Un riferimento brodo di microdiluizione per Dalbavancina In Vitro Test della Sensibilità di batteri che crescono aerobico

L'obiettivo generale della seguente procedura è determinare la concentrazione inibitoria minima per la dalbavancina. Utilizzando il metodo di microdiluizione del brodo con particolare attenzione ai passaggi chiave che sono unici per Dalbavancin per fare questo. La diluizione madre e intermedia della dalbavancina viene effettuata in DMSO e la diluizione finale viene effettuata in catione su brodo di Mueller Hinton regolato integrato con polisorbato.

La diluizione viene dispensata in una piastra a 96 pozzetti e inoculata con una sospensione standardizzata di batteri. La piastra viene quindi incubata per 16-24 ore ed esaminata per determinare la quantità minima di dalbavancina necessaria per inibire la crescita batterica. L'adesione a questo metodo standardizzato garantirà risultati coerenti con entrambi gli isolati clinici e, come mostrato qui, gli isolati di controllo qualità Dalbavancina è un agente antimicrobico lipo glicopeptidico semisintetico che è stato approvato nel maggio 2014 dalla FDA per il trattamento delle infezioni batteriche acute della pelle e della struttura della pelle causate da organismi gram-positivi.

Questo metodo descrive il metodo standardizzato di suscettibilità alla micro-diluizione del brodo per la dassin, che include l'uso del DMSO per la preparazione di soluzioni madre in polisorbato 80 per alleviare l'aderenza dell'agente alla plastica La dimostrazione visiva di questo metodo è utile. Poiché le fasi di preparazione della soluzione madre e della piastra MIC non sono tipiche rispetto alla maggior parte degli agenti antimicrobici. Questi passaggi sono unici per gli agenti glicopeptidici lipo e sono importanti da seguire per ottenere risultati MIC riproducibili e accurati.

A dimostrare la procedura sarà Gina Fisher, una ricercatrice del mio laboratorio. Si prega di notare che quando si esegue la seguente procedura devono essere utilizzate precauzioni di sicurezza appropriate coerenti con il livello di biosicurezza due. Iniziare pesando la quantità appropriata di dalbavancina per preparare una soluzione madre di 800 microgrammi per millilitro.

Aggiungere la quantità appropriata di NEAT DMSO in un tubo sterile di vetro o plastica, quindi trasferire la polvere nel tubo e agitarlo. Prossimo. Utilizzando la soluzione madre di DALBAVANCINA da 800 microgrammi per millilitro, preparare 100 concentrazioni finali di MIC su piastra come mostrato nelle colonne da uno a quattro. Queste sono indicate come concentrazioni intermedie.

Il volume totale preparato dipenderà dal numero di pannelli MIC. Infine, diluire le concentrazioni intermedie da uno a 100 in brodo di Mueller Hinten non aggiustato per cationi, noto anche come C-A-M-H-B, integrato con 0,004% di P 80. La concentrazione di lavoro risultante di DALBAVANCINA e P 80 è il doppio della concentrazione finale.

Poiché l'aggiunta di inoculo comporterà una diluizione da uno a due utilizzando una pipetta multicanale con puntali sterili, erogare 50 microlitri di ciascuna diluizione di dalbavancina nei pozzetti appropriati del pannello di microdiluizione sterile a 96 pozzetti. Il formato della piastra MIC consente di testare otto inoculari per piastra. Se i pannelli non verranno utilizzati immediatamente, applicare una pellicola di plastica per sigillarli, quindi metterli in sacchetti di plastica e conservarli in un congelatore non sbrinabile ad almeno meno 60 gradi Celsius fino a quando non saranno necessari.

In questa dimostrazione, verrà inoculata una piastra appena preparata. Per preparare l'inoculo, selezionare diverse colonie ben isolate da una trivella per il sangue da 18 a 24 ore o da un'altra coclea non selettiva. Qui vengono utilizzati ceppi callosi aria e EPHI per il controllo di qualità.

Toccare la parte superiore di ogni colonia con un tampone sterile e trasferirne una parte in una provetta contenente da uno a cinque millilitri di C-A-M-H-B o soluzione fisiologica. Continuare a trasferire fino a quando la torbidità non corrisponde a uno standard di McFarland di 0,5 entro 15-30 minuti dalla preparazione, diluire l'inoculo da uno a 100 in C-A-M-H-B per arrivare a una concentrazione finale di cinque volte da 10 a 5 CFU per millilitro. L'intervallo accettabile è compreso tra due e otto volte 10 e il quinto CFU per millilitro.

Utilizzando immediatamente una pipetta multicanale con puntali sterili, trasferire 50 microlitri dell'inoculo finale in ciascun pozzetto appropriato della piastra del pannello MIC qui. Quattro file vengono inoculate con ciascuno dei due isolati per un totale di quattro repliche per isolato. Successivamente, per eseguire un controllo della purezza, utilizzare una pipetta per trasferire da uno a 10 microlitri della soluzione nel controllo positivo della crescita in un agar non selettivo, come l'agar di soia try decay con il 5% di sangue di pecora.

