Name: Losservazione del movimento ciliare delle cellule epiteliali del plesso coroide Ex Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Scopri l'analisi del movimento ciliare delle cellule epiteliali del plesso coroide ex vivo utilizzando la microscopia DIC. Questo metodo permette di categorizzare e quantificare i pattern di motilità ciliare.

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Questo lavoro è stato supportato da un Progetto per Università Private: sovvenzione del Fondo Complementare dal Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (MEXT) del Giappone (T.I.) e Grants-in-Aid for Scientific Research (C) da MEXT (S.T. e K.N).

I protocolli e l&#39;uso di animali da esperimento sono stati approvati dalla cura degli animali e l&#39;uso dei comitati istituzionali presso l&#39;Università di Yamanashi e Waseda University. La cura degli animali è stata eseguita in conformità con le linee guida istituzionali. 1. CPEC Preparazione <ol><li> Preparare i seguenti apparati e materiali: un microscopio stereo, preferibilmente in grado di trasmettere illuminazione dal basso; un paio di pinze da orologiaio (Dumont # 3 o # 4), sterilizzata fiamma, forbici operativi diritte, sterilizzato fiamma; due sterili piatti 10 centimetri di plastica contenenti 20 ml ghiacciata Leibovitz L-15; 35 millimetri piatti con fondo di vetro, contenenti 2 ml di RT Leibovitz L-15; un becher da 100 ml contenente 70% di etanolo; cuccioli neonatali mouse. </li><li> Brevemente immergere un mouse neonatale in 70% di etanolo e eutanasia rapidamente decapitazione utilizzando le forbici operativi. </li><li> Mettere subito la testa in gelida Leibovitz L-15 di media sterile 10 centimetri dish. </li><li> Togliere la pelle dai calvaria utilizzando la coppia di pinze orologiaio, tagliare aprire il cranio per esporre il cervello, e quindi tagliare i nervi cranici per isolare tutto il cervello. </li><li> Trasferire il cervello per un nuovo piatto contenente ghiacciata Leibovitz L-15 a medio e osservare al microscopio stereo, facendo in modo che il cervello è completamente immerso nel mezzo. </li><li> Impostare la parte dorsale del cervello rivolto verso l&#39;alto, e orientare il cervello in modo che i bulbi olfattivi risiedono nella posizione 03:00 (per le persone destri). Tenere il cervello leggermente con le pinzette nella mano sinistra. </li><li> Utilizzando le pinze dissezione fini (Dumont # 3 o 4 #) nella mano destra, tagliare il corpo calloso e sotto il parenchima che collega gli emisferi cerebrali, lungo la fessura longitudinale del cervello. </li><li> Spingere delicatamente gli emisferi cerebrali via ai fianchi laterali ed esporre la fessura cerebrale trasversale. </li><li> Separare gli emisferi pizzicando fuori the parenchima tra l&#39;emisfero e talamo. </li><li> Estrarre delicatamente i laterali plesso coroideo ventricolari che è attaccato alla parte laterale dell&#39;ippocampo dal Affixa lamina. </li><li> Trasferire i isolati plesso coroideo al piatto fondo di vetro 35 millimetri contenente fresco Leibovitz L-15 di media, e sovrapporre un peso (Materials List) delicatamente per tenere il tessuto in luogo. </li></ol> 2. Immagini dal vivo di CPEC Cilia <ol><li> Verificare il corretto raggi ultravioletti (UV) e il filtro dedotto (IR) taglio (s) per bloccare luminosa inferiore a 400 nm e più di 700 nm, e che a densità neutra (ND) Filtri (25% e il 6%), sono inseriti nel percorso di luce del microscopio invertito. </li><li> Regolare la messa a fuoco della lente obiettivo rudemente per occhio, e quindi regolare il condensatore in modo che il centro ed il fuoco per conformarsi alla illuminazione Köhler. Inserire un contrasto interferenziale differenziale appropriata (DIC) prisma, un elemento DIC, nonché analizzatore e polarizzatore elementi in lipercorso ght di conformarsi alle ottiche DIC. </li><li> Regolare il contrasto di vista dalla posizione del prisma DIC modo che la struttura della superficie del tessuto è più riconoscibile. Se tutti cilia delle cellule bersaglio sono mobili, una chiara visione di ciglia motile non può essere ottenuta con occhio a causa del loro movimento. </li><li> Modificare il percorso della