Molecular Probe Optimization per determinare mortalità delle cellule in un organismo fotosintetico (

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come creare un protocollo in grado di analizzare efficacemente lo stato fisiologico dei cianobatteri, utilizzando la citometria a flusso e sonde molecolari. Questo protocollo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla fisiologia cellulare delle comunità microbiche. Il principale vantaggio di questa procedura è che un protocollo ottimizzato con sonde fluorescenti può distinguere tra gli stati fisiologici dei cianobatteri a livello cellulare individuale in tempo reale.

La dimostrazione di questa procedura sarà effettuata da David Hartnell, uno studente di dottorato che lavora nel laboratorio di citometria dell'Università di Bournemouth. Prima di iniziare l'esperimento, posizionare un tubo per emolisi vuoto sulla sonda di iniezione del campione. Fare clic su sblocca.

Quindi eseguire un lavaggio inverso per avviare il processo di pulizia della citometria a flusso. Al termine del lavaggio inverso, caricare un nuovo tubo di emolisi contenente due millilitri di acqua ultrapura filtrata sulla sonda di iniezione del campione, o SIP, e impostare il limite di tempo tra 10 e 15 minuti e la velocità fluidica su veloce. Successivamente, selezionare una nuova cella dati e impostare le soglie di fluorescenza e di scattering della luce pertinenti per ridurre il rumore di fondo.

Quindi fare clic su esegui. Se il numero totale di eventi al secondo non è inferiore alla raccomandazione del produttore, eseguire due millilitri di soluzione di decontaminazione per due minuti alla velocità massima. Ripetere quindi i passaggi di retrosciacquo e di sciacquo con acqua ultrapura.

Per preparare una coltura pura primaria di M.aeruginosa, sterilizzare in autoclave 98 millilitri di acqua filtrata ultrapura, mescolati con due millilitri di mezzo algale, in un becher da 250 millilitri per 20 minuti a 120 gradi Celsius. Quando una coltura ha raggiunto una densità stazionaria elevata, disperdere due millilitri di cellule mediante vortex. Successivamente, trasferire le cellule sotto la sonda di iniezione del campione.

Verificare che le cellule siano uniformemente disperse mediante microscopia ottica. Quindi selezionare un istogramma nel software del citometro a flusso per registrare i dati di scattering della luce in avanti. E fare clic su log per visualizzare i dati in scala logaritmica sull'asse x.

In un'uscita separata, impostare un altro istogramma con asse logaritmico per registrare la fluorescenza naturale delle cellule di M.aeruginosa. Successivamente, selezionare una sorgente luminosa in grado di eccitare la ficocianina e un rivelatore che possa filtrare le emissioni derivanti dalla fluorescenza risultante. Per la registrazione con la massima risoluzione, selezionare le impostazioni più vicine alla dimensione del nucleo dell'organismo bersaglio.

Impostare una velocità di flusso relativamente lenta. Prima di acquisire i dati, impostare una soglia per escludere qualsiasi segnale di scattering della luce e di fluorescenza causato dal rumore di fondo elettronico o dai detriti del campione cellulare. Quindi selezionare una nuova cella dati.

Creare un grafico di densità con i parametri di scattering anteriore e laterale su scala logaritmica e fare clic su esegui. Applicare quindi la finestra di selezione dello scattering anteriore e della fluorescenza naturale ai dati di scattering anteriore rispetto a quello laterale per escludere eventuali segnali di scattering a basso livello e includere solo i segnali di fluorescenza relativa più elevati della ficocianina. Successivamente, raccogliere gli eventi fino al termine del campione e utilizzare i dati per determinare il conteggio iniziale delle cellule.

Per ottimizzare l'assorbimento cellulare della sonda molecolare, esporre metà della monocultura precedentemente preparata alle condizioni appropriate per generare un controllo di morte. Verificare le variazioni nel microambiente del campione per confermare la morte della coltura. Successivamente, disgregare la formazione delle colonie come appena dimostrato.

Successivamente, selezionare un laser a 488 nanometri insieme a un rilevatore in grado di registrare la fluorescenza delle sonde per gli acidi nucleici verdi e arancioni. E utilizzare il laser a 640 nanometri per registrare i segnali della ficocianina attraverso i rispettivi rilevatori. In un nuovo foglio dati, creare un grafico di densità con i parametri di scattering anteriore e laterale.

