In Vitro Modellazione di cancerose Neural Invasion: La dorsale della radice Ganglio Modello

L'obiettivo generale di questo modello è quello di ricapitolare il microambiente neurale canceroso. Ciò consente l'esplorazione delle interazioni tra i neuroni delle cellule tumorali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del microambiente tumorale, come l'interazione tra cellula tumorale e neuroni e l'influenza reciproca di ciascun set.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è affidabile, facile da eseguire e affronta sia i fattori cellulari che quelli cerebrali nella nicchia neurale. Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo terapeutico e al targeting farmacologico di fattori chiave nel processo di rimodellamento neurale e di invasione durante lo sviluppo del cancro. Dopo l'eutanasia dell'animale in una camera di CO2, immergere la pelliccia con etanolo al 70% e lasciarla asciugare.

Blocca il topo in posizione prona, quindi fai un'incisione sulla linea mediana che si estende cranio-audadicamente dal collo posteriore alla spina dorsale. Successivamente, usa una pinza per sollevare bilateralmente i lembi dermici ed esporre il tessuto sottocutaneo. Palpare il cranio del topo fino a identificare la giunzione craniocervicale.

Usa le forbici angolate perpendicolarmente all'animale per tagliare i muscoli cervicali e la colonna vertebrale alla giunzione craniocervicale. Quindi, sezionare la colonna vertebrale caudalmente e utilizzare le forbici per eseguire una transezione caudale completa alla quinta vertebra lombare. Quindi, posizionare il topo in posizione supina e, dopo aver praticato un'incisione lungo la linea mediana dal collo all'addome, ritrarre la pelle lateralmente e quindi tagliare il peritoneo.

Cranialmente, apri la parete toracica con le forbici. Dopo aver rimosso gli organi peritoneale e retroperitoneale, utilizzare una pinza e una lama chirurgica per tagliare le costole, lasciando circa cinque millimetri di costole che sporgono dalla colonna vertebrale. Rimuovere la colonna vertebrale dal resto del corpo.

e lavare due volte con PBS freddo. Posizionare la colonna vertebrale rivolta verso l'alto con lo stesso orientamento cranio-caudale su una piattaforma assorbente non aderente sotto uno stereomicroscopio dotato di ingrandimento 4X. Mentre guardi attraverso questo stereomicroscopio, rimuovi i muscoli spinali e il tessuto connettivo.

Usa le costole come punti di riferimento per i nervi, poiché lasciano la colonna vertebrale. I DRG si trovano nelle vertebre cervicali, toraciche e lombari. Usa le forbici per tagliare il corpo vertebrale sulla linea mediana, creando una finestra sul midollo spinale, quindi ritrai delicatamente il corpo vertebrale per esporre il midollo spinale e le radici DRG.

Quindi, usando le forbici a molla, rimuovi la nervatura superiore per esporre il DRG. Seguire il nervo periferico medialmente lungo la costola lateralmente al DRG. Identifica il DRG, che può essere descritto come il tuorlo di un uovo fritto che giace sul nervo.

Tagliare il nervo intercostale distalmente al DRG lasciando da due a tre millimetri di nervo distale ai gangli da utilizzare per la retrazione. Afferrare con cautela il nervo efferente usando una pinza senza pizzicare o danneggiare il DRG. Ora applica una leggera retrazione al DRG tirando lateralmente il nervo.

Quindi tagliare le radici anteriori e posteriori vicino al DRG. Trasferire il DRG isolato in una capsula di Petri da 35 millimetri riempita con DMEM integrato con ghiaccio freddo. Lavorando in una cappa a flusso laminare, posizionare una capsula di Petri con fondo di vetro da 35 millimetri su una griglia di carta su ghiaccio.

Utilizzando un puntale per pipetta preraffreddato, erogare circa 10 microlitri di ECM impoverita di fattore di crescita al centro della griglia. Durante l'osservazione della parabola attraverso uno stereomicroscopio con un ingrandimento da 2 a 4X, posizionare il DRG al centro dell'ECM vicino al fondo della parabola. Dopo aver raccolto e lavato, 40.000 cellule tumorali di interesse provenienti da colture confluenti, risospendere il pellet e 40 microlitri di ECM su ghiaccio.

Ancora una volta, osserva la griglia attraverso lo stereomicroscopio, misura 500 micron dal DRG e a questo punto eroga 10 microlitri di sospensione cellulare. Ripetere in tutte le direzioni dal DRG. Lasciare la capsula nella cappa a flusso laminare per 10-15 minuti per solidificare ma non asciugare.

Una volta che l'ECM si è solidificato, aggiungere lentamente il DMEM integrato pipettandolo contro la parete laterale della piastra. Aggiungere circa due millilitri di terreno, sufficienti a coprire l'ECM. L'aggiunta di DMEM deve essere eseguita molto lentamente pipettando contro la parete laterale della piastra per evitare il distacco del DRG dal fondo della piastra.

Posizionare la piastra nell'incubatore per colture tissutali e seguire le istruzioni nella parte scritta del protocollo per mantenere la coltura. Questa micrografia mostra il DRG nella parte superiore del campo visivo e le cellule tumorali nella parte inferiore del campo visivo il giorno zero dopo la semina. Qui, la stessa coltura viene mostrata sette giorni dopo la semina.

Come indicato dalle frecce, le cellule tumorali migrano lungo il neurone DRG. Questo istogramma mostra l'indice di invasione nervosa DRG di diversi tipi di cellule tumorali. Si può vedere che le cellule Kpc 989 e MiaPaCa hanno un indice di invasione nervosa più elevato rispetto alle cellule QLL2 o NIH3T3.

Questo grafico di coordinate rappresenta il percorso di migrazione di una cellula tumorale Kpc a contatto con il nervo mostrato in rosso e di una cellula QLL2 mostrata in viola. Vengono visualizzate le coordinate X e Y. Questa figura mostra un'analisi dalla distanza di origine per la migrazione delle cellule tumorali QLL2 con contatto assonale.

Qui viene mostrata la distanza di origine per le cellule tumorali Kpc. In ogni caso, la direzione della migrazione era verso il ganglio nervoso. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di preparare più gangli del necessario poiché il tasso di controllo non è del 100%Dopo il suo sviluppo, il motivo DRG ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sul cancro per esplorare la nicchia neurale all'interno del microambiente tumorale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come riconoscere i punti di riferimento anatomici come il DRG nel topo, estrarre il DRG e, infine, come coltivarlo in DCM. Viene inoltre presentata la cocoltura del DRG insieme alle cellule tumorali.