luce per la videocamera, e rimuovere i filtri ND per aumentare la potenza della luce. </li><li> Usare la fotocamera in modalità di messa a fuoco per regolare il campo visivo e messa a fuoco. Durante la messa a fuoco, in cui le immagini video vengono visualizzati in tempo reale sul monitor, una chiara visione di ciglia motilità non è disponibile. </li><li> Usare la fotocamera a 200 Hz con un tempo di esposizione di 0,1 ms per il periodo desiderato (secondi a minuti). Dopo l&#39;acquisizione della pila di immagini, singoli fotogrammi visualizzeranno strutture ciliari chiare. Se i bordi ciliari sono sfocate, di aumentare la frequenza dei fotogrammi o utilizzare un tempo di esposizione più breve. </li><li> Registrare il movimento di CPEC ciglia entro 25-60 minuti dopo l&#39;eutanasia in LeibovitzL-15. </li></ol> 3. Analisi del Movimento ciliare <ol><li> Tenere traccia manualmente battendo i modelli di ogni ciglio sul monitor del computer. Segna posizioni punta ciliare in ogni fotogramma con il puntatore del mouse, che vengono assemblati per informazioni traiettoria di ogni ciglio. O analizzare le informazioni traiettoria con lo stesso software o esportare in altre applicazioni più generali per ulteriori analisi. L&#39;efficienza di questa fase di analisi è descritto nella discussione. </li><li> Classificare le traiettorie in due modalità di movimento, avanti e indietro o di rotazione, a occhio. </li><li> Calcolare la frequenza battito ciliare (CBF) utilizzando la seguente formula: [CBF = (numero di fotogrammi al secondo) / (numero medio di frame per un singolo battito)] 14, che può essere ottenuto da un diagramma di moto punta ciliare (Figura 3 ). Ripetere questo calcolo per più cicli battito ciliare, perché altra cilia sulla stessa cella può interferire con il movimento di ciascun cilium, con conseguente irregolarità. </li><li> Per analizzare l&#39;uniformità angolare del battito ciliare assi all&#39;interno di una singola cella, definire l&#39;angolo θ battitura per ogni traiettoria (Figura 4). Per traiettorie indietro e indietro, misura le posizioni della punta cilia a una linea retta, e definire θ come l&#39;angolo del segmento fa con asse x. Per traiettorie rotazionali, montare le posizioni ad un&#39;ellisse, e definire θ come l&#39;angolo l&#39;asse maggiore dell&#39;ellisse fa con asse x. I dettagli del montaggio sono descritti nella sezione risultati rappresentativi. </li><li> Per una descrizione quantitativa di ogni traiettoria, calcolare generalizzata proporzioni AR. Brevemente, ruotare la traiettoria - θ e definire AR come il rapporto tra le larghezze della distribuzione lungo x - e -axes y (Figura 4B). I dettagli sono indicati nella sezione risultati rappresentativi, e l&#39;interpretazione, Significato, e la limitazione del parametro sono descritti nella discussione. </li></ol> 4. Preparazione del campione per SEM Nota: SEM è un metodo importante per valutare lo stato delle ciglia su CPECs in modo globale. Per preparare campioni per SEM, una procedura standard riportato in precedenza 15 viene impiegato con lievi modifiche. <ol><li> Prima sezionare il tessuto dal cervello, preparare il fissativo in una fiala di vetro da 5 ml con tappo in polietilene. Il fissativo contiene il 2% paraformaldeide, glutaraldeide al 2,5% (metà soluzione Karnovsky 16) in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4. </li><li> Sezionare il tessuto dal cervello come descritto al punto 1. </li><li> Brevemente sciacquare il tessuto isolato con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) in un nuovo piatto e quindi fissare il tessuto nella fissante nella fiala di vetro per 1 ora a temperatura ambiente. Utilizzare pipette monouso e trattare i campioni gente. Dopo lavaggio in HBSS, il tessuto diventa appiccicoso. <ol><li> Per trasferire i campioni nella soluzione fissativo, lentamente espellere una piccola quantità di soluzione contenente il tessuto dalla pipetta di trasferimento come una gocciolina e aggiungere al fissativo. </li></ol></li><li> Dopo la fissazione, scartare il fissativo e lavare il tessuto con tampone fosfato tre volte. </li><li> Immergere il tessuto in una soluzione di saccarosio