Name: Terapia fotodinamica con Blended Condurre Polimero / Fullerene nanoparticelle fotosensibilizzanti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Scopri la terapia fotodinamica con nanoparticelle di polimero conduttore e fullerene per il trattamento del cancro. Questo metodo genera specie reattive dell'ossigeno per eliminare selettivamente le cellule tumorali aggressive in vitro.

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Gli autori ringraziano la National Science Foundation (NSF) per il sostegno finanziario di questo lavoro attraverso un premio CARRIERA (CBET-0746210) e attraverso il premio CBET-1159500. Vorremmo ringraziare il Dr. Turkson (Univ. of Hawaii Cancer Center) e il Dr. Altomare (Univ. of Central Florida College of Medicine) per l'assistenza con la coltura cellulare.

1. la coltura linee cellulari <ol><li> Disgelo TE 71 (cellule epiteliali del timo del mouse), MDA-MB-231 (le cellule del cancro al seno umano), A549 (le cellule tumorali del polmone umano) e OVCAR3 (cellule tumorali ovariche umane) tenendo le fiale criogeni in acqua tiepida per meno di 2 minuti . Aggiungere 10 ml supporti DMEM supplementato con 10% FBS per ciascuna linea cellulare e centrifugare per 6 min a 106 x g. </li><li> Aspirare la sospensione e aggiungere dei media da 3 ml al pellet. Mescolare le cellule correttamente pipettando più volte. Aggiungi questa soluzione cella per preriscaldata 7 ml supporti DMEM supplementato con il 10% FBS in fiaschi T75 e tenere i flaconi in atmosfera umidificata al 95% di aria / 5% di CO 2 a 37 ° C. Etichettare questo fiasco come Passage 0. </li><li> Quando la confluenza delle celle raggiunge il 80%, raccogliere le cellule da essi incubazione con tripsina 0,05% per 10 min. Neutralizzare la tripsina aggiungendo uguali quantità di materiale. Centrifugare questa soluzione per 6 min a 106 x g. Togliere la sospensione e aggiungere 3 ml mezzi freschi per esso. Mescolare well e trasferire piccola quantità (100 l) per un pallone di coltura contenente 7 ml di mezzi di comunicazione. Incubare il pallone di coltura in incubatrice. Etichettare il pallone come passaggio 1. </li><li> Cultura linee cellulari fino passo 11 o 12. </li></ol> 2. Realizzazione di nanoparticelle <ol><li> Preparazione del ~ 10 -6 M (rettificato) non diluito soluzione madre MEH-PPV <ol><li> In una fiala aggiungere 1mg Poly [2-metossi-5- (2-etilesilossi) -1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) con peso molecolare (Mn medio) 150,000-250,000 g / mol e 3 ml di tetraidrofurano (THF) . Mescolare la miscela per 2 ore durante il riscaldamento a 80 ° C su una piastra calda. </li><li> Filtrare la soluzione di cui sopra in una nuova fiala usando un filtro a siringa da 0,2 micron. Etichettare questa soluzione come &#39;MEH-PPV soluzione madre diluita&#39;. Questa soluzione sarà coinvolto nella preparazione di nanoparticelle dopo la messa a punto della concentrazione come descritto nei punti 2.1.3 e 2.1.4. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione madre MEH-PPV non diluito in 3 ml di THF. Etichettare questa soluzione come &#39;soluzione madre diluita MEH-PPV&#39;. Trasferimento a una cuvetta di quarzo 1 cm e misurare l&#39;assorbanza a 495 nm mediante spettroscopia UV-vis. </li><li> Se l&#39;assorbanza della soluzione madre MEH-PPV diluita è superiore a 0,17, diluire la soluzione madre MEH-PPV non diluito con l&#39;aggiunta di più THF 1 ml alla volta, e ripetere il punto 2.1.3 fino a quando l&#39;assorbanza misurata a 495 nm è nella gamma ,13-0,17. </li><li> Calcolare la molarità della soluzione madre MEH-PPV diluita utilizzando legge di Lambert-Beer, come illustrato di seguito. Qui 0,15 assorbanza viene utilizzato come esempio per il resto del protocollo (es., Regolare tutte le seguenti calcoli basati su assorbanza osservato), il coefficiente di estinzione MEH-PPV utilizzato è 10 7 M -1 cm -1 e la lunghezza del percorso