Name: In Vitro Modellazione di cancerose Neural Invasion: La dorsale della radice Ganglio Modello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Scopri la modellazione in vitro dell'invasione neuronale tumorale utilizzando il modello DRG/cellule cancerose. Questa tecnica riproduce il microambiente neurale canceroso per studiare le interazioni tra cellule tumorali e neuroni.

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Edith Suss-Toby viene ringraziata per la sua assistenza nella microscopia time-lapse e nell'analisi delle immagini. Si ringrazia Nofar Rada per il lavoro artistico.

Quattro a sei settimane di età femminile C57BL / topi CJ (Harlan, Gerusalemme, Israele) sono stati utilizzati nell&#39;esperimento secondo l&#39;Associazione per la valutazione e l&#39;accreditamento delle specifiche Laboratory Animal Care. Tutte le procedure sperimentali sono state fatte secondo Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso e il Dipartimento di Agricoltura regolamenti. 1. La raccolta del midollo spinale <ol><li> Euthanize il mouse utilizzando una camera di CO 2. Evitare dislocazione cervicale in quanto potrebbe causare danni alle radici gangliari a causa di forze di taglio. Da qui in poi, eseguire tutte le operazioni in condizioni sterili. </li><li> Bagnare animale verso il basso con il 70% di etanolo. Questo passaggio è importante per la sterilizzazione e per prevenire i capelli da trascinare attraverso gli organi interni. </li><li> Lasciare il mouse per asciugare da etanolo. Evitare qualsiasi contatto di etanolo con gli organi interni a causa di neurotossicità. </li><li> Dopo essiccamento del mouse, posizionate utilizzando perni in posizione prona(faccia in giù). Posizionare i perni su ogni degli arti posteriori e arti anteriori. </li><li> Utilizzando pinze, fare una incisione mediana che si estende cranio-caudale dal collo posteriore alla colonna lombare. Successivamente, sollevare lembi dermici bilateralmente con pinze ed esporre il tessuto sottocutaneo. </li><li> Palpare cranio del mouse fino al bivio craniocervicale. Utilizzando le forbici perpendicolari per l&#39;animale, tagliare i muscoli cervicali e della colonna vertebrale a livello della giunzione cranio-cervicale (il 7 ° vertebre cervicali), con pinze pesanti. Sezionare la colonna vertebrale caudale e accise della colonna vertebrale con una pinza pesanti fino a raggiungere il livello lombare (posteriori livello degli arti). </li><li> Eseguire un transezione caudale completa a livello della colonna lombare (la 5 ° vertebra lombare) con pinze pesanti. </li><li> Arrotolare il mouse sopra (faccia in su). Non vi è alcuna necessità di coprire l&#39;incisione dal DRG viene estratto dai livelli vertebrali inferiori e non cervicale. </li><li> Tagliare sulla linea mediana dal collo all&#39;addome, ritrarre ilpelle lateralmente e poi tagliato per aprire il peritoneo. </li><li> Rimuovere gli organi interni all&#39;interno del peritoneo (fegato, milza, pancreas, stomaco e intestino) in blocco. Quindi, rimuovere gli organi retroperitoneali (vale a dire, i reni e pancreas). Cranialmente, aprire la parete toracica. </li><li> Utilizzando pinze e una lama chirurgica, tagliare le nervature, lasciando 5 mm di costole bilateralmente distanza dalla colonna vertebrale. A questo punto, la colonna vertebrale è separata dal resto del corpo. </li><li> Lavare la colonna vertebrale, dal sangue freddo (4 ° C) fosfato fresco salina tamponata (PBS) due volte. </li></ol> 2. Isolare la gangli dorsali (DRG) <ol><li> Utilizzare uno stereomicroscopio con 4X ingrandimento. </li><li> Posizionare la colonna vertebrale su una piattaforma assorbente non non aderente (Telfa / nylon). Posizionare la faccia colonna vertebrale fino allo stesso orientamento cranio-caudale. </li><li> Rimuovere tutti i muscoli della colonna vertebrale e del tessuto connettivo. Utilizzare le costole come punto di riferimento per i nervi, come hannolasciare la colonna vertebrale. Costole anche proteggono i nervi dagli strumenti chirurgici. Il DRG si trova alle cervicali, toraciche e lombari siti delle vertebre. </li><li> Successivamente, utilizzando forbici tagliare il corpo vertebrale sulla linea mediana ed espongono il midollo spinale e le radici DRG delicatamente retrazione laterale del corpo vertebrale. </li><li> Nello spazio