Name: Limbare Approccio-sottoretinico iniezione di vettori virali per la terapia genica nei topi retina epitelio pigmentato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Impara la tecnica di iniezione sottoretinica per la terapia genica nell'epitelio pigmentato retinico dei topi. Questo metodo utilizza vettori virali per il trasferimento genico efficace e riproducibile.

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Questo studio è stato sostenuto dal Seoul National University Research di Grant (800-20140542), il Programma Pioneer Research di NRF / MEST (2012-0009544), e la Bio-Signal Analysis Tecnologia Programma Innovazione NRF / MEST (2009-0090895), e la concessione di NRF / MEST (2015M3A9E6028949).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con l&#39;Associazione per la Ricerca e la Visione e Oftalmologia Dichiarazione per l&#39;uso di animali in Oftalmica e Vision Research, e le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali dell&#39;Università Istituzionale e Usa Comitato Nazionale di Seul e Seoul National University Hospital Comitato Biosicurezza. 1. Preparazione Kit iniezione e vettori virali <ol><li> Preparare la siringa microlitro dotata di un ago smussato 33 G sterilizzato con ossido di etilene. Diluire i vettori virali in PBS per il titolo adeguata nel tubicino (cioè, 1 x 10 6 TU / ml). Lavare la siringa più volte con vettori virali per rimuovere qualsiasi spazio morto nella siringa. </li></ol> 2. Iniezione sottoretinico di vettori virali <ol><li> Anestetizzare i topi adulti (cioè, 6 - 8 settimane) con una iniezione intraperitoneale di miscela di tiletamine e zolazepam (1: 1, 2,25 mg / kg di peso corporeo) e xilazina cloridrato (0,7 mg / kg di peso corporeo) o un regime di anestesia valida alternativa. </li><li> Dilatare gli alunni con un collirio di fenilefrina 0,5% e tropicamide 0,5%. </li><li> Preparare la siringa microlitro caricando con 1,5 - 2 ml di vettori virali. </li><li> Aprire la palpebra e l&#39;occhio sporgente per esporre l&#39;equatore per l&#39;iniezione comoda e mettere a fuoco sotto il microscopio operatorio. Mantenere la posizione dell&#39;occhio sporgeva fino a terminare l&#39;iniezione, o spostamento dell&#39;ago può verificarsi durante l&#39;iniezione. Per mantenere il bulbo oculare con fermezza, posizionare le dita al di fuori del cerchio orbitale. </li><li> Applicare una goccia di soluzione viscoelastica oftalmica alla superficie corneale. </li><li> Inserire un coperchietto scorrevole rotonda sulla parte superiore della cornea per visualizzare la retina. </li><li> Puntura un piccolo foro in lieve posteriormente al limbus usando una sterile 30 G 1/2 ago per l&#39;ulteriore iniezione sottoretinica. Effettuare il foro inferiore for l&#39;occhio destro e superiore per l&#39;occhio sinistro per la comodità. NOTA: Se il foro viene effettuata a temporali o nasale, è difficile da coprire con la palpebra dopo l&#39;iniezione. Foratura iniziale sia reso leggermente posteriormente al limbus per evitare i vasi limbal che corrono lungo il limbus e facilmente riconoscibili. Fare attenzione a non colpire l&#39;obiettivo con ago rendendo la foratura iniziale. Non inserire l&#39;intera smussatura dell&#39;ago per evitare lente foratura. </li><li> Posizionare l&#39;ago senza punta 33 G della siringa microlitro attraverso il foro pre-forata e avvicinare l&#39;ago nello spazio sottoretinico fino al punto in cui la resistenza mite si fa sentire. NOTA: Per l&#39;iniezione sottoretinica, il miglior angolo di attacco dell&#39;ago è di circa 45 gradi contro piano iris, e l&#39;ago smussato deve essere inserito posteriormente verso zona peripapillare. Piazza tratteggiata indica il percorso dell&#39;ago suggerito attraverso la cavità vitrea per la injectio sottoretinicon in figura 1. NOTA: Non ci sarà alcuna resistenza provato quando penetrante (o scomparsa) degli strati retinici in quanto sono molto morbidi. Così, la prima sensazione di resistenza lieve indica che l&#39;ago ha già accennato strato RPE e l&#39;inserimento dell&#39;ago deve essere fermato. Fare attenzione a non penetrare il tessuto sclerale con eccessiva pressione perché l&#39;ago deve essere posto in potenziale spazio sottoretinico. Se l&#39;ago perfora il tessuto sclerale dal potere eccessivo, entra negli spazi orbitali estrinseci senza caratteristiche di resistenza. (Questo passaggio è fondamentale) </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53030/53030fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di iniezione sottoretinica. H &amp; E sezione macchiato dell&#39;occhio del mouse raffigurante le strutture con un percorso ago per l&#39;iniezione sottoretinica marcato (un quadrato tratteggiato). Ingrandimento: 40X, bar Scala:<html> 500 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53030/53030fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="9"><li> Iniettare i vettori virali (ad esempio, 1 x 10 6 TU / mL) delicatamente nello spazio sottoretinico, senza tremori per evitare danni ai tessuti indesiderate e ritirare l&#39;ago delicatamente. Tenere il bulbo oculare saldamente durante l&#39;iniezione, come descritto al punto 2.4. </li><li> Osservare la formazione di bozza sottoretinico dopo l&#39;iniezione sotto microscopio operatorio per assicurarsi che non vi è alcun sanguinamento della retina. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53030/53030fig2.jpg" /> Figura 2. sottoretinico Belb Formazione senza retina emorragia. Vista al microscopio di belb sottoretinico dopo l&#39;iniezione sottoretinica al microscopio operatorio mostra formazione bozza successo senza emorragia retinica.m / files / ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <ol start="11"><li> Chiudere delicatamente la palpebra per coprire il sito di iniezione per l&#39;auto-sigillatura. Riportare i topi per gabbia a casa e mantenere viva fino alla valutazione. Nota: Dopo che i ricercatori abituarsi alle procedure, si possono ottenere i risultati ripetibili con procedure rapide saltando questi passaggi (2,5, 6, e 10) </li></ol> 3. Valutazione della efficacia di consegna Gene in epitelio pigmentato retinico <ol start="1"><li> Sacrificare i topi nella camera di CO 2. Enucleate gli occhi con le forbici. </li><li> Fissare gli occhi nella soluzione di paraformaldeide al 4% a 4 ° C per almeno 1 ora a qualche giorno. </li><li> Afferra la cornea con una pinza sottile e forare la cornea con micro-forbici. Rimuovere la cornea dopo forbice lungo il limbus. Rimuovere l&#39;obiettivo con una pinza. </li><li> Tagliare il corpo ciliare con mICRO-forbici permettendo il distacco della retina. Tirare delicatamente tutta la retina dal / coroide complesso RPE / sclera. Tagliare il RPE / coroide / complesso sclerale radialmente dalla periferia al centro vicino ottica nervose diverse volte per assicurarsi 4-8 foglie per il montaggio piatto. </li><li> Capovolgere il RPE / coroide / complesso sclerale per rendere lato RPE giù, e tagliare tutti gli altri tessuti a lato sclerale compresi i muscoli, congiuntiva e nervo ottico. Questo passaggio è importante fare un piano RPE / coroide / complesso sclerale perché qualsiasi tessuto rimanente rende il complesso irregolare. </li><li> Incubare il complesso con l&#39;anticorpo primario e secondario per gli scopi di ricerca specifici (optional, vedere i riferimenti per i dettagli sui metodi). Flat-montare le RPE / coroide / complessi sclerali sul vetrino e assorbire il PBS con una spugna assorbente. </li><li> Aggiungere 30 ml di soluzione di montaggio e mettere il vetrino di copertura. Osservare il campione per l&#39;efficacia della consegna vettore sotto il microscopio fluoresceina. Conservare i campioni infrigorifero per ulteriori osservazioni. </li></ol>