utilizzato è 1 cm. A = ε xbxc (Eqn 1) (ε - il coefficiente di estinzione molare, A - assorbanza, b - lunghezza del percorso, c - concentrazione della soluzione) 0.15 = 10 7 M -1 cm -1 x 1 cm xc (Eqn 2) c = 1.5 x 10 -8 M (Eqn 3) Utilizzare questa concentrazione per trovare la concentrazione della soluzione madre MEH-PPV non diluito nel modo seguente: M 1 V 1 = M 2 V 2 (Eqn 4) 0,15 x 10 -7 M x 3050 ml = M 2 x 50 microlitri (Eqn 5) M 2 = 9.15 x 10 -7 M (Eqn 6) Questa è la concentrazione del &#39;rettificato diluito MEH-PPV soluzione madre&#39;. </li></ol></li><li> Calcolo di massa di MEH-PPV nella soluzione madre aggiustato MEH-PPV non diluito <ol><li> Calcolare la massa di MEH-PPV in 1 ml di soluzione madre diluita rettificato come indicato di seguito utilizzando la molarità ottenuto nella sezione 2.1.4 e il peso molecolare (M w) di MEH-PPV, che è 10 6 g / mol. M = n / V (n -. No di talpe, V - volume in L) (Eqn 7) Così, la massa di MEH-PPV in 1 ml di adeguati undiluted soluzione madre è 9,15 x 10 -4 g. </li></ol></li><li> Unendo PCBM in MEH-PPV <ol><li> Calcolare la massa di Fenil-C 61 -butyric estere metilico (PCBM) da aggiungere nella soluzione di riserva MEH-PPV di fare il 50% in peso PCBM soluzione MEH-PPV drogato, dove il 50% in peso PCBM è definito rispetto alla massa di MEH-PPV (vale a dire, la metà della massa di MEH-PPV). Usando il peso di MEH-PPV ottenuto nella sezione 2.2. Messa di PCBM / 9,15 x 10 -4 g di MEH-PPV x 100% = 50% in peso PCBM (Eqn 8) Messa di PCBM = 4,57 x 10 -4 g (Eqn 9) </li><li> Pesare 1 mg PCBM in un flaconcino e aggiungere 500 microlitri THF. Calcolare la concentrazione di PCBM in questa soluzione con il peso molecolare del PCBM come 910,88 g / mol Molarità di soluzione PCBM = 0,001 g / (910,88 g / mol * 500 microlitri) (Eqn 10) Molarità di soluzione PCBM = 2.19 x 10 -9 mol / ml (Eqn 11) </li><li> Calcolare il volume di soluzione PCBM bisogno di aggiungere alla regolare ME non diluitoH-PPV soluzione madre per ottenere la soluzione di PCBM drogato MEH-PPV del 50% in peso in THF utilizzando la molarità calcolata al punto 2.3.2 4,57 x 10 -4 g di PCBM x 1 mol / 910,88 gx 1 ml / 2.19 x 10 -9 mol = 229 microlitri (Eqn 12) Aggiungere 229 ml di soluzione PCBM in 1 ml di soluzione madre aggiustato MEH-PPV non diluito e mescolare bene. </li></ol></li><li> Preparazione di nanoparticelle con il metodo riprecipitazione <ol><li> Trasferimento 1 ml della soluzione MEH-PPV / PCBM mescolati nella siringa da 1 ml con l&#39;ago collegato ad esso. </li><li> Iniettare rapidamente 1 ml di soluzione MEH-PPV / PCBM miscelato in 4 ml di acqua deionizzata agitazione a 1.200 giri al minuto. Arrestare mescolando immediatamente dopo l&#39;iniezione. Utilizzare queste nanoparticelle come tali. </li></ol></li></ol> 3. Incubazione di linee cellulari con nanoparticelle di Imaging NOTA: Tutte le esperimenti di imaging sono stati completati nel 35 mm capsule di Petri <ol><li> Assorbimento di nanopartiCles in linee cellulari <ol><li> Linee cellulari Cultura fino al 12 ° passaggio. Al 12 ° passaggio cellule di coltura in 35 mm piastre di Petri. Regolare la concentrazione di cellule aggiunte ai 35 mm, piastre di Petri tali che, dopo 24 ore le cellule sono il 40% confluenti. </li><li> A questo punto rimuovere il supporto DMEM supplementato con il 10% FBS dalle capsule di Petri, lavare le cellule con 1x DPBS due volte, e aggiungere 100 ml di sospensione nanoparticelle in 2 ml di DMEM alle piastre di Petri. </li><li> Dopo 24 ore rimuovere il DMEM / nanoparticelle sospensione dalle piastre di Petri e lavare le cellule con 1x DPBS 3 volte. Poi fissare le cellule mediante incubazione con 4% paraformaldeide per 10 min. Lavare due volte con DPBS. Macchiare le cellule con 300 nM DAPI incubando con il colorante per 2 min. Lavare due volte con DPBS. Poi mantenere le cellule in DPBS per l&#39;imaging. </li></ol></li><li> Rilevamento di ROS <ol><li> Cultura A549 