al 10% per lavare i restanti aldeidi. Per assicurare l&#39;eliminazione completa aldeidi, immergere i campioni nella soluzione per 10 minuti e quindi ripetere due volte con fresca 10% di saccarosio. Questo passaggio è importante per una buona post-fissazione in fasi successive. </li><li> Immergere il tessuto in una soluzione di 1% tetrossido di osmio in tampone fosfato per 30 min e poi posto su ghiaccio per post-fissazione. Giudicare il grado di osmification dal colore del campione: quando aldeidi vengono completamente rimossi, il campione è nero. </li><li> Lavare i campioni di tessuto post- fisso a lungo con doppio distilled acqua più volte. </li><li> Disidratare i campioni di immersione in concentrazioni graduati di etanolo, generalmente 65%, 75%, 85%, 95%, 99% e 100%, per 10 minuti ciascuno. Ottenere etanolo anidro inserendo setacci molecolari in 99,5% di etanolo da una bottiglia appena acquistato. Ripetere disidratazione con etanolo anidro tre volte. </li><li> Porre i campioni disidratati in acetato di isoamile, un reagente di sostituzione per punto essiccazione critico, per 10 min. Ripetere questa operazione due volte. Questo reagente evapora rapidamente e il campione può diventare secca, con conseguente distruzione dalla tensione superficiale. Pertanto, non asciugare completamente il campione. </li><li> Dopo l&#39;ultimo scambio di acetato isoamile, rimuovere la maggior parte del solvente, immediatamente avvolgere la fiala di vetro aperto con un foglio di alluminio, e posizionare il flacone in ghiaccio secco. Utilizzando un ago o una pinza sottile, fare diversi fori nella pellicola che copre la bocca del flacone, in modo che l&#39;anidride carbonica liquida scorre facilmente nel flaconcino nel punto dryer critica. Passare alla fase successivail più rapidamente possibile. </li><li> In questa fase, ridurre al minimo il riporto di acetato isoamile nella camera del phon, ma non lasciare che il campione asciughi completamente prima del punto di essiccazione critico. Inoltre, non lasciare il campione sul ghiaccio secco per un tempo inutilmente lungo per evitare la formazione di brina sulla fiala. </li><li> Trasferire le fiale di vetro imballati in pellicola contenenti i campioni di tessuto nel punto dryer critico che assicura la struttura superficiale del tessuto rimane intatto mentre l&#39;acqua contenuta nella rimozione del tessuto. Informazioni dettagliate sul funzionamento del punto asciugatrice critica può essere ottenuto dalle istruzioni del produttore. </li><li> Maneggiare con cura i campioni con uno stuzzicadenti per ridurre al minimo i danni meccanici. I campioni di tessuto derivanti secche sono fragili. Montare i campioni sul stub metallo e cappotto d&#39;oro-palladio utilizzando una polverizzazione ionica. </li></ol> 5. Osservazione al SEM <ol><li> Osservare da SEM e registrare immagini con una fotocamera digitaleattrezzato per microscopio elettronico a scansione. </li><li> Trasferire i dati delle immagini digitali ad un PC per l&#39;analisi. </li></ol>

<ol><li>Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+ciliary+motility+on+choroid+plexus+epithelial+cells+during+the+perinatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period.</a> Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).</li>
<li>Bisgrove, B. W., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+cilia+in+developmental+disorders+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The roles of cilia in developmental disorders and disease.</a> Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).</li>
<li>Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+cilia+go+bad%3A+cilia+defects+and+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).</li>
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<li>Shah, A. S., Ben-Shahar, Y., Moninger, T. O., Kline, J. N., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motile+cilia+of+human+airway+epithelia+are+chemosensory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory.</a> Science(New York, N.Y). 325 (5944), 1131-1134 (2009).</li>