<ol><li>Maguire, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+gene+transfer+for+Leber%27s+congenital+amaurosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis.</a> N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).</li>
<li>Jacobson, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations%3A+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).</li>
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<li>Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+injection+of+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Intravitreal injection of therapeutic agents.</a> Retina. 29 (7), 875-912 (2009).</li>
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<li>Allocca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+adeno-associated+virus+serotypes+efficiently+transduce+murine+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors.</a> J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+transduction+of+ocular+cells+with+a+bovine+immunodeficiency+viral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector.</a> Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).</li>
<li>Rolling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapeutic+prospects+in+early+onset+of+severe+retinal+dystrophy%3A+restoration+of+vision+in+RPE65+Briard+dogs+using+an+AAV+serotype+4+vector+that+specifically+targets+the+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Mem+Acad+R+Med+Belg%22%5BJournal%5D)">Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium.</a> Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).</li>
<li>Le Meur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+vision+in+RPE65-deficient+Briard+dogs+using+an+AAV+serotype+4+vector+that+specifically+targets+the+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium.</a> Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).</li>
<li>Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+and+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors and the retina.</a> Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).</li>
<li>Puche, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+factors+associated+with+reticular+pseudodrusen+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration.</a> Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).</li>
<li>Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+for+neovascular+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration.</a> Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+amyloid+beta+alters+the+tight+junction+of+retinal+pigment+epithelium+in+5XFAD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice.</a> Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).</li>
<li>Shin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+cleavage+of+amyloid+beta+by+a+viral+protease+NIa+prevents+amyloid+beta-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity.</a> PLoS One. 9 (6), e98650(2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo articolo il video, abbiamo descritto il limbare approccio tecnica di iniezione sottoretinica in dettaglio con risultati rappresentativi di RPE / coroide / sclerale flat-mount. Questa è una tecnica facile e conveniente per l&#39;iniezione sottoretinica di vettori virali in RPE. La visualizzazione diretta della formazione di bozza durante l&#39;iniezione è un passo importante per la consegna accurata per i principianti. Ci sono alcune tecniche di iniezione subretiniche introdotte nel Journal of Experiments Visua...