e linee cellulari OVCAR3 in piastre di Petri, 6 per la linea cellulare, come spiegato nella sezione 3.1.1. Etichettare ilPiastre Petri come mostrato nella Tabella 1. </li><li> Aggiungere 100 microlitri della sospensione nanoparticelle in 2 ml DMEM a tre delle capsule di Petri come mostrato nella Tabella 1 e incubare per 24 ore. Per le piastre di Petri che riceveranno le dosi di luce, lavare le cellule dopo 24 ore e sospendere le cellule in HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank) Dye media liberi. </li><li> Riscaldare la lampada del simulatore solare per 15 minuti. Posizionare filtro UV davanti alla lampada per filtrare la luce UV. Calibrare la lampada con una cella solare di riferimento regolando la potenza della lampada per ottenere 0,5 sole (50 mW / cm 2) intensità sulla superficie della capsula di Petri. In questa particolare configurazione che condizione è stata raggiunta con 218 W di alimentazione in dotazione alla lampada. </li><li> Porre le capsule petri sotto la lampada (coperchio aperto) per 60 min, che si traduce in un dosaggio di 180 J luce / cm 2 come mostrato nei calcoli indicati 50 mW / cm 2 x 3.600 sec / 1.000 = 180 J / cm 2 </li><li> Rimuovere HBSS e senza lavaggio aggiungere ulteriori 2 ml supporti DMEM supplementato con il 10% FBS alle piastre di Petri. Incubare le cellule per altri 2 ore. </li><li> Per il controllo positivo incubare le cellule con 100 mM di perossido di idrogeno (H 2 O 2) per 30 min. </li><li> Macchiare le cellule in tutte le capsule di Petri con una concentrazione finale di 5 mM di reagente rilevare ROS incubando le cellule con il colorante per 30 min a 37 ° C. </li><li> Fissare le cellule mediante incubazione con 4% paraformaldeide per 10 min. Lavare due volte con DPBS. Macchiare le cellule con 300 nM DAPI incubando con il colorante per 2 min. Lavare due volte con DPBS. Poi mantenere le cellule in DPBS per l&#39;imaging. </li></ol></li><li> Apoptosi e necrosi da PI e annessina V FITC <ol><li> Cultura ciascuna linea cellulare in 5 piastre di Petri. Tre di queste piastre di Petri saranno per l&#39;esperimento, mentre i restanti 2 capsule di Petri saranno campioni di controllo. Incubare le 3 capsule di Petri per sperimentare l&#39;e nanoparticelleXplained nella sezione 3.1.2. I campioni di controllo non vengono incubati con nanoparticelle. </li><li> Dopo 24 ore di incubazione seguire il passo 3.2.3. </li><li> Posizionare i 3 piatti sperimentali Petri sotto la lampada (coperchio aperto) e rimuovere uno a 20 minuti, uno a 40 minuti e uno a 60 min. Questo produce tre campioni che sono stati esposti a dosi di luce di 60, 120 e 180 J / cm 2, rispettivamente (calcolo nella sezione 3.2.4). Successivamente, somministrare una 180 J / cm 2 dosaggio luce per uno dei piatti Petri di controllo. Questo è il controllo con dose di luce applicata in assenza di nanoparticelle. Non applicare una quantità di luce per il campione di controllo rimanente (senza nanoparticelle e nessuna dose di luce applicato). </li><li> Sostituire il HBSS con i media DMEM supplementato con il 10% FBS e mantenere le capsule di Petri nell&#39;incubatrice per 4 ore. </li><li> Macchiare le cellule nel sperimentale e le piastre di Petri di controllo con 20 ml di annessina V FITC incubando le cellule con il colorante per 15 min. Lavare due volte con DPBS. Colorare il cells con 300 Nm DAPI nonché 300 nm PI (ioduro di propidio) incubando con i coloranti per 2 min. Lavare due volte con DPBS. Poi mantenere le cellule in DPBS per l&#39;imaging. </li></ol></li></ol> 4. intrinseca citotossicità di nanoparticelle <ol><li> Il conteggio delle cellule e di coltura in piastre da 96 pozzetti <ol><li> Raccogliere le cellule dalla cultura palloni rimuovendo media e lavare le cellule due volte con DPBS seguita da incubazione delle cellule con 0,05% tripsina per 10 min. Aggiungere 2 ml supporti DMEM supplementato con 10% FBS alla soluzione cellulare