intercostale, seguire il nervo periferico medialmente lungo il laterale costola al DRG. </li><li> Identificare il DRG. Sembra che il tuorlo d&#39; &#39;uovo fritto&#39; sdraiato sul nervo. </li><li> Tagliare il distale nervi intercostali al DRG lasciando 2-3 mm di distale nervo gangli, da utilizzare per la retrazione. Questa &quot;coda&quot; sarà rimosso dopo la raccolta. </li><li> Afferrare il nervo con pinze. Stringendo il corpo DRG stesso causerà danni alle cellule neurali e deve essere evitato. </li><li> Avvicinatevi al DRG prossimalmente lungo il suo attaccamento al midollo spinale, attraverso il suo anteriore e radici posteriori. </li><li> Applicare delicata retrazione al DRG tirando la efferenti nervo (nervo intercostale moncone) lateralmente, e tagliare l&#39;anteriore e radici posteriori vicino al DRG. </li><li> Mantenere il DRG in una Petri piastra da 35 mm riempita fresco, ghiaccio DMEM freddo supplementato con 10% di siero fetale di vitello (FCS), 1% di penicillina-streptomicina, aminoacidi non essenziali 1% e 1% di sodio piruvato. </li></ol> 3. L&#39;impianto nella capsula di Petri <ol><li> Eseguire i prossimi passi sul ghiaccio con punte pre-raffreddato pipette per evitare ECM solidificazione. </li><li> Sotto uno stereomicroscopio a 2-4x ingrandimento, mettere da 35 mm di vetro di Petri fondo piatto su una griglia di carta. IMPORTANTE: Lavorare sul ghiaccio al fine di mantenere l&#39;ECM allo stato liquido. Creare un punto diametro di 1 mm (circa 20 ml) di fattore di crescita impoverito ECM al centro della griglia. </li><li> Sotto visualizzazione diretta, posizionare il DRG al centro dello spot ECM vicino al fondo del piatto. Nota: Le cellule tumorali utilizzati in questo protocollo sono murini cellule tumorali pancreatiche (KPC) ha istituito ilhed da campioni tumorali appena isolate da topi KPC come descritto altrove 19. </li><li> Celle di raccolta 40.000 tumorali provenienti da culture confluenti, lavarli una volta con PBS, e li risospendere in 40 ml ECM sul ghiaccio. </li><li> Sotto la visualizzazione diretta della griglia utilizzando un micron misura stereomicroscopio 500 in ogni direzione dalla DRG. A questo punto seme lentamente 10.000 cellule / ml 10 ECM. Utilizzare una punta preraffreddato 2-10 ml per iniettare le cellule vicino al fondo piatto, evitando la loro diffusione nella matrice o distacco della matrice. (Figura 1). </li><li> Lasciare il piatto all&#39;interno di una cappa a flusso laminare per 10-15 min a solidificare. Evitare ECM essiccazione. </li><li> Aggiungere lentamente DMEM, preparata come precedentemente accennato, contro la parete laterale della piastra. Aggiungere abbastanza medio per coprire l&#39;ECM (circa 2 ml). </li><li> Mettere il piatto di nuovo per l&#39;incubatore a 37 ° C. </li><li> Sostituire il mezzo con terreno fresco il giorno seguente. </li><li> Sostituire la media ogni 2 giorni. &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Acquisizione dati, Time-lapse di videomicroscopia <ol><li> Il giorno 7 dopo l&#39;impianto, prendere il piatto per la microscopia lasso di tempo. Si noti che alcune cellule potrebbero richiedere l&#39;acquisizione in precedenza a causa della migrazione più veloce. </li><li> Durante l&#39;imaging dal vivo, la capsula in un ambiente chiuso ad una temperatura media di 37 ± 0,1 ° C e 5% CO 2. </li><li> Registrare le celle utilizzando un accoppiamento di carica fotocamera dispositivo posto sul microscopio. </li><li> Prendere immagini digitalizzate ogni 10 minuti per un massimo di 72 ore a seguire locomozione cella da tre a sei celle diverse. </li><li> Sostituire media dopo 24 ore. </li><li> Eseguire acquisizione e analisi dei dati semplice utilizzando il software microscopio. </li></ol> Analisi 5. I dati <ol><li> Per applicazioni più avanzate (ad esempio, il monitoraggio delle cellule in 2D o 3D) utilizzare software specializzati (come Imaris 4D). Nota: Questo software determina le coordinate XY di una cella aqualsiasi dato tempo, insieme con la distanza dall&#39;origine, e la velocità di movimento. </li><li> Calcolare la velocità media misurando il percorso fra posizioni successive in intervalli di 10 min. Calcolare la migrazione Index Forward (FMI), che è la distanza della parte anteriore cella dal neuriti e descrive il movimento unidirezionale delle celle verso il DRG. </li></ol>

