Photopatterning proteine e cellule in acquosa ambiente utilizzando TiO
26 ottobre 2015
Descriviamo un protocollo per modificare l'affinità cellulare di una superficie di scaffold in ambiente acquoso. Il metodo sfrutta la fotocatalisi del biossido di titanio per decomporre il film organico nella regione foto-irradiata. Mostriamo che può essere utilizzato per creare microdomini di proteine di impalcatura, sia ex situ che in situ.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è eseguire una modifica superficiale di un impalcatura per coltura cellulare sfruttando l'attività fotocatalitica del biossido di titanio. Questo viene ottenuto depositando uno strato sottile di biossido di titanio su un coprioggetto di vetro, per poi rivestirlo con un ottadecilsilano al fine di rendere l'intera superficie idrofobica. Come secondo passaggio, il substrato viene bloccato immergendolo in un mezzo di coltura cellulare contenente albumina sierica.
L'albumina assorbe sulla superficie e la rende non permissiva all'adesione cellulare. Successivamente, il campione viene trasferito in una soluzione acquosa contenente collagene e viene utilizzata una luce UV focalizzata per irradiare la superficie. Questo consente alle molecole di collagene di assorbirsi selettivamente sulla regione irradiata fotochimicamente, rendendo tale area permissiva all'adesione cellulare.
Questo processo può essere ripetuto al fine di ottenere un pattern di molteplici proteine o tipi cellulari. In questo video mostriamo come la regione adesiva delle cellule PC 12 possa essere modificata selettivamente mediante irradiazione UV. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo realizzato che la fotocatalisi del biossido di titanio viene applicata commercialmente per produrre vetri autolavanti, in grado di rimuovere contaminanti organici dalla superficie grazie all'irraggiamento luminoso, dimostrando che la procedura sarà di interesse per un laureando del mio laboratorio.
Iniziare numerando i vetrini con un punterello al diamante in modo da garantire che il lato corretto del campione sia rivolto verso l'alto. Successivamente, pulire i vetrini prima sotto acqua bidistillata in corso, quindi immergendoli in soluzione piranha per 10 minuti. Trascorsi 10 minuti, risciacquare i vetrini otto volte in acqua bidistillata ed essiccarli sotto flusso di azoto.
Successivamente, posizionare un bersaglio di ossido di titanio in un sistema di sputtering a radiofrequenza, quindi fissare i vetrini puliti sul portacampioni utilizzando un nastro di poliammide, inserire il portacampioni nella camera di sputtering ed evacuare la camera fino a quando la pressione raggiunge 2,0 × 10⁻⁴ pascals. Successivamente, introdurre gas argon nella camera e impostare la pressione di deposizione a 4,0 mPa mantenendo chiuso lo shuter. Aumentare gradualmente la potenza RF a 70 watt.
Quindi aprire l'otturatore e sputterizzare per 15 minuti per ottenere un film con uno spessore compreso tra 120 e 150 nanometri. Iniziare asciugando un becher di vetro e le pinzette in un forno a 120 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, inserire i coverslip in un reattore al plasma e trattare la superficie di biossido di titanio con plasma di ossigeno per cinque minuti a 200 watt con un flusso di ossigeno di 100 centimetri cubi standard al minuto per creare una superficie più idrofila.
Quindi rimuovere i campioni e immergerli in acqua doppio distillata per verificare che la superficie sia superidrofila, quindi asciugare completamente la superficie sotto flusso di azoto. Successivamente, trasferire i campioni, il becher asciutto e le pinzette all'interno di un guanto a tenuta stagna riempito di azoto e preparare una soluzione di octodesiltricloroetilene ad una concentrazione di un millimolare, disciolta in toluene. Immergere il campione nella soluzione per un'ora a temperatura ambiente per formare un monolayer autoassemblato sulla superficie dell'ossido di titanio.
Quindi rimuovere eventuali molecole di phasor trattando il campione con toluene, acetone ed etanolo. Infine, con acqua bidistillata per cinque minuti ciascuno. Successivamente, risciacquare il campione quattro volte con acqua bidistillata fresca e asciugare la superficie sotto flusso di azoto.
Sterilizzare le lamelle rivestite immergendo i campioni in etanolo al 70% per cinque minuti. Successivamente, risciacquare i campioni due volte in acqua distillata sterile. Poi, posizionare il campione in una piastra da 35 millimetri e aggiungere due millilitri di mezzo di crescita per cellule PC12.
Incubare i campioni per almeno tre ore in un incubatore tamponato con CO2 a 37 gradi Celsius, lasciando che l'albumina sierica nel mezzo aderi alla superficie dei coverslip durante l'attesa. Configurare il microscopio a fluorescenza invertito accendendo innanzitutto la lampada ad arco. Successivamente, inserire il cubo filtro UV e ruotare l'obiettivo su uno con un ingrandimento di 20 x.
