Roditore cervello microiniezione di studio molecolare substrati di Motivato Behavior

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre accuratamente una cannula e micro iniettori, nonché di eseguire correttamente la microiniezione. Ciò si ottiene producendo prima una cannula di una lunghezza appropriata. Il secondo passo è tagliare e assemblare i micro iniettori.

Quindi, preparare micro iniettori, tubi e una pompa per la microiniezione. Il passaggio finale consiste nel completare la microiniezione e lasciare passare un periodo di diffusione. In definitiva, la microiniezione viene utilizzata per iniettare accuratamente i reagenti nella regione cerebrale desiderata dimostrando una corretta manipolazione.

Durante la microiniezione sarà Ryan Poland, uno studente del mio laboratorio. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è necessario prestare particolare attenzione e tutti i passaggi richiedono grande attenzione per garantire il corretto posizionamento della cannula e la posizione della microiniezione. Per preparare prima la cannula, disegna una linea di riferimento di 15 millimetri sul nastro usando una penna a punta fine.

Quindi usalo come guida per contrassegnare le sezioni da 15 millimetri in sequenza sul tubo con un pennarello indelebile affilato. Quindi intagliare il tubo della cannula toccandolo con il disco da taglio a rotazione lenta dell'utensile rotante. Nei punti contrassegnati, ruotare la cannula di 180 gradi e intagliare il lato opposto del tubo.

Non tagliare completamente il tubo perché potrebbe portare all'occlusione. Successivamente, piegare bruscamente il tubo in modo da spezzarlo in sezioni di 15 millimetri. Quindi tenere ciascuna estremità della cannula perpendicolare al disco di taglio tra il pollice e l'indice.

Ruotare il tubo della cannula toccando la punta sulla superficie del disco di taglio per generare una punta smussata. Successivamente, alesare entrambe le estremità della cannula con un ago smussato calibro 26 per assicurarsi che tutte le sbavature siano state rimosse e che la cannula non sia ostruita. Per preparare l'otturatore bloccare una cannula a circa metà lunghezza con emostatici dritti di peso medio, appoggiare l'emostatico bloccato sul banco in modo che la cannula sia perpendicolare al banco.

Quindi inserire un'estremità del filo dell'atomizzatore nella cannula fino a raggiungere il banco. Piegare il filo pizzicando con le dita fino a raggiungere un angolo di 30 gradi mantenendo il contatto tra l'otturatore e il banco. Successivamente, rimuovere il filo dalla cannula e tagliare la parte in eccesso a 2,5 millimetri dalla curva con un piccolo tronchese diagonale.

In questa procedura, tenere un'estremità del tubo del microiniettore perpendicolarmente con un emostatico dritto bloccato. Attorcigliare un emostatico mantenendo la tensione sul tubo e avvolgerlo strettamente attorno all'emostatico almeno una volta. Quindi, misurare 32 millimetri dall'estremità libera opposta del tubo del microiniettore e afferrare questo punto perpendicolarmente con un secondo emostato.

Piegare il tubo avanti e indietro mantenendo la tensione fino a quando non si rompe. Quindi ispezionare il tubo del microiniettore per assicurarsi che entrambe le estremità siano diritte e che il diametro interno non sia ostruito. Disegna una linea di riferimento di cinque millimetri sul metro a nastro e segna sezioni di cinque millimetri di tubo della cannula in sequenza usando un pennarello indelebile.

Quindi, toccare il tubo della cannula con il disco di taglio a rotazione lenta nei punti contrassegnati per intagliare il tubo. Quindi piegare bruscamente il tubo del collare del micro iniettore per spezzarlo in sezioni di cinque millimetri. Far scorrere un collare su ciascun tubo del micro iniettore a circa due centimetri dall'estremità.

Applicare una piccola quantità di super colla sul tubo del micro iniettore a cinque millimetri da un'estremità. Quindi, fai scorrere il collare sul cordone di super colla in modo che si trovi a un millimetro dall'estremità del tubo di microiniezione. Dopodiché, copri entrambe le estremità del colletto con la colla.