In oftalmologia, la terapia genica è emerso come la modalità di trattamento di retinopatie ereditarie monogeniche. Ci sono retinopatie ereditarie associate a geni in epitelio pigmentato retinico (RPE) compresi Leber amurosis congenita 1,2, retinite pigmentosa 3, e Coroideremia 4. Il campo di ricerca della terapia genica si sta espandendo in entrambi gli studi preclinici e sperimentazioni cliniche utilizzando vettori virali come il virus adeno -associated (AAV), lentivirus (LV) e adenovirus (Ad) 5. Vettori virali differenti hanno tropismo differente nella retina. Per una terapia genica efficace e sicuro, vettori virali devono essere attentamente selezionati secondo le cellule bersaglio e geni bersaglio. Il percorso di consegna del gene è importante anche per il trasferimento genico efficace per cellule bersaglio, quindi, deve essere scelta con attenzione pure. I due metodi più comuni per la consegna intraoculare di vettori virali sono subretiniezione inale e iniezione intravitreale 6. Quest&#39;ultimo, iniezione intravitreale, è stato ampiamente utilizzato per la somministrazione di farmaci per il trattamento di neovascolarizzazione coroidale bagnato degenerazione maculare legata all&#39;età (AMD) ed edema maculare nella retinopatia diabetica 7. Route intravitreale prevede l&#39;esposizione di vettori virali per vitreo e retina interna, ma la diffusione dei vettori di retina esterna è limitata. D&#39;altra parte, il percorso sottoretinico fornisce consegna diretta di vettori virali per lo spazio potenziale tra retina e RPE, inducendo una bozza localizzata. Pertanto, l&#39;iniezione sottoretinica attualmente è considerato un percorso più efficiente per il targeting cellule visive e RPE. In termini di approccio chirurgico, pars plana viene scelto come una zona sicura per l&#39;iniezione intravitreale per evitare danni alla retina in pazienti umani. Con la semplice modifica di questo approccio a topi, potremmo iniettare vettori virali subretinally o intravireally via approccio limbare. In questo videoarticolo, abbiamo dimostrato un metodo facile e conveniente di iniezione sottoretinica di vettori virali in topi RPE. Dopo singola puntura di posteriormente al limbus con 30 G 1/2 ago, un 33 ago G smussato siringa microlitro attrezzato si inserisce nello spazio sottoretinico attraverso il sito di puntura limbare. I vettori virali di 1,5-2 volumi microlitri vengono iniettati nello spazio potenziale tra retina e RPE indurre blebs subretiniche. Questa procedura può essere eseguita sotto visualizzazione diretta con microscopio chirurgico. Pratica ripetuta garantirà risultati replicabili anche senza la visualizzazione diretta della formazione bozza. Questo aiuterà i ricercatori a condurre esperimenti accurati e risparmio di tempo per la consegna del gene nei topi sottoretinico RPE.