Misurare l'intensità della luce con un misuratore di intensità UV e calcolare il tempo di irradiazione per una dose di 200 joule per centimetro quadrato. Successivamente, utilizzare un micrometro dello stage e impostare il diametro della regione da irradiare a 200 micron regolando il diaframma del campo. Dopo l'incubazione di tre ore, integrare il mezzo che ricopre i coprioggetti con 200 microlitri di collagene di tipo quattro a 3,0 milligrammi per millilitro.
Quindi trasferire la piastra da 35 millimetri sul palchetto del microscopio e mettere a fuoco il microscopio sulla superficie del campione utilizzando i segni di graffio. Irradiare un'area del vetrino con luce UV a una dose di 200 joule per centimetro quadrato. Poi sostituire il mezzo con due millilitri di mezzo di crescita fresco, contenente NGF e privo di collagene di tipo quattro, e riposizionare il campione nell'incubatrice.
Raccogliere le cellule PC 12 differenziate con NGF coltivate in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare il tubo a 150 ×g per quattro minuti. Quindi aspirare il soprannatante e aggiungere un millilitro di mezzo di crescita. Ri-sospendere le cellule pipettando delicatamente su e giù con un emocitometro.
Contare la densità cellulare e aggiungere 3,0 × 10⁵ cellule in una piastra da 35 millimetri contenente i coverslip modificati. Incubare la piastra per uno o due giorni in un incubatore con 5% di CO₂ a 37 gradi Celsius, dopo uno o due giorni di coltura sulla superficie modificata XC due. Utilizzare un microscopio per confermare che le cellule si stiano attaccando e crescendo esclusivamente sulla regione irradiata con raggi UV dei coverslip.
Quindi aggiungere 67 microlitri di collagene di tipo IV alla piastra con le cellule coltivate in modo che la concentrazione finale di collagene sia di 100 microgrammi per millilitro con il microscopio impostato per la creazione di motivi superficiali. Posizionare la piastra sullo stage del microscopio e posizionare la regione di irradiazione adiacente alla posizione attuale delle cellule. Irradiare il vetrino con luce UV a una dose di 200 joule per centimetro quadrato.
Dopo l'irradiazione, sostituire il mezzo con uno privo di collagene e riposizionare il campione nell'incubatore, cercando di completare l'elaborazione di un singolo campione entro 30 minuti. Questa è un'immagine al microscopio elettronico a scansione in sezione trasversale del film di biossido di titanio depositato mediante sputtering. Dall'osservazione, lo spessore del film è stato stimato essere di circa 150 nanometri.
È inoltre evidente la planarità del film di biossido di titanio depositato. Un'analisi successiva mediante microscopia a forza atomica ha rivelato che la rugosità quadratica media della superficie era di soli 0,2 nanometri. Il collagene di tipo quattro e la soluzione si assorbono preferenzialmente nella regione irradiata con raggi UV, dove l'albumina viene spostata dal laser.
Per dimostrare la versatilità di questo approccio, altre proteine come la fibrina sono state anch'esse impresse utilizzando la stessa tecnica. Qui le cellule stanno crescendo sulla regione della lamella trattata con il pattern XC due e immediatamente accanto ad esse, nell'area definita dalla linea tratteggiata. La lamella è stata recentemente irradiata con raggi UV in situ due e rivestita con collagene di tipo quattro.
Nel corso dei successivi cinque giorni, le cellule proliferano e migrano per ricoprire la regione appena codificata. La procedura qui presentata può essere utilizzata per manipolare arbitrariamente cellule in coltura e potenzialmente per creare schemi con più tipi di cellule al fine di costruire elaborati sistemi di co-coltura.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per modificare l'affinità cellulare delle superfici di supporti mediante fotocatalisi di biossido di titanio. Il metodo consente la creazione di microdomini per proteine di impalcatura, facilitando l'adesione selettiva delle cellule.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Coltura cellulare
- Modifica della superficie
- Fotocatalisi
Sfondo
- Il biossido di titanio possiede proprietà fotocatalitiche che possono essere sfruttate in applicazioni biologiche.
- Le tecniche di modifica della superficie sono essenziali per migliorare l'adesione cellulare nell'ingegneria dei tessuti.
- La creazione di microdomini può migliorare la funzionalità degli scaffold.
- Comprendere le interazioni delle proteine con le superfici è fondamentale per il comportamento cellulare.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per modificare le superfici dei supporti al fine di controllare l'adesione cellulare.
- Utilizzare la fotocatalisi del biossido di titanio per creare microdomini proteici specifici.
- Dimostrare l'efficacia di questo metodo in condizioni sia ex situ che in situ.
Metodi Utilizzati
- Deposizione di uno strato sottile di biossido di titanio su un coprioggetto di vetro.
- Rivestimento della superficie con Octa dessaline per aumentare l'idrofobicità.
- Blocco della superficie con albumina sierica per prevenire l'adesione iniziale delle cellule.
- Utilizzo di luce UV focalizzata per irradiare la superficie e promuovere l'assorbimento del collagene.
Risultati principali
- Modifica riuscita delle superfici del scaffold per consentire l'adesione selettiva delle cellule.
- Creazione di microdomini di collagene sulla superficie del scaffold.
