Photopatterning proteine ​​e cellule in acquosa ambiente utilizzando TiO 2 Fotocatalisi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di eseguire la modifica della superficie di un'impalcatura di coltura cellulare utilizzando l'attività fotocatalitica del biossido di titanio. Ciò si ottiene depositando un sottile strato di biossido di titanio su un vetrino di vetro, e quindi rivestendolo con un'Octa dessalina per rendere l'intera superficie idrofobica. In una seconda fase, il substrato viene bloccato immergendolo in coltura cellulare, terreno contenente albumina sierica.

L'albumina viene assorbita dalla superficie e la rende non permissiva all'adesione cellulare. Successivamente, il campione viene trasferito in una soluzione acquosa contenente collagene e una luce UV focalizzata viene quindi utilizzata per irradiare la superficie. Ciò consente alle molecole di collagene di assorbire selettivamente la regione fotoirradiata e rende la regione permissiva all'adesione cellulare.

Questo processo può essere ripetuto per modellare più proteine o tipi di cellule. In questo video mostriamo come la regione adesiva delle celle PC 12 possa essere modificata selettivamente tramite l'irradiazione UV. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando ci siamo resi conto che la fotocatalisi del biossido titanico viene applicata commercialmente come finestre di vetro autopulenti che rimuovono i contaminanti organici nella superficie in seguito alla radiazione luminosa, dimostrando che la procedura sarà co-responsabile alla ricerca di uno studente laureato dal mio laboratorio.

Inizia numerando i vetrini di copertura utilizzando un tracciatore a diamante in modo da garantire che il lato corretto del campione sia rivolto verso l'alto. Pulire quindi i vetrini coprioggetti prima sotto l'acqua corrente a doppia distillazione, quindi immergendoli in soluzione di piranha per 10 minuti. Dopo 10 minuti, sciacquare il coperchio, infilarlo otto volte in acqua doppia distillata e asciugarli sotto flusso di azoto.

Quindi, impostare un bersaglio di ossido di titanio in un sistema di sputtering a radiofrequenza, quindi fissare i vetrini copricampione puliti sul supporto del campione utilizzando un nastro di poliammide, posizionare il supporto del campione nella camera di sputtering ed evacuare la camera fino a quando la pressione raggiunge 2,0 volte 10 al meno quarto pascal. Successivamente, introdurre il gas argon nella camera e impostare la pressione di deposizione a 4,0 millitar mantenendo l'otturatore chiuso. Aumentare gradualmente la potenza RF a 70 watt.

Quindi aprire l'otturatore e farfugliare per 15 minuti Per ottenere una pellicola con uno spessore da 120 a 150 nanometri. Inizia asciugando un bicchiere di vetro e una pinza in forno a 120 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, posizionare i vetrini di copertura in un reattore al plasma e trattare la superficie del biossido di titanio con plasma di ossigeno per cinque minuti a 200 watt con un flusso di ossigeno di 100 centimetri cubi standard al minuto per creare una superficie più idrofila.

Quindi rimuovere i campioni e immergerli in acqua distillata doppia per confermare che la superficie sia super idrofila e asciugare accuratamente la superficie sotto il flusso di azoto. Quindi, spostare i campioni, il becher essiccato e la pinza in un sacchetto per guanti riempito di azoto e preparare una soluzione millimolare di Octo desal tricloroetilene disciolto in toluene. Immergere il campione nella soluzione per un'ora a temperatura ambiente per formare un monostrato autoassemblato sopra l'ossido di titanio.

Quindi rimuovere eventuali molecole di fasoria fornicando il campione in toluene, acetone, etanolo. E infine, acqua distillata due volte per cinque minuti ciascuna. Quindi sciacquare il campione quattro volte in acqua fresca a doppia distillazione e asciugare la superficie sotto il flusso di azoto.

Sterilizzare i vetrini coprioggetto rivestiti immergendo i campioni in etanolo al 70% per cinque minuti. Quindi sciacquare i campioni due volte in acqua sterile a doppia distillazione. Quindi, posizionare il campione in un piatto da 35 millimetri e aggiungere due millilitri di terreno di coltura PC 12.