Utilizzare un anello sterile per distribuire la soluzione sulla superficie della piastra. Ruotare la piastra di 90 gradi e strisciare di nuovo per assicurarsi che l'inoculo sia distribuito uniformemente. Coprite il piatto e mettetelo da parte.

In preparazione per una conta delle colonie, utilizzare una pipetta a canale singolo per trasferire 10 microlitri della soluzione nel pozzetto di controllo della crescita a 10 millilitri di miscela salina, quindi trasferire 100 microlitri in un terreno agricolo non selettivo adatto, come provare l'agar di soia con il 5% di sangue di pecora utilizzando un circuito sterile, distribuire la soluzione su tutta la superficie agricola. Ripetere questo processo due volte in direzioni diverse per garantire una distribuzione uniforme dell'inoculo. Quindi, impila fino a quattro pannelli MIC in un contenitore di plastica assicurandoti che il pannello superiore sia ben sigillato con un coperchio.

Quindi posizionare un tovagliolo di carta umido all'interno del contenitore di plastica e chiuderlo saldamente con il coperchio entro 30 minuti dall'inoculazione. Incubare i pannelli MIC, la piastra per il conteggio delle colonie e la piastra per il controllo della purezza in un incubatore ad aria ambiente a 35 gradi Celsius più o meno per 16-20 ore. Il giorno successivo, leggere la concentrazione inibitoria minima come la concentrazione più bassa che inibisce completamente la crescita batterica nei pozzetti rilevata ad occhio nudo.

Determina il numero di colonie sulla targhetta di conteggio delle colonie. Moltiplicare il numero contato per il fattore di diluizione. Ad esempio, 50 colonie moltiplicate per un fattore di diluizione di 10.000 equivalgono a cinque volte 10 per la quinta CFU per millilitro.

Un intervallo accettabile è compreso tra 20 e 80 colonie, che equivale a due o otto volte 10 per la quinta unità formante colonie per ml. La concentrazione dell'inoculo è una variabile importante per controllare il test di suscettibilità al fine di ottenere risultati accurati. Infine, controlla la targhetta di purezza.

Se tutte le colonie sono simili alle colonie usate come inoculo, allora può essere considerato puro. Se sono presenti altre colonie, è possibile che sia presente un contaminante nel pannello MIC e il test deve essere ripetuto. I risultati del DAL bevans, MIC sono stati confrontati con quelli ottenuti utilizzando il metodo dell'agridiluizione, come mostrato qui.

I risultati dell'Agri MIC per i Dal bevan sono in genere da due a otto volte superiori a quelli del brodo. Micro diluizione, risultati MIC. Questo contrasto vancomicina risulta, che sono da brodo e metodi agricoli.

Pertanto, l'agri diluizione non è raccomandata per il test del brodo di dalbavancina dalbavancina. Micro diluizione MIC, i risultati per il controllo di qualità dovrebbero rientrare negli intervalli previsti, come mostrato qui. L'organismo di controllo della qualità SS, A TCC 2 9 2 1 3 con una MIC modale molto chiara di 0,06 microgrammi per millilitro, è stato un buon indicatore della variazione del metodo.

Se i risultati ottenuti sono al di fuori degli intervalli previsti per gli organismi di controllo della qualità o tendono al limite inferiore o alto dell'intervallo, è necessaria un'ulteriore convalida del metodo. Oltre a convalidare il metodo utilizzando organismi di controllo qualità, dalbavancina, i dati MIC provenienti da programmi regionali di sorveglianza antimicrobica possono fornire una base per i risultati MIC da aspettarsi in ambito clinico di laboratorio, come mostrato qui, Dal b Anson MIC, i risultati per gli isolati raccolti in Europa e negli Stati Uniti dal 2011 al 2013 sono stati inferiori a 0,25 microgrammi per millilitro per il 99,9% delle SIU e il 100% degli streptococchi. Sulla base di questi dati di sorveglianza, è evidente che i risultati della MIC con dalbavancina per stafilococchi e streptococchi superiori a 0,12 microgrammi per millilitro sono rari.

Se si osservano numeri più alti, il test deve essere ripetuto e/o inviato a un laboratorio di riferimento per la convalida. La preparazione della diluizione madre in DMSO e l'aggiunta di P 80 alla diluizione del brodo a una concentrazione dello 0,002% nel pozzetto finale della MIC sono i passaggi critici per ottenere risultati accurati e riproducibili della MIC della dalbavancina Come sempre, ma soprattutto in quest'area dello sviluppo della resistenza batterica, risultati accurati della suscettibilità antimicrobica sono fondamentali per la scelta della terapia appropriata da parte del medico.