- Dimostrazione dell'applicabilità del metodo sia in contesti ex situ che in situ.
- Evidenze a sostegno dell'efficacia della fotocatalisi del biossido di titanio in applicazioni biologiche.
Conclusioni
- Il protocollo modifica efficacemente l'affinità cellulare sulle superfici delle impalcature.
- La fotocatalisi del biossido di titanio è un metodo valido per creare microdomini funzionali.
- Questo approccio può potenziare le applicazioni nell'ingegneria tissutale migliorando le prestazioni delle impalcature.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente un controllo spaziale preciso del patterning proteico su superfici di biomateriali mediante attivazione fotocatalitica, supportando la progettazione di microambienti definiti per saggi basati su cellule. Permettendo l'adesione selettiva delle cellule nelle zone irradiate, facilita la costruzione di sistemi di co-coltura riproducibili e la manipolazione subcellulare in condizioni fisiologiche. L'approccio aumenta l'affidabilità predittiva nella fase iniziale della scoperta, fornendo una piattaforma regolabile per analizzare le interazioni cellula-matrice e le risposte fenotipiche in modo risolto spazialmente.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la presentazione localizzata di proteine della matrice extracellulare per valutare le vie di segnalazione mediate da integrine.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale degli obiettivi consentendo la valutazione di interazioni recettore-legante in contesti spazialmente definiti in cellule vive.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia negli studi di interazione con l'obiettivo riducendo la variabilità derivante dall'adesione non specifica tramite blocco della superficie con albumina.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara substrati standardizzati con pattern proteici per lo screening coerente di composti in modelli cellulari neuronali o di altri tipi di cellule aderenti.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità dei saggi definendo zone di adesione discrete, riducendo la variabilità tra pozzetti nei risultati, come la crescita dei neuriti o il flusso di calcio.
- Scalabilità: Consente il riutilizzo delle superfici con pattern in più esperimenti, quando abbinato a un'adeguata pulizia e ri-funzionalizzazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Supporta la modellizzazione rilevante per le malattie consentendo la co-coltura di tipi cellulari distinti (ad esempio, neuroni e glia) in disposizioni spaziali definite per imitare l'architettura tissutale.
- De-risking Meccanicistico: Permette un'indagine progressiva delle interazioni multicellulari nei modelli preclinici controllando i tempi e la localizzazione del deposito proteico.
- Allineamento dei Biomarcatori: Facilita la correlazione tra risposte cellulari localizzate e secrezione o attivazione di biomarcatori risolti spazialmente.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La tecnica si inserisce nel flusso di lavoro di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, in particolare per saggi che richiedono microambienti cellulari controllati. Colma il divario tra lo screening fenotipico e il successivo approfondimento meccanicistico, consentendo un riposizionamento preciso delle cellule rispetto ai segnali biochimici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo ai ricercatori di definire dove e quando vengono presentati i ligandi adesivi, chiarificando gli effetti dipendenti dalla dose e dalla localizzazione.
- Screening: Fornisce output quantitativi e risolti spazialmente, come l'efficienza di adesione o i modelli di migrazione, permettendo il confronto tra diverse condizioni sperimentali.
- Analisi: Genera letture compatibili con l'imaging che supportano l'analisi ad alto contenuto informativo del posizionamento cellulare, della morfologia e dell'attivazione delle vie di segnalazione.
- Ricerca traslazionale: Accresce la rilevanza preclinica costruendo configurazioni cellulari stratificate che riflettono l'organizzazione tissutale in vivo.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta un modulo adattabile di ingegneria delle superfici applicabile in numerosi progetti che studiano le interazioni cellula-materiale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la fiducia nella validazione degli obiettivi riducendo i falsi positivi derivanti dall'adesione eterogenea delle cellule e consentendo una riduzione del rischio meccanicistica delle risposte specifiche per via.
- Valore operativo: Favorisce la riproducibilità attraverso una preparazione standardizzata delle superfici e un patterning proteico controllato dalla dose di raggi UV.
- Valore strategico: Informa le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo relazioni struttura-attività più chiare in contesti cellulari spazialmente definiti.
- Impatto sul portafoglio: Permette un investimento adeguato al rischio su target supportati da dati ottenuti da sistemi di co-coltura policlonali fisiologicamente rilevanti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in tecniche correlate alla fotolitografia, protocolli di sicurezza per radiazioni UV e manipolazione di proteine in condizioni sterili.
- Presuppone l'accesso a sistemi di deposizione per sputtering, apparati di irradiazione UV dotati di misurazione dell'intensità e microscopia invertita per il monitoraggio.
- Necessita della standardizzazione della concentrazione di collagene, della dose di irradiazione e dei tempi di incubazione tra diversi utilizzatori e laboratori.
- Richiede considerazioni di adattamento qualora si estenda ad altre proteine (ad esempio, fibrina, laminina) o tipi cellulari diversi dal PC12.
- È limitato dalla necessità di ambienti acquosi e trasparenza all'UV, il che ne restringe l'uso con certi biomateriali opachi o fotosensibili.