<table><tbody><tr><td>PINZE DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0,1 x 0,06 mm PUNTE</td><td>WPI</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>VANNAS Forbici S/S, 105 mm</td><td>WPI</td><td>555583S</td><td></td></tr><tr><td>33 G Ago smussato</td><td>WPI</td><td>NF33BL-2</td><td></td></tr><tr><td>Siringa NanoFil, 10 microlitri&nbsp;</td><td>KIT WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>RPE-KIT</td><td>WPI</td><td>RPE-KIT</td><td>Per una facile iniezione con una sola mano</td></tr><tr><td>30 G x 1/2 (0,3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Ago</td><td>BD</td><td>305107</td><td>Puntura iniziale per iniezione sottoretinica</td></tr><tr><td>Occhiali di copertura per microscopio (n. 1 diametro 3 mm)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0720&nbsp; (CS-3R)</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio operatorio Leica</td><td></td><td>Leica LM M80</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluoreseceina</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>Thermo scientific</td><td>TMO. LV-CTR</td><td>Utilizzato per diluire i vettori</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td>Utilizzato per diluire i vettori</td></tr><tr><td>Troperina (Fenilefrina 0,5% - Tropicamide 0,5%)</td><td>Hanmi</td><td></td><td>Per dilatazione</td></tr><tr><td>Proparacaina cloridrato Soluzione oftalmica USP, 0,5% (sterile)</td><td>Bausch& Lomb</td><td></td><td>Per anestesia topica</td></tr><tr><td>Healon GV OVD</td><td>Abbott Medical Optics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoletil 50 (ipocloruro di tiletamina e ipocloruro di zolazepam)</td><td>Virbac</td><td></td><td>Per anestesia generale</td></tr><tr><td>Iniezione di Rompun (xilazina HCl)</td><td>Bayer</td><td></td><td>Per anestesia generale</td></tr></tbody></table>

limbare approccio-sottoretinico iniezione di vettori virali per la terapia genica nei topi retina epitelio pigmentato

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

L'occhio è un organo piccolo e chiuso, il che lo rende un bersaglio ideale per la terapia genica. Recentemente sono state applicate varie strategie alla terapia genica nelle retinopatie utilizzando il rilascio genico non virale e virale alla retina e all'epitelio pigmentato retinico (RPE). L'iniezione sottoretinica è l'approccio migliore per fornire vettori virali direttamente alle cellule RPE. Prima della sperimentazione clinica di una terapia genica, è inevitabile validare l'efficacia della terapia in modelli animali di varie retinopatie. Pertanto, l'iniezione sottoretinica nei topi diventa una tecnica fondamentale per una terapia genica oculare. In questo protocollo, forniamo la tecnica semplice e replicabile per l'iniezione sottoretinica di vettori virali a topi sperimentali. Questa tecnica è modificata dall'iniezione intravitreale, che è una tecnica ampiamente utilizzata nelle cliniche oftalmologiche. I risultati rappresentativi del complesso RPE/coroide/sclerale a montaggio piatto aiuteranno a comprendere l'efficacia di questa tecnica e a regolare il volume e il titolo dei vettori virali per l'entità della trasduzione genica.

Per valutare l&#39;efficacia dell&#39;iniezione sottoretinica sulla trasduzione genica virale da questo protocollo, abbiamo utilizzato in commercio vettori LV con CMV promoter esprime sia GFP e RFP per l&#39;indicatore. Gli occhi sono stati enucleato dopo il periodo di tempo appropriato in base allo scopo di ricerca. Per i risultati rappresentativi, gli occhi sono stati enucleati 10 settimane e 20 settimane dopo l&#39;iniezione sottoretinica. Dopo la rimozione completa della retina con il metodo sopra descritto, l&#39;a...

