Molecular Probe Optimization per determinare mortalità delle cellule in un organismo fotosintetico ( Microcystis aeruginosa) In citometria a flusso
January 29th, 2016
Popolazioni microbiche contengono eterogeneità delle cellule sostanziale, che può dettare il comportamento generale. Analisi della sonda molecolare attraverso citometria a flusso in grado di determinare stati fisiologici di cellule, ma la sua applicazione varia tra le specie. Questo studio fornisce un protocollo per determinare con precisione la mortalità delle cellule all'interno di una popolazione cianobatterio, senza sottovalutare o la registrazione di risultati falsi positivi.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dimostrare come creare un protocollo in grado di analizzare efficacemente lo stato fisiologico cianobatterico, utilizzando la citometria a flusso e le sonde molecolari. Questo protocollo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla fisiologia cellulare delle comunità microbiche. Il vantaggio principale di questa procedura è che un protocollo ottimizzato della sonda fluorescente è in grado di distinguere in tempo reale gli stati fisiologici dei cianobatteri a livello di singola cellula.
A dimostrare questa procedura sarà David Hartnell, uno studente di dottorato che lavora nel laboratorio di citometria dell'Università di Bournemouth. Prima di iniziare l'esperimento, posizionare una provetta per emolisi vuota sulla sonda di iniezione del campione. Fare clic su Sblocca.
E poi risciacquare di nuovo per avviare il processo di pulizia con citometria a flusso. Al termine del risciacquo, caricare una nuova provetta per emolisi contenente due millilitri di acqua filtrata ultra pura sulla sonda di iniezione del campione, o SIP, e impostare il limite di tempo su 10-15 minuti e la velocità fluidica su veloce. Quindi, seleziona una nuova cella dati e imposta le soglie di fluorescenza e diffusione della luce pertinenti per ridurre il rumore di fondo.
Quindi fare clic su Esegui. Se il totale degli eventi al secondo non è inferiore alle raccomandazioni del produttore, far scorrere due millilitri di soluzione decontaminante per due minuti a velocità rapida. E ripeti i passaggi di risciacquo posteriore e di risciacquo con acqua ultra pura.
Per preparare una monocoltura primaria di M.aeruginosa, autoclavare in autoclave 98 millilitri di acqua filtrata ultra pura, miscelata con due millilitri di terreno algale, in un becher da 250 millilitri per 20 minuti a 120 gradi Celsius. Quando una coltura si trova in un'alta densità allo stato stazionario, disaggregare due millilitri di cellule mediante vortex. E poi trasferire le cellule sotto la sonda di iniezione del campione.
Verificare che le cellule siano disperse uniformemente mediante microscopia ottica. Quindi selezionare un grafico a istogramma sul software del citometro a flusso per registrare i dati di diffusione della luce in avanti. Fare clic su log per visualizzare i dati in una scala logaritmica sull'asse x.
In un'uscita separata, impostare un altro istogramma dell'asse logaritmico per registrare la fluorescenza naturale delle cellule di M.aeruginosa. Quindi, seleziona una fonte di luce in grado di eccitare la ficocianina e un rivelatore in grado di filtrare le emissioni dalla fluorescenza risultante. Per registrare alla massima risoluzione, selezionare le impostazioni più vicine alla dimensione del nucleo dell'organismo target.
E imposta una portata relativamente lenta. Prima di acquisire i dati, impostare una soglia per escludere qualsiasi segnale di dispersione della luce e di fluorescenza causato dal rumore di fondo elettronico o dai detriti del campione cellulare. Quindi selezionare una nuova cella di dati.
Creare un grafico di densità con i parametri di dispersione diretta e laterale su una scala logaritmica e fare clic su Esegui. Ora applica la diffusione della luce diretta e il gate di fluorescenza naturale ai dati di dispersione diretta per escludere qualsiasi segnale di dispersione di basso livello e per includere solo i segnali di fluorescenza relativa più alta della ficocianina. Quindi raccogliere gli eventi fino al completamento del campione e utilizzare i dati per determinare il conteggio iniziale delle cellule.
Per ottimizzare l'assorbimento delle cellule della sonda molecolare, esporre metà della monocoltura precedentemente preparata alle condizioni appropriate per generare un controllo morto. Controllare le variazioni nel microambiente campione per confermare la morte della coltura. E poi disaggregare la formazione della colonia come appena dimostrato.