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</ol>

Questa ricerca è stata supportata dal premio ICRF Barbara S. Goodman per lo sviluppo della carriera di ricerca (2011-601-BGPC) e da una sovvenzione della Fondazione Scientifica Binazionale USA-Israele. Non devono essere fornite altre informazioni finanziarie da parte degli autori.

Questo articolo presenta un modello in vitro che ricapitola il microambiente tumorale nella nicchia neurale, il modello DRG. Il video mostra tutte le fasi a partire da riconoscere punti di riferimento anatomici come il DRG nel topo, la sua estrazione, e, infine, la sua coltura in ECM. è presentato anche co-coltura DRG a fianco con le cellule tumorali. Non ci sono altri modelli in vitro per la ricerca invasione perineurale descritti in letteratura rendendo questo modello indispensabile per studiare la n...

tumori solidi diffondere in tre modi principali: invasione diretta, diffusione linfatica e diffusione hematogenic. Tuttavia, c&#39;è un quarto mezzo di diffusione del cancro che viene spesso ignorata, diffusione lungo i nervi. Cancerose invasione neurale (CNI) è un percorso ben noto di diffusione del cancro, in particolare nei tumori della testa e del collo, della prostata 1 2, 3 e del pancreas. 4-8 CNI si verifica in più del 80% degli individui con adenocarcinoma del pancreas, portando per tumore retroperitoneale diffondersi attraverso i nervi celiaca gangliari. Queste cellule tumorali neurotropic hanno una capacità unica di migrare unidirezionalmente lungo i nervi verso il sistema nervoso centrale (CNS). 9 Questa scoperta suggerisce che il microambiente perineurale può essere sfruttato da cellule tumorali, fornendo fattori che favoriscono la crescita maligna. Uno dei pochi modelli in vitro per la ricerca CNI è gangli delle radici dorsali (DRG) / modello di cellula tumorale. Questo modEL è spesso usato per studiare l&#39;interazione paracrino tra cellule tumorali stroma e neurali. 10-18 In questo modello, mouse o linee cellulari tumorali umane sono cresciuti in matrice extracellulare (ECM) adiacente a preparazioni di DRG colta appena dissociato. In questo articolo il video mostra l&#39;applicazione in vitro CNI in adenocarcinoma del dotto pancreatico.

<table><tbody><tr><td>Attrezzatura:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio operatorio</td><td>Leica</td><td>M205</td><td></td></tr><tr><td>Time Lapse System</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lama chirurgica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z309036</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3271</td><td></td></tr><tr><td>35 mm piastre di Petri, fondo in vetro</td><td>de groot</td><td>60-627860</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda&nbsp; </td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materiali:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cold PBS</td><td>Industrie biologiche</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Industrie biologiche</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Renio</td><td>10108165</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina e streptomicina</td><td>Industrie biologiche</td><td>01-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Industrie biologiche</td><td>03-042-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Industrie biologiche</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel impoverito di fattore di crescita</td><td>Trevigen</td><td>3433-005-01</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro modellazione di cancerose neural invasion: la dorsale della radice ganglio modello

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

Un modo in cui i tumori solidi si diffondono è attraverso l'invasione neurale. Questa via è ben nota nei tumori della testa e del collo, della prostata e del pancreas. Queste cellule tumorali neurotropiche hanno una capacità unica di migrare unidirezionalmente lungo i nervi verso il sistema nervoso centrale (SNC). Il modello di cellule tumorali dei gangli della radice dorsale (DRG) è un modello in vitro tridimensionale (3D) frequentemente utilizzato per studiare l'interazione tra lo stroma neurale e le cellule tumorali. In questo modello, linee cellulari tumorali di topo o umane vengono coltivate in ECM adiacenti a preparazioni di DRG in coltura appena dissociata. In questo articolo, vengono dimostrati il protocollo di isolamento DRG dai topi e l'impianto in piastre di Petri per la co-coltura con cellule tumorali del pancreas. Cinque giorni dopo l'impianto, le cellule tumorali sono entrate in contatto con i neuriti DRG. Successivamente, queste cellule hanno formato teste di ponte per facilitare una migrazione neurotropica polarizzata più estesa delle cellule tumorali.