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<li>Narita, K., Kozuka-Hata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+multiple+primary+cilia+reveals+a+novel+mode+of+ciliary+development+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of multiple primary cilia reveals a novel mode of ciliary development in mammals.</a> Biology Open. 1 (8), 815-825 (2012).</li>
<li>Takeda, S., Narita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+vertebrate+cilia%2C+towards+a+new+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+Research+in+Biological+Diversity%22%5BJournal%5D)">Structure and function of vertebrate cilia, towards a new taxonomy.</a> Differentiation; Research in Biological Diversity. 83 (2), S4-S11 (2012).</li>
<li>Ikegami, K., Sato, S., Nakamura, K., Ostrowski, L. E., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+polyglutamylation+is+essential+for+airway+ciliary+function+through+the+regulation+of+beating+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tubulin polyglutamylation is essential for airway ciliary function through the regulation of beating asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (23), 10490-10495 (2010).</li>
<li>Foster, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+ciliary%2Fflagellar+beating+of+Chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the ciliary/flagellar beating of Chlamydomonas.</a> Methods in Cell Biology. 91, 173-239 (2009).</li>
<li>Lechtreck, K. -F., Sanderson, M. J., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+digital+imaging+of+ependymal+cilia+in+the+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain.</a> Methods in Cell Biology. 91, 255-264 (2009).</li>
<li>Okada, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+nodal+cilia+movement+and+measurement+of+nodal+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Observation of nodal cilia movement and measurement of nodal flow.</a> Methods in Cell Biology. 91, 265-285 (2009).</li>
<li>Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beat+pattern+is+associated+with+specific+ultrastructural+defects+in+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).</li>
<li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetry+and+kinesin+superfamily+protein+KIF3A%3A+new+insights+in+determination+of+laterality+and+mesoderm+induction+by+kif3A-%2F-+mice+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetry and kinesin superfamily protein KIF3A: new insights in determination of laterality and mesoderm induction by kif3A-/- mice analysis.</a> The Journal of Cell Biology. 145 (4), 825-836 (1999).</li>
<li>Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolarity+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 27, 137-138A (1965).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. Questo lavoro si propone di riferire metodologia dettagliata per osservare la motilità delle ciglia in isolate tessuti plesso coroide. Novità scientifiche sono stati riportati in studi precedenti 1,8.

Prospettive di questo metodo Sebbene la tecnica qui descritta non fornisce un&#39;analisi più dettagliata delle ciglia rispetto ai metodi precedentemente pubblicati, il significato di questa tecnica risiede nella semplicità del sistema ed economicità, che può essere facilmente applicato a qualsiasi tipo di screening di motilità ciliare ex vivo. In particolare, TI Workbench fornisce un&#39;interfaccia semplice e user-friendly che consente ai ricercatori di osservare e analizzare la m...

Le ciglia sono sporgenze simili a peli sulla superficie della maggior parte delle cellule dei vertebrati, che hanno attirato l'attenzione dei ricercatori medici a causa di una classe di malattie chiamate ciliopatie 2-4. Nonostante l'espressione ubiquitaria dell'organello, è stata riportata un'ampia varietà di funzioni ciliari, tra cui la motilità e il biosensing. Ad esempio, le ciglia mobili sulla superficie mucoepiteliale trasportano il muco5 e i detriti epiteliali allo sbocco dei tratti, prevenendo così la malattia liberando la superficie dagli epiteli. Inoltre, durante i primi periodi di sviluppo e gli stadi embrionali, le ciglia regolano la proliferazione delle cellule staminali6 e sono coinvolte nella determinazione dell'asimmetria sinistra-destra del corpo dei vertebrati7. 