risultante. Mescolare la soluzione corretta per separare gruppi di cellule in canottiere. </li><li> Prendete 100 ml di sospensione cellulare e aggiungere 900 microlitri per i media DMEM supplementato con il 10% FBS. Mescolare bene. Trasferire 10 ml di questa sospensione su un emocitometro. Contare le cellule utilizzando l&#39;emocitometro e regolare la concentrazione della sospensione di cellule in 4.1.1 a 5 x 10 4 cellule / ml. </li><li> Take 5 piastre a 96 pozzetti etichettati come 0 h, 24 hR, 48 ore, 72 ore e 96 ore. Aggiungere 50 ml di i 5 x 10 4 cellule / ml soluzioni cellulari (TE 71 e A549) nei pozzetti come mostrato nella Tabella 2, la semina così 2.500 cellule / pozzetto. Fate lo stesso procedimento per linee cellulari OVCAR3 e MDA-MB-231. </li><li> Dopo 24 ore lavare i pozzetti con 1x DPBS e aggiungere 50 microlitri di concentrazioni crescenti di nanoparticelle nei pozzetti come mostrato nella Tabella 2. Preparare diverse concentrazioni di nanoparticelle aggiungendo 20, 100, e 180 microlitri di sospensione nanoparticelle da 2.4.2 a DMEM a ottenere un volume finale di 2 ml, che produce concentrazioni di nanoparticelle di 0,4 x 10 -4 mg / ml, 2,0 x 10 -4 mg / ml e 3,6 x 10 -4 mg / ml, rispettivamente. Ogni linea cellulare è triplicato per ciascuna concentrazione di nanoparticelle. </li></ol></li><li> Misurazione della vitalità cellulare nel buio <ol><li> Aggiungere 10 microlitri MTT alla piastra 0 ore subito dopo l&#39;aggiunta di nanoparticelle. Incubare la piastra per 4 ore per cryst formazanoals per formare. Aggiungere la soluzione solubilizzazione 50 microlitri nei pozzetti. Incubare la piastra per 6 ore per sciogliere i cristalli di formazano. </li><li> Misurare la vitalità cellulare della piastra 0 ora registrando l&#39;assorbanza a 570 nm con lettore di piastre. </li><li> Per 24 ore piatto, lavare le cellule con 1x DPBS e aggiungere 50 microlitri dei media in ogni incubazione bene dopo 24 ore con le nanoparticelle. Aggiungere MTT e leggere il piatto come spiegato in 4.2.1 e 4.2.2. </li><li> Per 48 ore, 72 ore, e 96 lastre hr, lavare le cellule con 1x DPBS e aggiungere 50 microlitri supporti nei pozzetti dopo 24 ore di incubazione con le nanoparticelle. Incubare le cellule per i periodi di tempo rimanenti. </li><li> 4.2.5) Misurare la vitalità cellulare in particolari momenti come spiegato in 4.2.1 e 4.2.2. </li><li> Ripetere l&#39;esperimento completo per 3 volte (n = 3) </li></ol></li></ol> 5. misurare la vitalità cellulare dopo PDT <ol><li> Contare le cellule e coltura in piastre da 96 pozzetti. <ol><li> Etichettare una serie di 96 pozzetti come indicato nella tabella 3, sia per i TE 71 piastre + A549 e OVCAR3 + MDA-MB-231 piatti. La disposizione delle piastre sarà uguale a quello mostrato in 4.1.3. </li><li> Seme le piastre a 96 pozzetti come spiegato nel paragrafo 4.1 con lo stesso layout come mostrato nella tabella 2 alla sezione 4.1.2. </li><li> Dopo 24 ore aggiungere nanoparticelle alle piastre come spiegato in 4.1.4. </li><li> 24 ore dopo l&#39;aggiunta di nanoparticelle lavare le cellule con 1x DPBS e aggiungere 50 microlitri HBSS in ciascun pozzetto. </li><li> Irradiare le piastre con le rispettive dosi di luce come spiegato in 3.2.3. </li><li> Sostituire il HBSS con 50 microlitri i media DMEM supplementato con il 10% FBS e incubare le piastre per i rispettivi periodi di tempo dopo la PDT. </li><li> Dopo ogni periodo di tempo misurare la vitalità cellulare come spiegato in 4.2.1 e 4.2.2. </li></ol></li></ol> 6. microscopia a fluorescenza <ol><li> Assorbimento di nanoparticelle <ol><li> Accendere le luci del microscopio unnd laser 30 minuti prima di imaging. Mettere la capsula di Petri contenente le cellule fisse (come spiegato nella sezione 3.1) sul palco del microscopio. </li><li> Raccogliere la fluorescenza da nanoparticelle e DAPI utilizzando i filtri, come illustrato nella tabella 4. Sovrapporre la fase