Quindi creare un istogramma utilizzando il canale del rilevatore ottico del rispettivo sonda molecolare. Un istogramma per rilevare le emissioni della ficocianina e un istogramma per gli eventi di scattering in avanti, entrambi su scala logaritmica. Eseguire i campioni di cianobatteri utilizzando diverse concentrazioni e tempi di incubazione.

Crea un'area di selezione nell'istogramma dello scatter in avanti per includere solo gli eventi con dimensioni cellulari dell'organismo bersaglio. Applicala quindi al canale corrispondente della sonda fluorescente. Successivamente, nel canale della sonda fluorescente, crea un'altra area di selezione software inclusiva rispetto al picco più alto nell'istogramma.

E successivamente selezionare la corrispondente fluorescenza positiva della sonda nel grafico di densità. Confrontare il numero di segnali fluorescenti con il numero di cellule di controllo morte, in cui la percentuale più alta di assorbimento della sonda nucleica non produce colorazione non specifica. Per verificare l'interferenza fluorescente dovuta all'overlap proveniente dalla colorazione intrinseca o non specifica delle cellule, selezionare i dati della coltura mista al 50 percento di cellule vive e al 50 percento di cellule morte.

E rimuovere i gate fluorescenti. Applicare i gate in modo da includere solo l'istogramma dello scattering in avanti per la dimensione cellulare dell'organismo bersaglio sull'istogramma del canale della ficocianina. Delimitare i picchi più alto e più basso della ficocianina e denominarli rispettivamente "vivo" e "morto".

Applicare quindi separatamente i gate ai segnali di ficocianina delle cellule vive e morte ed eseguire la registrazione di entrambe le lunghezze d'onda medie. Per determinare la sensibilità del protocollo, calcolare il rapporto tra le lunghezze d'onda medie della fluorescenza del marcatore molecolare positivo per le cellule morte e del segnale intrinseco non specifico delle cellule vive.

Infine, selezionare il protocollo ottimizzato in cui è stata rilevata la quantità massima di cellule morte senza la comparsa di colorazione non specifica. In questi grafici, sono mostrati i risultati rappresentativi della diffusione della luce in avanti e laterale, relativi alle dimensioni cellulari e alla complessità interna di una coltura batch di M.aeruginosa in fase esponenziale. Il gating può essere eseguito affinando i dati tra determinati punti dell'output di diffusione della luce in avanti.

La ficocianina produce un segnale intenso quando viene stimolata da una sorgente di luce rossa, che può essere utilizzata per ulteriori analisi delle popolazioni di interesse. A partire dalla diffusione della luce in avanti e dai segnali fluorescenti, i dati possono quindi essere selezionati a partire dall'output originale, ottenendo informazioni specifiche sul campione di M.aeruginosa per il conteggio finale delle cellule. Quando vengono mescolati controlli vivi ad alta pigmentazione e controlli morti a bassa pigmentazione, la riduzione dello spostamento della fluorescenza autofluorescente risulta evidente.

In cellule con membrana compromessa, le sonde per acidi nucleici producono un segnale aggiuntivo osservabile mediante citometria a flusso e ulteriormente confermabile mediante microscopia a epifluorescenza. La discriminazione della fluorescenza tra cellule vive e morte aumenta nel tempo alle concentrazioni comprese tra 0,05 e 0,5 micromolari, ma diminuisce tra 1 e 100 micromolari per entrambe le sonde. In effetti, la concentrazione ottimale per la sonda verde per acidi nucleici sembra essere di 0,5 micromolari con un tempo di incubazione di 30 minuti.

Per la sonda acida nucleica arancione, la concentrazione ottimale è di un micromolare per un'incubazione di 10 minuti. Una volta acquisita padronanza, per ciascuna sonda molecolare, l'ottimizzazione può essere completata in un giorno, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere le sonde in un ambiente stabile, alle appropriate condizioni di temperatura, pH e luce.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia per esplorare l'eterogeneità delle comunità di fitoplancton. Dopo aver visto il video, ora si dovrebbe avere una buona comprensione di come sviluppare un protocollo ottimale per valutare la fisiologia cellulare mediante citometria a flusso e sonde molecolari. Non dimenticare che lavorare con sonde molecolari e organismi tossici può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come indossare i dispositivi di protezione individuale (P.P.E.) appropriati e conoscere pienamente i materiali COSHH, devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.