Le cellule epiteliali del plesso coroideo (CPEC) sono derivati delle cellule neuroepiteliali che ricoprono la superficie del tessuto del plesso coroideo nel cervello, che svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi dell'ambiente intracranico attraverso la produzione di liquido cerebrospinale (CSF). È stato precedentemente dimostrato che le CPEC hanno più ciglia non mobili che regolano la produzione di CSF attraverso recettori accoppiati a proteine G che sono specificamente concentrati sulle ciglia8. Sebbene queste ciglia fossero state considerate come ciglia quiescenti non mobili, è stato scoperto che alcune ciglia CPEC mostrano una motilità transitoria durante il periodo neonatale1. Questa scoperta è stata molto importante perché ha rivelato che le cosiddette ciglia non mobili non sono necessariamente immobili fin dall'inizio dello sviluppo e potrebbero mostrare una motilità transitoria durante specifiche finestre temporali, possibilmente in risposta a specifiche richieste e funzioni fisiologiche9. Per descrivere con precisione la natura mobile delle ciglia CPEC, è necessario sviluppare un sistema di osservazione ex vivo che comprenda l'analisi dei profili cinetici unici delle ciglia CPEC. 
Per quanto riguarda la motilità, sebbene diversi rapporti tecnici abbiano descritto osservazioni delle ciglia mobili dell'epitelio tracheale5,10, dei flagelli monocellulari mobili11, delle cosiddette ciglia mobili convenzionali12 e delle ciglia nodali13, i metodi analitici dettagliati applicabili a strutture relativamente ondulate come il plesso coroideo non sono stati finora ben documentati. Inoltre, è richiesta un'elevata risoluzione temporale per analizzare il movimento ciliare dei CPEC, in cui sono indispensabili costose telecamere ad alta velocità. Per aggirare questa necessità e semplificare il monitoraggio della motilità ciliare di vari tipi di cellule, è stata introdotta una telecamera a basso costo e ad alta velocità, ed è stato sviluppato un metodo facilmente accessibile e conveniente per registrare la motilità delle ciglia mobili, in particolare per descrivere la velocità e il modello di movimento di ciascun cilio1. Inoltre, è stato utilizzato il software di analisi delle immagini originale "TI Workbench" per facilitare l'analisi dettagliata della motilità. Nel complesso, questo metodo fornisce una nuova strategia concisa per analizzare il movimento ciliare insieme alla microscopia elettronica a scansione correlativa (SEM), che può essere adottata in un'ampia gamma di ricerche sul ciglio.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenti richiesti</td></tr><tr><td colspan="4">per imaging di cellule vive</td></tr><tr><td>etanolo</td><td>Wako Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">per preparazione SEM</td></tr><tr><td>etanolo</td><td>Wako Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr> Soluzione <tr><td>salina bilanciata di Hank</td><td>Life Technologies</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeide</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldeide&nbsp;</td><td>Nacalai tesque</td><td>17003-05</td><td></td></tr><tr><td>acetato di isoamile</td><td>Nacalai tesque</td><td>02710-95</td><td></td></tr><tr><td>setacci molecolari 4A 1/8&nbsp;</td><td>Wako Chemicals</td><td>130-08655</td><td>per la preparazione di soluzione salina tampone fosfato etanolo anidro</td></tr><tr><td>(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>tampone fosfato, 0,1 M</td><td></td><td></td><td>Per fare 100 ml, mescolare 19,0 ml di 0,1&nbsp; M NaH2PO4 e 81,0 ml di 0,1&nbsp; M Na2HPO4</td></tr><tr><td>monosodium phosphate (dihydrate)</td><td>Nacalai tesque</td><td>31718-15</td><td></td></tr><tr><td>fosfato disodico (anidro)</td><td>Nacalai tesque</td><td>31801-05</td><td></td></tr><tr><td>suclose</td><td>Nacalai tesque</td><td>30406-25</td><td></td></tr><tr><td>tetrossido di osmio</td><td>Nisshin EM</td><td>300</td><td></td></tr><tr><td>ghiaccio</td><td></td><td></td><td></td> secco</tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Strumenti e materiali per la dissezione</td></tr><tr><td colspan="4">per l'imaging dal vivo e la preparazione del SEM</td></tr><tr><td>stereomicroscopio</td><td>Tovagliolo</td><td></td> di carta piatto Olympus SZX7<td></td></tr><tr><td></td>&Phi;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Piatto</td><td></td><td></td><td></td>di plastica da 10 cm</tr><tr><td>Bicchiere</td><td></td><td></td><td></td>da 100 ml</tr><tr><td>Forbici operative diritte</td><td>Sansyo</td><td>S-2B</td><td></td></tr><tr><td>Pinza per orologiaio</td><td>Dumont</td><td>No.DU-3 o -4, INOX</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">per imaging di cellule vive</td></tr><tr><td>piatto con fondo in vetro</td><td>Matsunami Glass</td><td>D110300</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">per