di contrasto, nanoparticelle e le immagini DAPI nel software ImageJ. </li></ol></li><li> Rilevamento di ROS <ol><li> Accendere le lampade del microscopio 30 min prima di imaging. Mettere la capsula di Petri contenente le cellule (come spiegato nella sezione 3.2) sul palco del microscopio. </li><li> Raccogliere la fluorescenza da nanoparticelle, DAPI, e il ROS rilevamento reattivo utilizzando i filtri, come illustrato nella tabella 4. Sovrapporre il contrasto di fase, nanoparticelle, DAPI e ROS rilevamento immagini reagenti nel software ImageJ. </li></ol></li><li> Apoptosi e necrosi da PI e annessina V FITC <ol><li> Accendere le lampade del microscopio 30 min prima di imaging. Mettere la piastra di Petri contenente le cellule (come spiegato insezione 3.3) sul palco del microscopio. </li><li> Raccogliere la fluorescenza da nanoparticelle, DAPI, PI, e annessina V FITC utilizzando i filtri, come illustrato nella tabella 4. Sovrapporre il contrasto di fase, nanoparticelle, DAPI, PI e immagini annessina V FITC nel software ImageJ. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per ottenere nanoparticelle assorbimento era necessario mantenere alcune misure critiche mentre fabbricare nanoparticelle. A 10 -6 M soluzione MEH-PPV (miscelato con il 50% in peso PCBM) in THF era disposto per iniettare in acqua DI, come è stato osservato che la concentrazione di questa soluzione ha un ruolo importante nel determinare le dimensioni di nanoparticelle in formazione. Concentrazione è stata verificata mediante spettroscopia UV-vis. Si noti che nel passaggio 2.1.3 protocollo era necessario diluir...

In Terapia fotodinamica (PDT) fotosensibilizzanti vengono somministrati al tessuto bersaglio, e in seguito all&#39;esposizione alla luce il fotosensibilizzante genera specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS). Specie ROS come l&#39;ossigeno singoletto e superossido possono indurre lo stress ossidativo e la conseguente danno strutturale alle cellule e tessuti 1-4. Grazie alla sua facilità di applicazione questo metodo è stato attivamente indagato e gli studi clinici hanno avuto luogo 5,6. Tuttavia, le questioni rilevanti quali la tossicità scuro dei sensibilizzanti, la sensibilità del paziente alla luce (a causa della distribuzione non selettiva della sensibilizzante), e idrofobicità dei sensibilizzanti (che porta a ridurre la biodisponibilità e la potenziale tossicità acuta) rimangono. Qui riportiamo un metodo per la fabbricazione e la valutazione in vitro di condurre nanoparticelle polimeriche miscelati con fullerene come fotosensibilizzatori prossima generazione per PDT. Le nanoparticelle sono formate da auto-aggregazione diil polimero semiconduttore MEH-PPV (poli [2-metossi-5- (2-etilesilossi) -1,4-phenylenevinylene]) con il PCBM fullerene (fenil-C 61 -butyric metil estere) quando questi materiali sciolti in un compatibile solvente stanno rapidamente iniettati in un solvente non compatibile (Figura 1A). La scelta di MEH-PPV come il polimero host è motivata dal suo elevato coefficiente di estinzione che porta ad alti tassi di formazione tripletta, e sia efficiente e ultraveloce carica e trasferimento di energia al PCBM fullerene 7. Queste proprietà sono ideali per la sensibilizzazione di ossigeno singoletto e formazione superossido in PDT. Fullerene è stato infatti applicato nel PDT sia in forma molecolare e nanoparticelle 8-13. Tuttavia, una grave citotossicità ha ostacolato un ulteriore sviluppo 12. Qui mostriamo che incapsulando il fullerene in una matrice serie di MEH-PPV cedere compositi nanoparticelle MEH-PPV / PCBM risultati in un materiale sensibilizzare PDT che hoNon è citotossico intrinsecamente, mostra specificità verso le cellule tumorali a causa delle dimensioni delle nanoparticelle e carica di superficie, e le rese di trattamento altamente efficace PDT a dosi di luce scarsa a causa delle proprietà fotofisiche di cui sopra.

