 millilitri di soluzione di collagenasi preriscaldata alla provetta.

Quindi, una volta che sono stati perfusi da 70 a 80 millilitri, utilizzare una pinza per applicare una leggera pressione sulla superficie. Un segno di depressione indica che le cellule del fegato sono dissociate. Rimuovere il fegato dalla cavità addominale in un unico pezzo e metterlo in una provetta da centrifuga contenente da 20 a 30 millilitri di tazza per l'isolamento cellulare. Medio.

Mantieni le cellule del fegato in ghiaccio per un massimo di tre ore e raccogli fino a tre fegati per la purificazione per purificare le cellule. Mettere un fegato perfuso in una capsula di Petri con 15 millilitri di tazza per l'isolamento cellulare, mezzo con forbici o pinzette. Rompere la capsula luccicante e rilasciare tutte le cellule del fegato nel terreno.

Filtrare la soluzione attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri in una provetta da centrifuga. Quindi centrifugare la sospensione cellulare a 50 GS a quattro gradi Celsius per due minuti. Le cellule parenchimali saranno nel pellet e le cellule non parenchimali saranno nel surnatante.

Raccogliere il surnatante in una provetta da centrifuga pulita e centrifugare a 50 g per due minuti. Ripeti per un totale di quattro trasferimenti e giri. Prossima centrifuga.

Il supernat a 1.350 GS per 15 minuti. Per pellettare le cellule non parenchimali, scartare il supernat e risospendere il pellet in 10 millilitri di tazza per il mezzo di isolamento cellulare, aggiungere la soluzione di cellule non parenchimali al gradiente isotonico discontinuo al 25 50% precedentemente preparato secondo il protocollo di testo e centrifugare a 850 GS per 15 minuti senza accelerazione o rottura. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri, aspirare circa 12 millilitri della tazza arricchita per la frazione cellulare che appare torbida all'interno della frazione SIP 25% vicina all'interfaccia SIP 25 50%.

Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga contenente da 35 a 40 millilitri di tazza per l'isolamento cellulare, il terreno e mescolare delicatamente, quindi centrifugare a 1, 350 GS e quattro gradi Celsius per pellettare le cellule, scartare il super nominato e utilizzare da cinque a 10 millilitri di terreno preriscaldato per risospendere le cellule con un emocitometro. Contare le cellule e utilizzare la colorazione trian blue per misurare la piastra di vitalità. Le cellule non parenchimali purificate in piastre a 24 pozzetti a una densità di cinque volte 10 fino alla quinta cellula per pozzetto.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Quindi rimuovere delicatamente il terreno. Utilizzare il preriscaldamento HBSS per lavare le cellule e sostituirlo con 500 microlitri per pozzetto di tazza di preriscaldamento fresca per terreno di coltura cellulare.

Riportare le cellule a 37 gradi Celsius per almeno quattro ore per consentire alle cellule di aderire prima del trattamento con particelle di nanoparticelle. Dopo aver caratterizzato la purezza e l'attività fagocitaria del C per le cellule e l'incubazione con nanotubi di carbonio o fct funzionalizzati, come indicato nel protocollo di testo, scartare il surnatante e aggiungere 200 microlitri per pozzetto di tampone di lisi. Incubare a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti, eseguire un pipettaggio vigoroso e raccogliere la tazza di lieed per le cellule in provette da microcentrifuga.

Quindi centrifugare a 20.000 GS per 10 minuti per estrarre i fcn ts che sono stati assorbiti dalle cellule sui detriti cellulari. Raccogliere il surnatante in provette da microcentrifuga e conservarlo a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. In alternativa, trasferire 50 microlitri in una piastra a 96 pozzetti e aggiungere un volume uguale di soluzione di miscela di substrato dal kit di lattato deidrogenasi.

Includere triplicati di pozzetti bianchi contenenti 50 microlitri di tampone di lisi e 50 microlitri di soluzione di miscela di substrato. Quindi coprire la piastra e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti prima di aggiungere 50 microlitri di soluzione di stop. Infine, leggere l'assorbanza a 490 nanometri in un lettore di micropiastre e utilizzare la seguente formula per calcolare la percentuale di vitalità cellulare.

Questa figura illustra che il numero di cellule non parenchimali purificate varia tra otto e 14 volte 10 per le sei cellule per topo e triano. La colorazione blu ha dimostrato circa il 95% di vitalità cellulare. La coppa aderente per le cellule ha adottato una forma rotonda entro 30 minuti dall'incubazione e dopo quattro ore le cellule si sono diffuse e i grappoli hanno iniziato a formarsi come si vede qui.

Le cellule sono state colorate con l'anticorpo F 4 80 per dimostrare la purezza della coppetta, che è stata misurata oltre il 95% mediante citometria a flusso. Inoltre, dopo 12 ore di coltura, l'analisi a bassa citometria ha mostrato che l'85% delle cellule era in grado di svolgere un'attività acida PHA grazie alla loro capacità di assorbire perle fluorescenti di un micrometro. Tuttavia, questo numero è diminuito a 72 ore in coltura, quando solo il 40% delle cellule era fagocitario mostrato qui.

La coppa per le cellule incubate con nanotubi di carbonio funzionalizzati per 24 e 72 ore aveva morfologie simili rispetto alle cellule naïve. Al contrario, la coppa per le cellule incubate con il 10% di DMSO utilizzata come controllo positivo ha mostrato una morfologia necrotica dopo l'analisi della coppa del saggio LDH modificata per le cellule trattate con il 10% di DMSO per 24 e 72 ore ha mostrato un'elevata tossicità. Seguendo questo metodo, altre SC basate su cellule e tutti i tipi di nanoparticelle possono essere testati utilizzando cellule ke isolate.

Ciò consente di raccogliere dati affidabili riducendo al minimo l'uso di animali. Speriamo che questa tecnica possa aiutare i ricercatori nel campo della psicologia delle nanotecnologie a valutare la sicurezza dei molti promettenti nanovettori sempre più sviluppati.