preparazione SEM</td></tr><tr><td>alminum fiala</td><td></td><td></td><td></td></tr> di <tr><td>vetro da 5 ml con tappo in polietilene</td><td>Pipetta di trasferimento Nichiden Rika-Glass</td><td>PS-5A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Samco Scientific</td><td>SM251-1S</td><td>per trasferimento di campioni</td></tr><tr><td>stuzzicadenti</td><td></td><td></td><td>per trasferimento di campioni</td></tr><tr><td>sputtering ionico con oro-palladio</td><td>Hitachi</td><td>Essiccatore per punti critici E-1030</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hitachi</td><td>HCP-2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Attrezzature e materiali microscopici</td></tr><tr><td colspan="4">per imaging di cellule vive</td></tr><tr><td>reverse microscopio</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>100 W alloggiamento e alimentatore per grumi di mercurio</td><td>Olympus</td><td>U-ULH e BH2-RFL-T3</td><td></td></tr><tr><td>100 W</td> lampada al mercurio <td>Ushio</td><td>USH103D</td><td></td></tr><tr><td>condensatore DIC, n.a. 0,55</td><td>Olympus</td><td>IX-LWUCD</td><td></td></tr><tr><td>otturatore elettrico</td><td>Vincent Associates</td><td>VS35S22M1R3-24 e VMM-D1</td> otturatore <td>manuale possono essere utilizzati.</td></tr><tr><td>filtro passa-banda (400-700&nbsp; nm, &Phi; 45&nbsp; mm)</td><td>Koshin Kagaku</td><td>C10-110621-1</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ND (&Phi; 45 mm)</td><td>Olympus</td><td>45ND6, 45ND25</td><td>combinazione di filtri ND 25% e 6% sono utilizzati</td></tr><tr><td>obiettivo lente (immersione in acqua) con elemento DIC</td><td>Olympus</td><td>UApo 40XW/340, n.a., 1.15 con videocamera ad alta velocità IX-DPAO40</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Allied Vision Technologies</td><td>GE680</td><td>&#8805; 200 Hz di frame rate e 1 msec di tempo di esposizione</td></tr>, <tr><td>software di acquisizione/analisi delle immagini</td>, <td>software TI</td><td>Workbench,</td><td>in grado di acquisire a frame rate elevati.</td></tr><tr><td>PC per il controllo / analisi della telecamera</td><td>Tavolo</td> di isolamento dalle vibrazioni Apple <td>Mac Pro</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Meiritsu Seiki</td><td>AD0806</td><td></td></tr><tr><td>peso per tessuti</td><td>Warner Instruments</td><td>kit di ancoraggio a fette</td><td>Può essere realizzato con rete di nylon incollata a forma di U schiacciata e Phi; 0,5&nbsp; mm filo di platino.</td></tr><tr><td>vetro di copertura (peso alternativo per il tessuto)</td><td>Matsunami</td><td>su ordinazione</td><td>Un vetro di copertura può essere utilizzato come peso del tessuto.</td></tr><tr><td colspan="4">for SEM</td></tr><tr><td>reverse microscopio</td> elettronico <td>a scansione Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td></td><td>JEOL</td><td>JSM-6510</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;osservazione del movimento ciliare delle cellule epiteliali del plesso coroide<em&gt; ex vivo</em

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Il plesso coroideo si trova nella parete ventricolare del cervello, la cui funzione principale si ritiene sia la produzione di liquido cerebrospinale. Le cellule epiteliali del plesso coroideo (CPEC) che ricoprono la superficie del tessuto del plesso coroideo ospitano più ciglia uniche, ma la maggior parte delle funzioni di queste ciglia rimane da studiare. Per scoprire la funzione delle ciglia CPEC con particolare riferimento alla loro motilità, è stato sviluppato un sistema di osservazione ex vivo per monitorare la motilità ciliare durante i periodi embrionali, perinatali e postnatali. Il plesso coroideo è stato sezionato dal ventricolo cerebrale e osservato con un microscopio a contrasto potenziato da video dotato di ottiche a contrasto di interferenza differenziale. In questa condizione, è stato sviluppato un metodo semplice e quantitativo per analizzare i profili mobili delle ciglia CPEC per diverse ore ex vivo. Successivamente, i cambiamenti morfologici delle ciglia durante lo sviluppo sono stati osservati mediante microscopia elettronica a scansione per chiarire la relazione tra la maturità morfologica delle ciglia e la motilità. È interessante notare che questo metodo potrebbe delineare i cambiamenti nel numero e nella lunghezza delle ciglia, che hanno raggiunto il picco al giorno postnatale (P) 2, mentre la frequenza del battito ha raggiunto un massimo a P10, seguito da una brusca interruzione a P14. Queste tecniche consentiranno di chiarire le funzioni delle ciglia in vari tessuti. Mentre le tecniche correlate sono state pubblicate in un precedente rapporto1, il presente studio si concentra su tecniche dettagliate per osservare la motilità e la morfologia delle ciglia CPEC ex vivo.