Quindi, seleziona un laser a 488 nanometri insieme a un rivelatore in grado di registrare la fluorescenza dalle sonde di acido nucleico verde e arancione. E il laser a 640 nanometri per registrare i segnali di ficocianina attraverso i rispettivi rivelatori. In una nuova scheda tecnica, impostare un grafico di densità con i parametri di dispersione diretta e laterale.
Quindi creare un istogramma utilizzando il rispettivo canale del rivelatore ottico della sonda molecolare. Un istogramma per rilevare le emissioni di ficocianina e un istogramma per gli eventi di dispersione diretta, il tutto su scala logaritmica. Eseguire i campioni di cianobatteri utilizzando diverse concentrazioni e tempi di incubazione.
Crea un gate nell'istogramma di dispersione in avanti per includere gli eventi solo con le dimensioni della cellula dell'organismo bersaglio. E applicarlo al canale della sonda di fluorescenza corrispondente. Successivamente, nel canale della sonda a fluorescenza, creare un altro gate software inclusivo contro il picco più alto dell'istogramma.
E successivamente porta la fluorescenza della sonda positiva corrispondente sul grafico di densità. Confrontare il numero di segnali di fluorescenza con il numero di cellule di controllo morte, dove la percentuale più alta di assorbimento della sonda nucleica cellulare non produce colorazione non specifica. Per testare la sovrapposizione dell'interferenza di fluorescenza da colorazione cellulare intrinseca o aspecifica, selezionare il 50% di dati vivi e il 50% di dati morti in coltura mista.
E rimuovere i cancelli fluorescenti. Applicare i gate per includere solo l'istogramma di dispersione diretta per le dimensioni cellulari dell'organismo bersaglio sull'istogramma del canale della ficocianina. Controllando i picchi di ficocianina più alti e più bassi ed etichettandoli rispettivamente vivi e morti.
Quindi applicare separatamente le porte ai segnali di ficocianina viva e morta. E registra entrambe le lunghezze d'onda medie. Per determinare la sensibilità del protocollo, confrontare le lunghezze d'onda medie della fluorescenza della sonda molecolare morta positiva e il segnale live intrinseco non specifico.
Infine, selezionare il protocollo ottimizzato in cui è stata colorata la maggior quantità di cellule morte senza il verificarsi di colorazione non specifica. In questi grafici, sono mostrati gli output rappresentativi di diffusione della luce diretta e laterale, per le dimensioni cellulari e la complessità interna di una coltura batch di M.aeruginosa in fase esponenziale. Il gating può essere eseguito affinando i dati tra determinati punti dell'uscita di diffusione della luce in avanti.
La ficocianina produce un segnale forte quando viene interrogata da una sorgente di luce rossa, che può essere utilizzata per controllare ulteriormente le popolazioni di interesse. Dalla diffusione della luce diretta e dai segnali fluorescenti, i dati possono quindi essere trasferiti dall'output originale ai dati specifici sul campione di M.aeruginosa per la conta finale delle cellule. Quando si mescolano controlli con pigmentazione più alta e pigmentazione più bassa morti, lo spostamento decrescente della fluorescenza automatica diventa chiaro.
Nelle cellule compromesse dalla membrana, le sonde di acido nucleico producono un segnale aggiuntivo che può essere osservato mediante citometria a flusso e ulteriormente confermato dalla microscopia a epifluorescenza. La discriminazione della fluorescenza tra cellule vive e morte aumenta con il tempo tra le concentrazioni micromolari di 0,05 e 0,5, ma diminuisce tra le concentrazioni di uno e 100 micromolari per entrambe le sonde. Infatti, la concentrazione ottimale per la sonda dell'acido nucleico verde sembra essere di 0,5 micromolari con un tempo di incubazione di 30 minuti.