Incubare i campioni per almeno tre ore in un incubatore tamponato con CO2 a 37 gradi Celsius mentre l'albumina sierica nel terreno viene assorbita sulla superficie dei vetrini coprioggetti durante l'attesa. Impostare il microscopio a fluorescenza invertito accendendo prima la lampada ad arco. Quindi inserire il cubo del filtro UV e ruotare la lente dell'obiettivo su una con ingrandimento 20x.

Misurare l'intensità della luce con un misuratore di intensità UV e calcolare il tempo di irradiazione per una dose di 200 joule per centimetro quadrato. Quindi, utilizzare un micrometro da stadio e impostare il diametro della regione da irradiare a 200 micron regolando il diaframma di campo. Dopo l'incubazione di tre ore, integrare il terreno che copre i vetrini coprioggetti con 200 microlitri di 3,0 milligrammi per millilitro di collagene di tipo quattro.

Quindi trasferire il piatto da 35 millimetri sul tavolino del microscopio e mettere a fuoco il microscopio sulla superficie del campione utilizzando i segni di graffio. Irradiare un'area del vetrino coprioggetto con luce UV alla dose di 200 joule per centimetro quadrato. Quindi sostituire il terreno con due millilitri di crescita fresca, il terreno con NGF e senza collagene di tipo quattro e riposizionare il campione nell'incubatore.

Raccogliere le cellule di PC 12 differenziate NGF in coltura in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare la provetta a 150 volte G per quattro minuti. Quindi aspirare il surnatante e aggiungere un millilitro di terreno di coltura. Resus risospendere le cellule pipettando delicatamente su e giù utilizzando un emocitometro.

Contare la densità cellulare e aggiungere 3,0 volte 10 alla quinta cella in un piatto da 35 millimetri contenente i vetrini di copertura modificati. Incubare la capsula per uno o due giorni in un incubatore al 5% di CO2 a 37 gradi Celsius dopo uno o due giorni di coltura sulla superficie XC due modificata. Utilizzare un microscopio per confermare che le cellule si attaccano e crescono solo sulla regione irradiata dai raggi UV dei vetrini.

Quindi aggiungere 67 microlitri di collagene di tipo quattro al piatto con le cellule coltivate in modo che la concentrazione finale di collagene sia di 100 microgrammi per millilitro con il microscopio impostato per la modellazione della superficie. Posizionare la capsula sul tavolino del microscopio e posizionare la regione di irradiazione adiacente alla posizione attuale della cella. Irradiare il vetrino portaoggetti con luce UV alla dose di 200 joule per centimetro quadrato.

Dopo l'irradiazione, sostituire il terreno con uno privo di collagene e riposizionare il campione nell'incubatore cercando di completare l'elaborazione di un singolo campione entro 30 minuti. Questa è un'immagine al microscopio elettronico a scansione in sezione trasversale del film di biossido di titanio depositato per polverizzazione catodica . Dall'osservazione, lo spessore del film è stato stimato in circa 150 nanometri.

Si nota anche la planarità del film di biossido di titanio depositato. Ulteriori analisi al microscopio a forza atomica hanno rivelato che la rugosità quadratica media della superficie era di soli 0,2 nanometri. Il collagene di tipo quattro e la soluzione vengono assorbiti preferenzialmente nella regione irradiata dai raggi UV dove l'albumina viene spostata dal laser.

Per dimostrare la versatilità di questo approccio, anche altre proteine come la fibrina sono state modellate utilizzando la stessa tecnica. Qui le cellule crescono sulla regione con due motivi XC del vetrino coprioggetti e proprio accanto a loro nell'area definita dalla linea tratteggiata. Il vetrino coprioggetto è stato recentemente irradiato con raggi UV in situ due e rivestito con collagene di tipo quattro.

Nei cinque giorni successivi, le cellule proliferano e migrano per coprire la regione appena codificata. La procedura qui presentata può essere impiegata per manipolare arbitrariamente le cellule in coltura e potenzialmente per modellare più tipi di cellule per costruire elaborati sistemi di co-coltura a freddo.