Una panoramica del flusso di lavoro è mostrata in Figura 1, comprese le immagini dei dispositivi. Osservazioni dal vivo di movimento di CPECs Film 1 mostra un film di CPECs isolati da un topo perinatale e film 2 mostra una vista espansa delle immagini in film 1. Va notato che i singoli suggerimenti ciliari sono meno chiari in immagini fisse rispetto a quelli in film. La Figura 2 ...

In questo studio, una tecnica dettagliata di microscopia ottica è stata ottimizzata per l'osservazione e l'analisi in tempo reale del movimento delle ciglia CPEC ex vivo insieme a un metodo di microscopia elettronica per l'analisi ultrastrutturale.

L&#39;osservazione del movimento ciliare delle cellule epiteliali del plesso coroide<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare il movimento delle cellule epiteliali del plesso coroideo, ciglia ex vivo. Questo viene ottenuto innanzitutto rimuovendo il cervello da un embrione o da un cucciolo di topo per isolare il tessuto del plesso coroideo. Il movimento ciliare viene visualizzato mediante microscopia a contrasto di interferenza differenziale, o microscopia DIC, e successivamente viene acquisito un filmato digitale delle estremità dei cigli per il tracciamento manuale delle posizioni delle punte ciliari.Infine, i movimenti della punta ricostituiti delle ciglia vengono classificati e quantificati in base ai modelli dei loro movimenti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nella biologia cellulare, come ad esempio: come viene controllata la mortalità delle ciglia durante lo sviluppo e come cambia nel tempo il modello di mobilità? Le implicazioni di queste tecniche si estendono all'analisi e alla diagnosi patofisiologiche.Le malattie associate alla Siria, poiché le nostre conoscenze fondamentali sulla cinetica della Siria sono ancora limitate. Iniziare posizionando un topo neonato sciacquato con etanolo al 70%, con la testa in liebovitz L 15, mezzo freddo su ghiaccio, in una piastra sterile da 10 centimetri immediatamente dopo la decapitazione. Successivamente, utilizzare un paio di pinzette da orologiaio per rimuovere il cuoio capelluto dal cranio.Quindi aprire il cranio mediante sezione mediana lungo la sutura longitudinale per esporre l'encefalo, seguita dal taglio dei nervi cranici per prelevare l'intero organo. Trasferire l'encefalo isolato in una nuova piastra riempita con mezzo freddo e ghiaccio fresco, con la faccia dorsale rivolta verso l'alto, e posizionare la piastra sotto un microscopio stereoscopico. Successivamente, orientare il tessuto in modo che i bulbi olfattivi siano posizionati alle tre in punto e afferrare delicatamente l'encefalo con pinzette da orologiaio.Con l'altra mano, utilizzare pinze da dissezione fini per tagliare i peduncoli cerebrali che collegano gli emisferi cerebrali al tronco cerebrale. Afferrare e rimuovere il cefalone di Dion per separare ulteriormente gli emisferi e posizionare la superficie tagliata rivolta verso l'alto, quindi tirare sulla lamina affia per rimuovere il plesso coroideo ventricolare laterale attaccato al lato laterale dell'ippocampo. Una volta isolato il plesso coroideo, trasferire il tessuto in una piastra di vetro da 35 millimetri contenente mezzo fresco e posizionare un peso sul tessuto per mantenerlo delicatamente in posizione. Entro 25-60 minuti dall'eutanasia, iniziare l'immagine in tempo reale delle cellule epiteliali del plesso coroideo, regolando manualmente la messa a fuoco della lente obiettivo.Regolare il condensatore in modo che il centro e il fuoco corrispondano all'illuminazione Kula. Quindi inserire gli elementi ottici appropriati nel percorso della luce per adattarli all'ottica DIC. Spostare