Per la sonda per acido nucleico arancione, la concentrazione ottimale è un micromolare per un'incubazione di 10 minuti. Una volta padroneggiata, per ogni sonda molecolare, l'ottimizzazione può essere completata in un giorno, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere le sonde in un ambiente stabile, alle condizioni di temperatura, pH e luce appropriate.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia per esplorare l'eterogeneità delle comunità nel fitoplancton. Dopo aver visto il video, ora dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare un protocollo ottimale per valutare la fisiologia cellulare utilizzando la citometria a flusso e le sonde molecolari. Non dimenticare che lavorare con sonde molecolari e organismi tossici può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni come indossare il DPI appropriato e avere la piena comprensione dei materiali COSHH.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per analizzare gli stati fisiologici dei cianobatteri utilizzando la citometria a flusso e sonde molecolari. Il metodo mira a determinare accuratamente la mortalità cellulare all'interno delle popolazioni microbiche, affrontando le sfide nella eterogeneità cellulare.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Microbiologia
- Biologia cellulare
- Citometria a flusso
Contesto
- Le popolazioni microbiche mostrano una significativa eterogeneità cellulare.
- La citometria a flusso può valutare gli stati fisiologici ma varia a seconda della specie.
- Una misurazione accurata della mortalità cellulare è cruciale per comprendere le comunità microbiche.
- Le sonde fluorescenti ottimizzate possono migliorare l'analisi a livello di singola cellula.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo affidabile per valutare la fisiologia dei cianobatteri.
- Migliorare l'accuratezza della determinazione della mortalità cellulare.
- Facilitare l'analisi in tempo reale degli stati fisiologici nei cianobatteri.
Metodi utilizzati
- Citometria a flusso per l'analisi cellulare.
- Sonde molecolari per distinguere gli stati fisiologici.
- Ottimizzazione del protocollo per risultati accurati.
- Dimostrazione da parte di uno studente di dottorato in un laboratorio di citometria.
Risultati principali
- Il protocollo differenzia efficacemente gli stati fisiologici nei cianobatteri.
- È stata ottenuta una determinazione accurata della mortalità cellulare.
- L'analisi in tempo reale ha fornito informazioni sul comportamento microbico.
- I risultati supportano la comprensione delle popolazioni di cianobatteri.
Conclude
- Il protocollo sviluppato migliora l'analisi della fisiologia dei cianobatteri.
- Affronta i limiti precedenti nella misurazione della mortalità cellulare.
- Questo metodo può essere applicato a vari studi microbici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Accurate assessment of cellular viability in microbial systems supports early-stage target validation by enabling reliable phenotypic screening and mechanistic de-risking. Flow cytometry with optimized molecular probes provides quantitative, single-cell resolution data that improves predictive confidence in lead identification campaigns. This approach addresses heterogeneity challenges in discovery biology, facilitating data-driven go/no-go decisions and reducing late-stage biological risk in antimicrobial or anti-infective pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by distinguishing viable from non-viable cells in microbial populations.
- Operational Value: Supports functional target validation through membrane integrity assessment using SYTOX Green and SYTOX Orange probes.
- Predictive Value: Optimized probe concentrations (0.5 µM green, 1.0 µM orange) minimize false negatives and non-specific staining, enhancing assay reliability.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible fluorescence readouts for high-throughput compound screening in antimicrobial discovery.
- Quantitative Output: Enables precise measurement of probe uptake as a dependent variable for dose-response modeling.
- Scalability: Protocol optimization in Microcystis aeruginosa provides a transferable framework for other cyanobacterial or microbial systems.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports preclinical modeling of antimicrobial efficacy by quantifying compound-induced mortality in target pathogens.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase viability screening to preclinical validation through consistent, flow cytometry-based endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces mechanistic ambiguity in lead optimization by providing real-time, single-cell physiological data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing mechanistic insights that inform compound progression decisions.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by correlating compound treatment with changes in cellular viability.
- Screening: Delivers assay standardization and reproducibility through optimized probe incubation and concentration parameters.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence measurements enabling statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking membrane integrity readouts to compound mechanism of action.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cytometry platform applicable across microbial targets in anti-infective programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false viability readings through probe optimization.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories via defined probe concentrations and incubation times.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of compounds lacking target-specific activity.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying compounds with genuine antimicrobial effects versus assay artifacts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry operation and fluorescence compensation for multi-parameter detection.
- Dependent on access to flow cytometers with 488 nm laser compatibility and appropriate detection channels for SYTOX dyes.
- Necessitates cross-team protocol standardization to ensure consistent probe handling, storage, and application.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to Gram-positive or Gram-negative bacterial models.
- Includes practical limitations such as probe toxicity and the need for biosafety containment when working with toxic organisms like Microcystis aeruginosa.