<html> Utilizzando immagini di microscopia video, il DRG può essere visto germogliare neuriti 5-7 giorni dopo l&#39;impianto, mentre le cellule tumorali migrare lontano dalle loro colonie verso il DRG. Con il 7 ° giorno dopo l&#39;impianto, le cellule tumorali vengono a contatto con neuriti (Figura 2). L&#39;indice di migrazione Forward delle cellule tumorali pancreatiche utilizzati nel protocollo è ...

Questo articolo video mostra l'uso dei gangli della radice dorsale (DRG)/modello di cellule tumorali nell'adenocarcinoma duttale pancreatico.

In Vitro Modellazione di cancerose Neural Invasion: La dorsale della radice Ganglio Modello

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

L'obiettivo generale di questo modello è riprodurre il microambiente neurale tumorale. Ciò permette di esplorare le interazioni tra cellule tumorali e neuroni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo del microambiente tumorale, come le interazioni tra cellule tumorali e neuroni e l'influenza reciproca tra questi due tipi cellulari.Il vantaggio principale di questa tecnica è che è affidabile, facile da eseguire e tiene conto sia dei fattori cellulari che cerebrali nella nicchia neurale. Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo terapeutico e al targeting farmacologico di fattori chiave nel processo di rimodellamento neurale e di invasione durante lo sviluppo del cancro. Dopo aver soppresso l'animale in una camera a CO2, inumidire il pelo con etanolo al 70% e lasciarlo asciugare.Fissare il topo in posizione prona, quindi praticare un'incisione mediana in senso cranio-caudale che si estenda dalla nuca fino alla colonna lombare. Successivamente, utilizzare la pinza per sollevare bilateralmente i lembi cutanei ed esporre il tessuto sottocutaneo. Palpare il cranio del topo fino a identificare la giunzione cranio-cervicale.Usare le forbic

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Generazione dell'espiantazione del ganglio della radice dorsale e della coltura cellulare dissociata

L'invasione perineurale (PNI) è una caratteristica comune del carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSCC), che conferisce tassi di sopravvivenza più bassi. I suoi meccanismi sono poco conosciuti. Utilizzando neuriti generati da gangli murini della radice dorsale confinati in una matrice semisolida, è possibile studiare le vie coinvolte nel PNI delle linee cellulari HNSCC.

Un modello per perineurale Invasion in testa e del collo carcinoma a cellule squamose

Descriviamo un modello murino in vivo di invasione perineurale iniettando le cellule tumorali pancreatiche syngeneic nel nervo sciatico. Il modello consente per la quantificazione del grado di invasione del nervo e appoggia la indagine dei meccanismi cellulari e molecolari dell'invasione perineurale.

Un modello In Vivo murino nervo sciatico di invasione perineurale

L'invasione perialinale è un fenotipo aggressivo per carcinomi a cellule squamose testa e collo e altri tumori. Il modello di membrana corioalltoica del pulcino è stato utilizzato per studiare angiogenesi, invasione del cancro e metastasi. Qui dimostriamo come questo modello può essere utilizzato per valutare l'invasione perineurale in vivo.

Il modello Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo per valutare l'invasione perineurale nel cancro alla testa e al collo

Questo protocollo fornisce una tecnica per raccogliere e coltivare il ganglio radicale dorsale (DRG) espiantato da ratti Sprague Dawley adulti in un dispositivo multicompartimentale (MC).

Raccolta, inclusione e coltura dei gangli della radice dorsale in dispositivi multicompartimentali per studiare le caratteristiche neuronali periferiche

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Definizione di modelli in vitro di coltura dei gangli della radice dorsale: approcci complementari per lo studio del crosstalk cancro-nervo

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