Quindi collegare un ago calibro 26 alla siringa da un millilitro riempita con acqua sterile. E fai scorrere il pezzo di otto centimetri del tubo di plastica del micro iniettore sull'ago, assicurandoti di non forare il tubo dopo aver fatto scorrere l'altra estremità del tubo di plastica sull'estremità del colletto del micro iniettore essiccato. Spingere lo stantuffo della siringa riempito d'acqua per verificare la presenza di brevetto C.In questo passaggio, piegare il micro iniettore completato a 15 millimetri dall'estremità opposta al collare di 95 gradi.

Quindi, tagliare il tubo di plastica a 70 centimetri e farlo scorrere sul collare del micro iniettore. Per preparare la pompa per la microiniezione, impostare sul tubo il diametro dell'ago per microiniezione, la velocità di infusione desiderata e il volume di iniezione target. Quindi impostare la modalità pompa su volume in modo che venga erogato automaticamente un volume preciso.

Quindi, regolare l'arresto della pompa per consentire il riempimento della siringa fino al volume di iniezione più altri 0,2 microlitri. Ora posiziona la punta della siringa a tenuta stagna nell'acqua sterile contenuta in una piccola barchetta di siero di latte e agita delicatamente lo stantuffo per lubrificare uniformemente il filo interno. Tirare lo stantuffo verso l'arresto posteriore della pompa per riempire d'acqua l'ago per microiniezione.

Prossima diapositiva. Il tubo in PE 20 è collegato al microiniettore su un ago calibro 26 collegato a una siringa sterile riempita d'acqua da un millilitro. Spruzzare acqua sterile attraverso il microiniettore e ispezionare il ventaglio di spruzzatura e la distanza.

Quindi posizionare un microiniettore sterilizzato su un campo sterile. Far scorrere il tubo fuori dall'ago, tagliare il tubo sotto l'area danneggiata dall'ago mantenendolo in posizione verticale per evitare che l'acqua goccioli. Quindi, spingere leggermente in avanti lo stantuffo della siringa del micro iniettore per creare una gocciolina all'estremità dell'ago e far scorrere il tubo in PE 20 riempito d'acqua sull'ago.

Successivamente, spingere lo stantuffo completamente in avanti per prepararsi al caricamento del campione e assicurarsi che non rimangano tracce di etanolo nel microiniettore. Controllare l'impostazione per verificare la presenza di perdite toccando alcune volte la goccia d'acqua che si forma sulla punta del microiniettore con un panno da laboratorio pulito. Quindi tirare indietro lo stantuffo della siringa di 0,2 microlitri per creare una bolla tra l'acqua sterile e il tubo in PE 20 e la soluzione da iniettare.

Successivamente, posizionare il microiniettore nel reagente da iniettare e tirare lentamente lo stantuffo della siringa fino all'arresto posteriore. Per preparare l'animale per l'iniezione, tenere il torace del ratto contro il torace dello sperimentatore. Pulire l'area intorno alla cannula con un applicatore di cotone imbevuto di Betadine.

Tamponare il cappuccio della testa tre volte con Betadine e poi tamponare con etanolo due volte. Quindi posizionare il micro iniettore riempito nella cannula. Premere start sulla pompa di microiniezione e monitorare il movimento della bolla.

Al termine dell'iniezione, rimuovere il micro iniettore dalla cannula e sostituirlo con l'otturatore. Questa figura mostra la trasfezione della regione degli astrociti del nucleo accumbens da parte di un virus microiniettato, e questa figura mostra la riduzione della motivazione dei ratti ad autosomministrarsi etanolo attivando un transgene che era sovraespresso nel nucleo accumbens. L'attivazione dei siti degli astrociti principali di dread mediante somministrazione sistemica di CNO ha ridotto significativamente la motivazione dei ratti ad autosomministrarsi etanolo dopo l'astinenza rispetto al CNO veicolo, che non ha avuto alcun effetto in una coorte ugualmente addestrata che esprimeva GFP invece del temuto che una volta padroneggiato.

Questa tecnica può consentire strumenti di microiniezione cerebrale personalizzati e un'ulteriore flessibilità delle procedure sperimentali. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la posizione precisa della microiniezione è fondamentale per ottenere l'effetto desiderato.