<table><tbody><tr><td>Poli[2-metossi-5-(2-etilesilossi)-1,4-fenilenvinilene] (MEH-PPV)</td><td>Sigma Aidrich</td><td>536512-1G</td><td>medio Mn&nbsp; 150.000-250.000</td></tr><tr><td>[6,6]-fenile C61&nbsp; estere metilico dell'acido butirrico (PCBM)</td><td>Sigma Aidrich</td><td>684449-500MG</td>><td>99,5%</td></tr><tr><td>Tetraidrofurano (THF)</td><td>EMD</td><td>TX0284-6</td><td>Siringa Drisolv</td></tr><tr><td>da 1 ml</td> National <td>Scientific Company</td><td>37510-1</td><td>Per la filtrazione della soluzione MEH-PPV</td></tr><tr><td>Filtro per siringa</td><td>VWR</td><td>28145-495</td><td>25 mm, 0,2 &micro; m, Siringa in PTFE</td></tr><tr><td>da 1 ml</td><td>Hamilton Company</td><td>81320</td><td>Per l'iniezione di soluzione MEH-PPV in acqua per produrre nanoparticelle</td></tr><tr><td>Modifica di Dulbecco della miscela Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 (DMEM)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-350</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank senza rosso fenolo (HBSS)</td><td>Quality Biological (VWR)</td><td>10128-740</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, 1x senza calcio e magnesio (DPBS)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-436</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, regolare (inattivato dal calore) (FBS)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-736</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 1x 0,25%</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-664</td><td>Tripsina/2,21 mM EDTA in HBSS senza bicarbonato di sodio, calcio e magnesio Testato per il parvovirus suino</td></tr><tr><td>16% Paraformaldeide</td><td>Scienze della microscopia elettronica&nbsp;</td><td>15710</td><td>Il 16% di paraformaldeide viene diluito al 4% aggiungendo PBS</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>&nbsp; Biotium VWR</td><td>89139-054</td><td>Colorazione nucleare</td></tr><tr><td>Pipette da 5 ml</td><td>VWR</td><td>82050-478</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 pallone di coltura</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td>per colture cellulari</td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti</td><td>VWR</td><td>82050-771</td><td>per saggi MTT</td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali con sfiati</td><td>Greiner Bio-One (VWR)</td><td>82050-538</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Sonde molecolari</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V FITC</td><td>Invitrogen</td><td>A13199</td><td>colorante per l'apoptosi</td></tr><tr><td>Celltiter 96 saggi non-R 1000</td><td>Promega (VWR)</td><td><a href="https://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?catalog_number=PAG4000">PAG4000</a></td><td>MTT</td></tr><tr><td>CellROX Green Reagent, per la rilevazione dello stress ossidativo</td><td>Invitrogen</td><td>C10444</td><td>per ROS spettrometro</td></tr><tr><td>UV-vis</td> di rivelazione, <td>Agilent 8453</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>spettrometro a fluorescenza</td>, <td>NanoLog HoribaJobin, Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr>, PD2000DLS<td>di diffusione dinamica della luce</td><td>, rivelatore</td><td></td><td></td>di precisione,</tr><tr><td>incubatore</td>, <td>NuAir DH, Autoflow</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>microscopio confocale</td>, <td>Zeiss Axioskop2</td><td></td><td>63X, lente dell'obiettivo a immersione in olio</td></tr><tr><td>Microscopio a epiluminescenza</td><td>Olympus IX71</td><td></td><td>60X obiettivo a immersione in acqua, fotocamera Andor Zyla sCMOS</td></tr><tr><td>Simulatore solare</td><td>Newport 67005 Oriel Instruments Cella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>solare di riferimento</td><td>Oriel&nbsp;</td><td></td><td>VLSI Standards Incorporated</td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>Emocitometro BioTek Ex808</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hausser Scientific Partnership</td><td>3200</td><td>Per il conteggio delle cellule</td></tr></tbody></table>

terapia fotodinamica con blended condurre polimero / fullerene nanoparticelle fotosensibilizzanti

Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers

In questo articolo viene riportato un metodo per la fabbricazione e la valutazione riproducibile in vitro di nanoparticelle polimeriche conduttrici miscelate con fullerene come fotosensibilizzatori di nuova generazione per la Terapia Fotodinamica (PDT). Le nanoparticelle sono formate dall'interazione idrofobica del polimero semiconduttore MEH-PPV (poli[2-metossi-5-(2-etilesilossi)-1,4-fenilevinilene]) con il fullerene PCBM (estere metilico dell'acido fenil-C61-butirrico) in presenza di un solvente non compatibile. MEH-PPV ha un alto coefficiente di estinzione che porta ad alti tassi di formazione di triplette e a un efficiente trasferimento di carica ed energia al PCBM del fullerene. Questi ultimi processi migliorano l'efficienza del sistema PDT attraverso la formazione di triplette e radicali assistiti da fullerene e la disattivazione ultrarapida di MEH-PPV eccitato. I risultati qui riportati mostrano che questo sistema di sensibilizzazione PDT a nanoparticelle è altamente efficace e mostra una specificità inaspettata per le linee cellulari tumorali.