L'iniezione sottoretinica è una tecnica chirurgica per la consegna efficace di geni all'epitelio pigmentato retinico nell'occhio del topo. Qui descriviamo un metodo semplice e replicabile per l'iniezione sottoretinica di vettori virali nell'epitelio pigmentato retinico in topi sperimentali.

Limbare Approccio-sottoretinico iniezione di vettori virali per la terapia genica nei topi retina epitelio pigmentato

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è consegnare un gene bersaglio nell'epitelio pigmentato retinico di un topo vivo. Questo viene ottenuto innanzitutto aprendo la palpebra ed esponendo il bulbo oculare per visualizzare l'equatore. I passaggi successivi prevedono la creazione di un piccolo foro posto posteriormente rispetto al limbo.Iniettare i vettori virali nello spazio sottoretinico utilizzando un ago smussato ed osservare la formazione di un bleb sottoretinico. Infine, si utilizza la microscopia a immunofluorescenza per mostrare l'espressione dei marcatori fluorescenti consegnati dal virus iniettato nell'epitelio pigmentato della retina. Questa è una tecnica EEG e conveniente per l'iniezione sottoretinica di vettori virali nell'epitelio pigmentato retinico.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i test di iniezione sottoretinica sono difficili da eseguire per i principianti. Per prima cosa, preparare una siringa microlitrica con un ago smussato da 33 gauge, sterilizzandolo mediante gas di ossido di etilene.Successivamente, preparare una diluizione dei vettori virali in PBS in un tubo da microcentrifuga a circa 1 milione di unità di titolo per microlitro. Ora, durante il caricamento della siringa, sciacquarla più volte con la soluzione per rimuovere qualsiasi spazio morto presente nella siringa. Preparare da 1,5 a due microlitri da iniettare con l'iniezione del vettore virale.Preparare un topo adulto anestetizzato mediante iniezione intraperitoneale di diazepam lenta e verificare che l'animale sia stato anestetizzato mediante l'assenza di riflessi. Una volta confermata l'anestesia, dilatare le pupille con una goccia di fenilefrina 0,5% e idé. Ora, sotto un microscopio operatorio, aprire la palpebra ed estrarre l'occhio. Per esporre l'equatore.Tenere l'occhio in questa posizione posizionando le dita al di fuori del margine orbitale. Successivamente, applicare una soluzione oftalmica viscoelastica sulla superficie corneale e posizionare un piccolo vetrino rotondo sulla cornea. In questo modo la retina può essere osservata leggermente in posizione posteriore rispetto al limbo e in posizione inferiore nell'occhio destro o superiore nell'occhio sinistro.Utilizzare un ago sterile da 30 gauge e mezzo per creare un piccolo foro posizionato in sede temporale o nasale. I fori non sono una scelta ideale poiché sono difficili da coprire. Durante la puntura, evitare di colpire il vaso limbale o il cristallino e non inserire l'intera lunghezza dell'ago per le iniezioni sottoretiniche.Inserire l'ago per l'iniezione del vettore attraverso il foro con un angolo di 45 gradi rispetto al piano dell'iride. Spingere l'ago in direzione posteriore verso la zona peripapillare. Seguire il percorso delimitato per attraversare la cavità vitrea.Avvicinare l'ago allo spazio subretinico fino a quando si avverte una lieve resistenza, segno che è stato raggiunto lo strato dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). Non penetrare il tessuto sclerale con pressione eccessiva, poiché l'ago deve essere posizionato nello spazio subretinico potenziale. Se l'ago perfora il tessuto sclerale con troppa forza, entra nello spazio orbitario extraoculare senza incontrare resistenza. Iniettare ora delicatamente il vettore virale nello spazio subretinico.Mantenere l'ago completamente fermo per evitare danni ai tessuti, il che è di fondamentale importanza. Quindi ritirare l'ago con altrettanta delicatezza. Ora è possibile rilasciare il bulbo oculare.Deve essere visibile un'effusione subretinica indicativa dell'accumulo del vettore. Infine, chiudere delicatamente la palpebra per coprire il sito di iniezione. La chiusura ermetica del foro avverrà spontaneamente.Per valutare il trasferimento genico, sacrificare i topi mediante asfissia con anidride carbonica, dopo averne confermato l'eutanasia. Enucleare gli occhi utilizzando forbici. Fissare gli occhi in PFA al 4% a quattro gradi Celsius per almeno un'ora, ma preferibilmente per alcuni giorni.Afferrare e forare la cornea utilizzando pinze e microbisturi. Quindi tagliare lungo il limbo per rimuovere la cornea dopo la sua asportazione. Utilizzare le pinze per rimuovere il cristallino.Successivamente, tagliare il corpo ciliare. Poi estrarre interamente la retina dal complesso RPE Coroide Sclera dopo la rimozione della retina. Tagliare il complesso radialmente dalla periferia verso il centro, vicino al nervo ottico, in modo da ottenere da quattro a otto forme simili a petali e rendere la struttura piatta per il montaggio.Ora, capovolgere il complesso con il lato RPE rivolto verso il basso e rimuovere tutti i tessuti residui sul lato sclerale, inclusi i muscoli, la congiuntiva e il nervo ottico. Questo permette di ottenere un preparato piatto del complesso RPE-sclera da montare su un vetrino. Assorbire il PBS in eccesso con una spugna assorbente.Applicare circa 30 microlitri di mezzo di montaggio e coprire con un coprioggetto il complesso. Conservare il vetrino a quattro gradi Celsius quando non viene osservato. Utilizzando il protocollo descritto, un vettore virale disponibile in commercio con promotori CMV che esprime sia GFP che RFP è stato iniettato.Gli occhi sono stati enucleati dopo 10 settimane e sono state preparate vetrini con il pigmento epiteliale retinico (RPE) in montaggio piatto. Le intensità del segnale di GFP e RFP variavano tra le cellule del RPE nel sito di iniezione, e la trasduzione era limitata alla zona in cui si era formata l'emorragia da iniezione. Aumentando l'ingrandimento da quattro DX a 400 x è stato possibile valutare la patologia dell'I con una risoluzione ancora maggiore.Sebbene non mostrato qui, le cellule transdotte esprimevano il vettore anche 36 settimane dopo l'iniezione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque minuti se effettuata correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di inserire l'ago in modo preciso e mirato nello spazio sottoretinico dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'oftalmologia per esplorare la terapia genica come trattamento per patologie ereditarie monogeniche alla nascita e per la degenerazione maculare legata all'età.

