L'osservazione del movimento ciliare delle cellule epiteliali del plesso coroide Ex Vivo

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare il movimento della cellula epiteliale del plesso coroideo, Celia ex vivo. Ciò si ottiene asportando prima il cervello da un embrione o cucciolo di topo per isolare il tessuto del plesso coroideo. Il movimento ciliare viene visualizzato mediante contrasto interferenziale differenziale, o microscopia DIC, e quindi viene acquisito un filmato digitale delle punte ciliari per il tracciamento manuale delle posizioni delle punte ciliari.

In definitiva, i movimenti della punta ricostituita del Celia sono classificati e quantificati in base ai modelli dei loro movimenti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia cellulare, come ad esempio come viene controllata la mortalità della celia durante lo sviluppo e come cambia il modello di mobilità nel tempo? L'implicazione di queste tecniche è stata l'analisi fisiologica e la diagnosi del percorso.

La Siria ha associato le malattie come le nostre conoscenze fondamentali della Siria cinetica è ancora stimola. Iniziare mettendo un topo neonatale sciacquato al 70% con etanolo, testa in liebovitz L 15 ghiacciato, medio in un piatto sterile di 10 centimetri subito dopo la decapitazione. Quindi, usa un paio di pinze da orologiaio per rimuovere il cuoio capelluto dal cranio.

Quindi tagliare il cranio con una sezione mediana lungo la sutura longitudinale per esporre il cervello, seguito dal taglio dei nervi cranici per prelevare l'intero organo. Trasferisci il cervello isolato in un nuovo piatto riempito di ghiaccio fresco, mezzo freddo, con l'aspetto dorsale rivolto verso l'alto e posiziona il piatto sotto uno stereomicroscopio. Quindi orientare il tessuto in modo che i bulbi olfattivi siano posizionati a ore tre e afferrare delicatamente il cervello con la pinza dell'orologiaio.

Con l'altra mano, usa una pinza per dissezione fine per tagliare i pooni cerebrali che collegano gli emisferi cerebrali al tronco cerebrale. Pizzicare il Dion Cephalon per separare ulteriormente gli emisferi e posizionare la superficie tagliata rivolta verso l'alto, quindi tirare la lamina afia per rimuovere il plesso coroideo ventricolare laterale attaccato al lato laterale dell'ippocampo. Quando il plesso coroideo è stato isolato, trasferire il tessuto in un piatto di vetro da 35 millimetri contenente terreno fresco e posizionare un peso sul tessuto per tenerlo delicatamente in posizione entro 25-60 minuti dall'eutanasia, iniziare l'imaging dal vivo della cellula epiteliale del plesso coroideo Celia, regolando la messa a fuoco della lente dell'obiettivo a occhio.

Regolare il condensatore in modo che il centro e la messa a fuoco siano conformi all'illuminazione Kula. Quindi inserire gli elementi ottici appropriati nel percorso della luce per conformarsi all'ottica DIC. Spostare il prisma DIC per regolare il contrasto delle immagini in una posizione in cui la struttura superficiale del tessuto sarà chiaramente riconosciuta.

Quindi passare il percorso della luce alla videocamera e aumentare la potenza della luce. Con la rimozione dei filtri a densità neutra, regolare un campo di osservazione e messa a fuoco, impostando la risoluzione temporale della videocamera a 200 hertz e il tempo di esposizione a 0,1 millisecondi per il periodo di imaging desiderato. Quindi acquisire le immagini dopo aver ottenuto la pila di immagini, ogni singolo fotogramma visualizzerà un'immagine chiara di Celia per tracciare manualmente i modelli di battitura di ciascun cilio.

Utilizzare il puntatore del mouse per contrassegnare la posizione delle punte ciliari in ogni fotogramma. Quindi, utilizzando il software appropriato, analizzare i dati della traiettoria e classificare le traiettorie in una delle due modalità di movimento avanti e indietro o rotazionale a occhio. Utilizzando la formula, calcolare la frequenza di battito ciliare per più cicli di battito ciliare.

Poiché altre celie sulla stessa cellula possono interferire con il movimento di ciascun cilio. Successivamente, analizzare l'uniformità angolare degli assi di battimento ciliare all'interno di una singola cellula. Per le traiettorie avanti e indietro, le posizioni delle punte Celia si adattano a una linea retta definendo theta come l'angolo che la linea compie con l'asse X.

Per le traiettorie di rotazione, adattare le posizioni a un'ellisse definendo theta come l'angolo che l'asse maggiore dell'ellisse compie con l'asse x. Infine, per una descrizione quantitativa di ciascuna traiettoria, ruotare le traiettorie per theta definendo i loro rapporti d'aspetto come i rapporti tra le larghezze della loro distribuzione lungo gli assi x e y. In questa prima clip, viene mostrata una vista dall'alto delle cellule epiteliali del plesso coroideo con Celia di un cucciolo di topo postnatale del secondo giorno ripreso mediante microscopia video ad alta velocità.

In questa seconda clip, viene mostrata una vista ingrandita dell'area riquadrata del filmato precedente, consentendo un'osservazione più ravvicinata dei movimenti rotatori e avanti e indietro esibiti dal singolo cilio. Qui vengono presentate le traiettorie dei movimenti rappresentativi della punta ciliare ricostruite da registrazioni cinematografiche su più cicli con l'andamento temporale delle coordinate x e y delle posizioni della punta tracciate nei grafici. Per dimostrare uno sfasamento tra le due coordinate in questi grafici, le coordinate x e Y sono state normalizzate e sovrapposte.

Sebbene le CLIA mobili siano facilmente riconoscibili dall'imaging dal vivo, non è facile identificare le CLIA non mobili con questo metodo. Per ovviare a questa difficoltà, la microscopia elettronica a scansione può essere indispensabile per ottenere immagini intere dei clia indipendentemente dalla loro motilità. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di eseguire la dissezione con sufficiente tempestività in modo da preservare la freschezza del campione e mantenere la motilità della Siria.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare campioni di tessuto con cereali virali, nonché di come monitorare e quantificare la mortalità del CX vivo.