il prisma DIC per regolare il contrasto delle immagini in una posizione in cui la struttura superficiale del tessuto risulti chiaramente riconoscibile.Quindi commutare il percorso della luce sulla videocamera e aumentare la potenza luminosa. Dopo aver rimosso i filtri neutri, regolare un campo di osservazione e la messa a fuoco, impostando la risoluzione temporale della videocamera a 200 hertz e il tempo di esposizione a 0,1 millisecondi per il periodo di acquisizione desiderato. Successivamente acquisire le immagini; una volta ottenuto lo stack di immagini, ogni singolo fotogramma mostrerà un'immagine chiara della Celia, permettendo di tracciare manualmente i modelli di battito di ciascun ciglio.Utilizzare il puntatore del mouse per segnare la posizione delle punte cigliari in ogni fotogramma. Quindi, mediante un software appropriato, analizzare i dati delle traiettorie e classificare le traiettorie in una delle due modalità di movimento: avanti e indietro oppure rotazionale, a occhio nudo. Utilizzando la formula, calcolare la frequenza di battito cigliare per più cicli di battito cigliare.Poiché altre ciglia sulla stessa cellula possono interferire con il movimento di ciascun ciglio. Successivamente, per analizzare l'uniformità angolare degli assi del battito cigliare all'interno di una singola cellula. Per le traiettorie avanti e indietro, adattare le posizioni delle estremità delle ciglia a una linea retta, definendo theta come l'angolo che tale linea forma con l'asse X.Per le traiettorie rotazionali, adattare le posizioni a un'ellisse definendo theta come l'angolo che l'asse maggiore dell'ellisse forma con l'asse x. Infine, per una descrizione quantitativa di ciascuna traiettoria, ruotare le traiettorie di theta e definire i loro rapporti di aspetto come i rapporti tra le larghezze della loro distribuzione lungo gli assi x e y. In questo primo filmato, viene mostrata una vista dall'alto delle cellule epiteliali del plesso coroideo con Celia, ottenuta da un topo di due giorni dopo la nascita e acquisita mediante microscopia video ad alta velocità; la superficie irregolare del tessuto del plesso coroideo risulta visibile sia nel piano a fuoco che in quelli fuori fuoco.In questo secondo filmato, viene mostrata una vista ingrandita dell'area evidenziata nel filmato precedente, che permette un'osservazione più dettagliata dei movimenti rotazionali e di andata e ritorno esibiti dal singolo ciglio. Qui vengono presentate le traiettorie dei movimenti rappresentativi dell'estremità ciliare ricostruite da registrazioni video su più cicli, con l'andamento temporale delle coordinate x e y delle posizioni dell'estremità riportato nei grafici. Per dimostrare uno sfasamento tra le due coordinate in questi grafici, le coordinate x e y sono state normalizzate e sovrapposte.Mentre i CLIA mobili sono facilmente riconoscibili mediante imaging in tempo reale, non è altrettanto semplice identificare i CLIA non mobili con questo metodo. Per superare tale difficoltà, la microscopia elettronica a scansione può risultare indispensabile per ottenere immagini complete dei clia indipendentemente dalla loro motilità. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di effettuare la dissezione tempestivamente, in modo da preservare la freschezza del campione e mantenere la motilità di Syria.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare campioni di tessuto con cereale virale, nonché di come monitorare e quantificare la mortalità del CX vivo.

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L'osservazione del movimento ciliare delle cellule epiteliali del plesso coroide

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