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Questa tecnica chirurgica illustra l'iniezione di vettori di terapia genica e cellule staminali nello spazio sottoretinico dell'occhio mouse.

Iniezione sottoretinico di vettori di terapia genica e cellule staminali nel Eye mouse

Fonte: Park, S. W., et al. Approccio limbare-Iniezione sottoretinica di vettori virali per la terapia genica nell'epitelio pigmentato retinico di topi. J. Vis. Exp. (2015)Il video descrive il metodo per l'iniezione sottoretinica di vettori virali nell'epitelio pigmentato retinico (RPE) in un modello murino. Descrive in dettaglio la procedura, dall'anestesia e dalla preparazione degli occhi alla consegna precisa del vettore lentivirale, garantendo l'integrazione e l'espressione genica nell'EPR.

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Qui presentiamo un protocollo accettato dalla comunità in formato multimediale per l'iniezione sottoretinica di un bolo di cellule RPE in ratti e topi. Questo approccio può essere utilizzato per determinare i potenziali di salvataggio, i profili di sicurezza e le capacità di sopravvivenza delle cellule RPE trapiantate dopo l'impianto in modelli animali di degenerazione retinica.

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Un metodo alternativo e validate iniezione per l&#39;accesso ai sottoretinico Spazio<i&gt; via</i&gt; Un approccio Transcleral posteriore

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In questo manoscritto, l'iniezione subcongiuntivale è dimostrata come un valido metodo di somministrazione vettoriale per i tessuti oculari nei topi utilizzando un sistema di iniezione costituito da una pompa a siringa per infusione/prelievo e una siringa rimovibile a tenuta di gas accoppiata con aghi di microiniezione. Questo sistema di iniezione è adattabile anche ad altre vie di somministrazione intraoculare.

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Limbare Approccio-sottoretinico iniezione di vettori virali per la terapia genica nei topi retina epitelio pigmentato

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