Assorbimento e citotossicità intrinseca di nanoparticelle Il 50% in peso di blended nanoparticelle MEH-PPV / PCBM sono state incubate con TE 71, MDA-MB-231, A549 e linee cellulari OVCAR3. Il livello PCBM fusione è stato scelto come il 50% in peso PCBM, che ha dimostrato di fornire carica e trasferimento di energia proprietà ideali tra polimeri coniugati e fullereni 14. Immagini di fluorescenza di nanoparticelle assorbimento sono mostrati in figura 1B. Le cellule s...

Questo protocollo descrive un metodo per la fabbricazione di nanoparticelle polimeriche conduttrici miscelate con fullerene. Queste nanoparticelle sono state studiate per il loro potenziale utilizzo come fotosensibilizzatori di nuova generazione per la terapia fotodinamica (PDT).

Terapia fotodinamica con Blended Condurre Polimero / Fullerene nanoparticelle fotosensibilizzanti

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è sviluppare un fotosensibilizzatore di nuova generazione per l'applicazione della terapia fotodinamica o PDT nel trattamento del cancro. Questo risultato si ottiene adattando un metodo di precipitazione per la fabbricazione di nanoparticelle polimeriche conduttive disperdibili in acqua. Come secondo passaggio, le nanoparticelle vengono incubate con cellule tumorali in vitro, seguite da un trattamento con luce per generare specie reattive dell'ossigeno o ROS, che sono i radicali attivi coinvolti nella PDT.L'efficacia del trattamento successivo viene valutata mediante saggi quantitativi e analisi qualitativa mediante imaging per determinare le frazioni di cellule vive rispetto a quelle morte nel popolamento cellulare. I risultati mostrano che tumori aggressivi come il carcinoma ovarico, modellati qui da OAR tre abbondantemente, internalizzano il fotosensibilizzatore nanoparticellato descritto in questo lavoro e che il trattamento con terapia fotodinamica (PDT) risulta altamente efficace in vitro. In questo caso, l'efficacia della PDT è direttamente correlata alla quantità di nanoparticelle internalizzate dalle diverse linee cellulari.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come chemioterapia, radioterapia e chirurgia è che il trattamento può essere mirato specificamente al sito della malattia, riducendo così gli effetti collaterali. Il materiale attivo utilizzato non mostra citotossicità in vitro e ulteriori sviluppi renderanno il sistema di nanomateriali più specifico nei confronti del sito tDCS. Iniziare questa procedura con la coltura delle linee cellulari e la preparazione della soluzione madre di M-E-H-P-P-V come descritto nel protocollo testuale. Aggiungere 50 microlitri della soluzione madre di M-E-H-P-P-V non diluita in tre millilitri di TETRAHEDRAN o THF.Etichettare questa soluzione come soluzione madre diluita di M-E-H-P-P-V, trasferirla in una cuvetta di quarzo da un centimetro e misurare l'assorbanza a 495 nanometri mediante spettroscopia ultravioletta-visibile. Se l'assorbanza della soluzione madre diluita di M-E-H-P-P-V è superiore a 0,17, diluire la soluzione madre non diluita di M-E-H-P-P-V aggiungendo ulteriore THF, un millilitro alla volta, finché l'assorbanza misurata a 495 nanometri rientra nell'intervallo compreso tra 0,13 e 0,17. Successivamente, preparare le nanoparticelle mediante metodo di precipitazione trasferendo un millilitro di una soluzione miscelata di M-E-H-P-P-V-P-C-B-M in una siringa da un millilitro munita di ago. Rapidamente.Iniettare un millilitro della soluzione M-E-H-P-P-V-P-C-V-M omogeneizzata in quattro millilitri di acqua deionizzata, mescolando a 1200 giri al minuto, fermando immediatamente dopo l'iniezione. Utilizzare queste nanoparticelle senza ulteriori trattamenti per eseguire la PDT su cellule incubate con nanoparticelle. Etichettare innanzitutto un set di piastre a 96 pozzetti come indicato nel protocollo testuale.Quindi raccogliere le cellule dai flaconi di coltura rimuovendo il mezzo e lavando le cellule due volte con soluzione salina tamponata al fosfato di docos o DPBS, seguito dall'incubazione delle cellule con 0,05% di tripsina per 10 minuti a due millilitri di mezzo di Eagle modificato con delcos integrato con 10% di siero bovino fetale alla soluzione cellulare risultante. Mescolare adeguatamente la soluzione per separare i cluster cellulari in singoletti. Prelevare 100 microlitri della sospensione cellulare e aggiungere a 900 microlitri di DMEM integrato con 10% di FBS, mescolare bene e posizionare 10 microlitri di questa sospensione su un emocitometro.Contare le cellule utilizzando l'emocitometro e regolare la concentrazione della sospensione cellulare a 50.000 cellule per millilitro. Successivamente, seminare la piastra a 96 pozzetti aggiungendo 50 microlitri della soluzione cellulare nei pozzetti, in modo da seminare 2.500 cellule per pozzetto. In seguito, preparare diverse concentrazioni di nanoparticelle aggiungendo 2100 e 180 microlitri della sospensione di nanoparticelle preparata al DMEM per ottenere un volume finale di due millilitri.Dopo 24 ore, lavare le pozzette con una X-D-P-B-S e aggiungere 50 microlitri di concentrazioni crescenti di nanoparticelle nelle pozzette. Ogni linea cellulare presenta tre replicati per ciascuna concentrazione di nanoparticelle. 24 ore dopo l'aggiunta delle nanoparticelle.Lavare le cellule con un X-D-P-B-S e aggiungere 50 microlitri di soluzione salina equilibrata di Hank o HBSS in ogni pozzetto, per irradiare le cellule riscaldare la lampada del simulatore solare per 15 minuti. Posizionare un filtro UV davanti alla lampada per eliminare la luce UV. Calibrare la lampada utilizzando una cella solare di riferimento, regolando la potenza della lampada in modo da ottenere un'intensità di 0,5 sun sulla superficie della piastra a 96 pozzetti qui.Questa condizione è stata raggiunta con una potenza di 218 watt fornita alla lampada. Posizionare la piastra a 96 pozzetti sotto la lampada con il coperchio aperto e irradiare le cellule per 60 minuti, ottenendo una dose di luce di 180 joule per centimetro quadrato dopo la radiazione. Sostituire l'HBSS con 50 microlitri di DMEM, integrato con il 10% di FBS, e incubare le piastre per i rispettivi periodi di tempo successivi alla terapia fotodinamica.Dopo ogni periodo di tempo, misurare la vitalità cellulare aggiungendo 10 microlitri di MTT nel pozzetto. Incubare la piastra per quattro ore affinché si formino i cristalli. Quindi aggiungere 50 microlitri della soluzione solubilizzante nei pozzetti e incubare la piastra per sei ore.Per sciogliere i cristalli di fosfato. Misurare la vitalità cellulare registrando l'assorbanza a 570 nanometri con un lettore per micropiastre per valutare la citotossicità intrinseca delle nanoparticelle. Leggere la piastra a 96 pozzetti senza applicare la terapia fotodinamica per misurare l'assorbimento delle nanoparticelle.Rilevamento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) formate dopo la PDT e rilevamento dell'apoptosi e della necrosi dopo la PDT. Accendere prima le lampade del microscopio e il laser, 30 minuti prima dell'acquisizione delle immagini. Posizionare la piastra di Petri contenente le cellule fissate sul portacampioni del microscopio.Raccogliere la fluorescenza proveniente dalle nanoparticelle. Reagente rivelatore RROS propidio ioduro. Un XIN cinque fitsi e DPI sovrappongono le immagini a contrasto di fase e le immagini di fluorescenza in ImageJ. Software risultati rappresentativi dopo l'incubazione delle nanoparticelle con diverse linee cellulari sono mostrati qui.La linea cellulare Ocar mostra il maggior uptake, seguita da 5 49 e MDA MB 2 31. La TE 71 non mostra alcuna fluorescenza dei nanoparticelle. Le misurazioni della vitalità cellulare su queste linee cellulari, effettuate in condizioni di buio, sono mostrate dagli istogrammi qui.Non si verifica quasi alcuna morte cellulare fino a 96 ore in nessuna delle linee cellulari. La formazione di ROS rilevata tramite il reagente rivelatore di ROS è mostrata qui per la linea cellulare car three. In questo campione di controllo.Non c'è fluorescenza verde poiché non ci sono nanoparticelle né dose di luce. Tuttavia, quando sia le nanoparticelle che la dose di luce vengono somministrate alle cellule immediatamente dopo la PDT, si può osservare una intensa fluorescenza verde dal reagente rivelatore di R os. La vitalità cellulare dopo la DT è mostrata qui nel grafico a barre per diverse dosi di nanoparticelle.I risultati dell'esperimento di doppia colorazione vitale sono mostrati qui, in cui la linea cellulare car three subisce necrosi a dose elevata di luce, mentre a basse dosi luminose le cellule subiscono morte apoptotica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come fabbricare nanoparticelle composite di polimeri conduttivi per l'applicazione nei trattamenti di malattie basati sulla terapia fotodinamica.

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Chimica

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Saggio di fototossicità in vitro: un metodo basato sulla PDT per valutare il potenziale fototossico di un fotosensibilizzatore nelle cellule di cancro del polmone

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